Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 20-20 (más artículos en esta revista)

La activación microglial de NADPH oxidasa es sinérgica con gliales iNOS expresión inducir la muerte neuronal en: una doble clave mecanismo inflamatorio de la neurodegeneración

BioMed Central
Palwinder Mander (pkm22@cam.ac.uk) [1], Guy Brown C (gcb@mole.bio.cam.ac.uk) [1]
[1] Departamento de Bioquímica de la Universidad de Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge, CB2 1QW, Reino Unido

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Resumen
Antecedentes

La inflamación activados neuroglia se ven en muchas patologías CNS y pueden matar a las neuronas a través de la liberación de mediadores citotóxicos, como el óxido nítrico de NO sintasa inducible (iNOS), y posiblemente superóxido de NADPH oxidasa (NOX). Estamos establecidos para determinar la importancia relativa de estas especies para inducir la muerte neuronal, y para poner a prueba la doble clave hipótesis de que la producción de ambas especies al mismo tiempo se requiere para la muerte neuronal significativa.

Métodos

Primaria co-cerebelar culturas de las neuronas granulares neuroglia y de las ratas, se evaluó el efecto de NO (de la iNOS, a raíz de lipopolisacárido (LPS) y / o adición de citoquinas) o superóxido y el peróxido de hidrógeno (de NOX, a raíz de forbol 12-myristate 13 - Acetato (PMA), análogo de ATP (BzATP), interleuquina-1 β (IL-1 β) o ácido araquidónico (AA), además) en la supervivencia neuronal.

Resultados

Inducción de la iNOS gliales poco causado la muerte neuronal. Del mismo modo, la activación de NOX solos traducido en poco o nada de la muerte neuronal. Sin embargo, si se activó NOX (PMA o por BzATP), en presencia de iNOS (inducido por LPS y el interferón-γ) entonces sustancial retraso en la muerte neuronal se produjeron más de 48 horas, lo que fue impedido por los inhibidores de la iNOS (1400W), NOX (apocynin ) O un peroxinitrito decomposer (FeTPPS). Las neuronas y la neuroglia se encuentran también a la tinción positiva para nitrotirosina (un marcador putativo de peroxinitrito) sólo si los dos iNOS y NOX son activas simultáneamente. Si NOX fue activado por la debilidad de estimuladores (IL-1 β, AA o el prión fibrillogenic péptido PrP106-126) en presencia de iNOS, que causó la proliferación microglial y el retraso en la neurodegeneración más de 6 días, lo que fue impedido por iNOS o inhibidores de NOX, un peroxinitrito Decomposer o un antagonista de los receptores NMDA (MK-801).

Conclusión

Estos resultados sugieren un mecanismo de doble clave, en virtud del cual gliales iNOS o activación microglial NOX solo es relativamente benigno, pero si se activan al mismo tiempo sinérgica en la muerte de neuronas, a través de la generación de peroxinitrito. Este mecanismo puede mediar la respuesta inflamatoria en la neurodegeneración de citoquinas, las bacterias, ATP, arachidonate priones y patológica, en cuyo caso las neuronas pueden estar protegidas por iNOS o inhibidores de NOX, de detritus de NO, superóxido o peroxinitrito.

Antecedentes

Neuroglia (astrocitos y microglia) pueden ser activados en la inflamación CNS muchas patologías, incluyendo infecciosos, isquémicos, inflamatorios y trastornos neurodegenerativos [1, 2]. Gliales puede ser la activación de protección a los anfitriones, ya que puede dar lugar a la eliminación de los desechos de células y la muerte de los patógenos [3]. Sin embargo excesiva o crónica gliales puede matar cerca de activación de las neuronas [4, 5]. Así, la inflamación puede contribuir a muchas patologías CNS incluida la enfermedad de Alzheimer, el Parkinson y enfermedades de la neurona motora, esclerosis múltiple, meningitis, el SIDA, la demencia, los accidentes cerebrovasculares, los traumatismos y el envejecimiento normal del cerebro [6, 7]. Por lo tanto, es importante comprender los mecanismos por los que-inflamatorio activado neuroglia matar neuronas.

Astrocitos y microglia puede ser activado por una serie de factores, incluidos los agentes patógenos y las citoquinas pro-inflamatorias, y puede dar lugar a la posterior muerte de la co-neuronas cultivadas [8, 9]. Astrocitos activados y / o microglia producir una variedad de factores que pueden mediar en la muerte neuronal, incluyendo especies reactivas de oxígeno (ROS) [10, 11], el óxido nítrico [8, 9, 12] y glutamato [8, 13], así como Citoquinas pro-inflamatorias que perpetúan la activación glial, como la interleuquina-1 β (IL-1 β) y el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) [14].

Los efectos neuroprotectores de antioxidantes se han establecido [15] y se cree que se debe a la eliminación de los ROS (como la superóxido), y así como moléculas más tóxicos (como el peroxinitrito) [16]. Hay pruebas de que la NADPH oxidasa se activa en la enfermedad de Alzheimer y demencia SIDA [17 - 19]. La principal fuente de ROS durante la inflamación es NADPH oxidasa [20, 21], aunque otras fuentes puede contribuir también [22, 23]. NADPH oxidasa se expresa principalmente por microglia en el cerebro [21, 24], y produce superóxido (O 2 -) extracelular o dentro de vesículas fagocíticas, a fin de matar a los agentes patógenos. La oxidasa puede ser muy activa por AMP, ATP, el ácido araquidónico, algunas citocinas y quimiocinas [25 - 28]. Superóxido se desglosan principalmente por extracelulares e intracelulares superóxido dismutasa para dar peróxido de hidrógeno (H 2 O 2).

INOS es que normalmente no se expresan en el cerebro, sino que es inducida en astrocitos y microglia por citocinas proinflamatorias y los componentes de patógenos, tales como lipopolisacárido (LPS) / endotoxina de las bacterias Gram-negativas [29]. Una vez expresado iNOS produce alto, sostenido de los niveles de NO que puede, en determinadas condiciones, cerca matar neuronas, incluyendo los mecanismos de inhibición de la respiración mitocondrial y la liberación de glutamato de las neuronas y la neuroglia, con lo excitotoxicity [8]. Sin embargo, estos mecanismos pueden exigir un nivel relativamente alto de NO y / o un nivel relativamente bajo de oxígeno [30, 31]. Un mecanismo alternativo sería que NO a reaccionar con el superóxido (por ejemplo, de la NADPH oxidasa) para producir peroxinitrito (ONOO-), que es potencialmente neurotóxicos más a las neuronas que NO o superóxido [32, 33].

Esto sugiere una doble clave de la hipótesis inflamatoria neurodegeneración cual iNOS expresión o activación de NADPH oxidasa por sí sola es relativamente benigna, pero cuando se combinan juntos, al mismo tiempo, causa neurodegeneración través de peroxinitrito. Anteriormente hemos demostrado que la activación aguda de la NADPH oxidasa en aislados microglia expresar iNOS resultados en la rápida desaparición de NO y produce ONOO - [32]. En el presente trabajo se informe de que la activación microglial de la NADPH oxidasa para producir superóxido es sinérgica con el NO de iNOS en la inducción de la muerte de la co-neuronas cultivadas, mientras que la activación de una de las causas por sí solo poco o nada de la muerte de la co-neuronas cultivadas.

Materiales y métodos
Materiales

Los siguientes materiales fueron comprados en indicaron fuentes: 1400W.dihydrochloride de Alexis (Nottingham, UK); maleato de MK-801, apocynin y FeTPPS (5,10,15,20-Tetrakis (4-sulfonatophenyl) porphyrinato de hierro (III), cloruro ) De Calbiochem (Nottingham, Reino Unido). Todos los demás reactivos fueron ordenados de Sigma (Poole, Inglaterra).

Neuronales-gliales cultura

Cerebelosa de células granulares (CGC) se prepararon las culturas de 7 días de edad ratas Wistar, como se describe en el Bal-Price & Brown, 2001. En pocas palabras, los cachorros fueron anestesiados utilizando 5% de halotano en oxígeno, seguido por decapitación. Cerebros fueron removidos en condiciones estériles y el cerebelo disecados. Meninges y se eliminaron las cerebella disociarse en Versene solución (1:5000, Gibco BRL) y chapada a 0,25 × 10 6 células / cm 2 en 24 y placas (en 500 μ l MEDM) recubierto con 0,001% de poli-L-lisina. Culturas se mantuvieron en MEDM (Gibco BRL) suplementado con 5% de suero de caballo, el 5% de suero fetal de ternera, 38 mM de glucosa, 5 mM HEPES, glutamina 2 mM, 25 mM KCl y 10 μ g / ml de gentamicina. Las células fueron mantenidas a 37 ° C en un ambiente humidificado de 5% CO 2 / 95% de aire y utilizadas para experimentos en 16-18 días in vitro (DIV). Culturas de la CGC de la figura 22 ± 4% ± 2 astrocitos y microglia 1% según la evaluación de inmunocitoquímica, utilizando anticuerpos contra la proteína ácida glial fibrilar (GFA: un marcador de astrocitos) y complementar los receptores-3 (un marcador de microglia), la CGC se identificaron en base De la morfología y en 16-18 DIV 76 ± 5% de las células estaban en la cultura del CGC. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Reino Unido Animales (Procedimientos Científicos) de 1986.

La activación de la neuroglia en cultivos neuronales-gliales

Lipopolisacárido (LPS), un componente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas y el interferón-γ (IFN-γ), una citoquina pro-inflamatoria, son potentes activadores de la neuroglia cuando se administra conjuntamente. Neuronales-gliales culturas fueron tratados con 100 ng / ml LPS (de Salmonella typhimurium) y 10 ng / ml IFN-γ (rata recombinante, Sigma) durante 48 horas (o más, si no indica). Las citocinas proinflamatorias factor de necrosis tumoral-α (TNF-α, 10 ng / ml, rata recombinante, Sigma) y la interleucina-1 β (IL-1 β, 10 ng / ml, rata recombinante, Sigma) también se utiliza en combinación con el IFN - Γ para activar la neuroglia en neuronal-glial culturas (48 horas). Donde la actualidad, los inhibidores se añadieron al mismo tiempo que LPS/IFN- γ.

En algunos experimentos de IL-1 β o ácido araquidónico (AA, 30 μ M) se añadieron a las culturas, así como LPS/IFN- γ. En estos experimentos, la IL-1 β o AA se añadieron 24 horas después de LPS/IFN- Además γ, pero los inhibidores han sido agregadas al mismo tiempo que LPS/IFN- γ. Activadores, inhibidores de la IL-1 y β o AA se añadieron una sola vez y de la muerte neuronal se evaluó 144 horas después de LPS/IFN- Además γ.

En algunos experimentos, la proteína prión o un fragmento de la proteína priónica humana se utilizaron (amablemente proporcionados por David R. Brown, de la Universidad de Bath). Recombinante ratón proteína priónica se expresó en bacterias y purificada mediante un método histidina el etiquetado, tal y como se describe anteriormente [34]. El prión péptido (PrP106-126), en secuencia KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG fue derivado de los residuos de aminoácidos 106-126 de la secuencia de la proteína prión humana, y un codificado secuencia del péptido se utilizó como control; secuencia: NGAKALMGGHGATKVMVGAAA. Proteína prión se utilizó en el 5 μ g / ml y de la proteína priónica péptidos en 225 μ g / ml.

Para activar la NADPH oxidasa, de forbol 12-myristate 13-acetato (PMA, 50 ng / ml) o de benzoilo (benzoil)-ATP (BzATP, 1 mM) se utilizan y se añaden a neuronal-glial culturas ya sea sola o al mismo tiempo Como LPS/IFN- γ.

Enriquecimiento de microglia en cultivos neuronales-gliales

Primaria rata microglia se obtuvieron a partir de cultivos mixtos gliales (astrocitos y microglia). Gliales culturas se prepararon a partir de la cerebral cortices de 7 días de edad ratas Wistar (el mismo cerebro que se utilizan para aislar las neuronas granulares del cerebelo). Meninges fueron retirados de los hemisferios cerebrales y, a continuación, utilizando una solución disociarse de EBSS que contiene 0,3% de BSA, la ADNasa I 0,004% y 0,025% tripsina. Las células se chapada en 0,1 × 10 6 células / cm 2 en 75 cm 2 frascos de cultivo celular (Falcon) recubierto con 0,0005% de poli-L-lisina. Culturas se mantuvieron en MEDM suplementado con 10% de suero fetal de ternera y un 1% de penicilina-estreptomicina. Las células fueron mantenidas a 37 ° C en un ambiente humidificado de 5% CO 2 / 95% de aire.

En confluency, gliales culturas se utilizaron para aislar las células microglial agitando suavemente / explotación de las culturas mixtas gliales a desalojar microglia sueltos a los astrocitos. Medio de la mezcla de culturas gliales, que contiene microglia se ha retirado y se centrifuga (135 g durante 5 minutos). Microglia se re-suspendido en medio condicionado de la CGC y de las culturas añade a neuronal-glial culturas, en algunos experimentos (50, 000 microglia / cm 2). Quince minutos después de la adición de microglia a algunos neuronal-glial culturas, y los inhibidores de γ LPS/IFN- en su caso se sumarse. La muerte neuronal se evaluó 48 horas después de LPS/IFN- Además γ.

Evaluación de la activación glial

La activación de la neuroglia en la neuronales-gliales cultura fue evaluada por tinción NADPH diaforasa y la medición de nitrito en el medio. El óxido nítrico sintasa (NOS) es un NADPH diaforasa, utilizando un cromógeno (nitroblue tetrazolium, NBT), y el NADPH como reductor, diaforasa tinción se utilizó para detectar las células con actividad de NOS. Después del tratamiento (con o sin tratamiento de citoquinas control de la tinción) la gliales neuronales culturas fueron fijadas con paraformaldehído al 4% en buffer fosfato durante 30 minutos a 4 ° C. Después de la fijación, las células fueron incubadas en el 0,3% Tritón X-100 (en buffer fosfato) durante 5 minutos. Las células fueron incubadas durante 2 horas a 37 ° C en el 0,3% Tritón X-100 con 1 mg / ml de NADPH y 0,2 mg / ml NBT. Las células fueron lavadas una vez con el 0,3% Tritón X-100 y luego vistos usando un microscopio de luz invertida (Leica).

Los niveles de nitrito en el medio se mide utilizando la reacción de Griess. En pocas palabras, alícuotas de mediano siguientes tratamientos se tomaron y se centrifuga (8000 g durante 5 minutos). 6 mM HCl se añadió al sobrenadante y luego 1 mM sulfanilamide y 1 mM N-1 (1-naphthyl) etilendiamina (NEDA) se añadieron. Absorbancia a una longitud de onda de 548 nm se midió por el lector de placas (BMG, Fluostar Optima), antes y después de la adición de NEDA. Nitrito de las concentraciones en las muestras se calcula a partir de una curva estándar de nitrito de sodio en MEDM.

Evaluación de la viabilidad celular

La viabilidad de la CGC se evaluó con yoduro de propidio (PI, 2 μ g / ml) y Hoechst 33342 (6 μ g / ml) tinción, utilizando un microscopio de fluorescencia (Axiovert S-100) y los filtros de excitación a 365 nm y de emisión a 420 nm . La celda-impermeable nuclear tinte, PI manchas de los núcleos de las células que han perdido la integridad y la membrana plasmática se consideran necrótico. Utilizando el ADN de células permeables colorante Hoechst 33342, de la morfología nuclear de la CGC se estudió. Neuronales que exhiben núcleos irregulares tinción Hoechst, encogimiento nuclear, condensación de la cromatina y / o nucleares, pero la fragmentación IP negativa fueron clasificados como muestra condensación de la cromatina (CC). Celdas individuales que exhiben tanto CC y tinción PI se incluyeron en los datos PI. Las células fueron contados en tres campos microscópicos en cada pozo (3 pozos por tratamiento) y expresado como porcentaje del número total de neuronas. Cada tratamiento se repitió al menos tres veces.

Evaluación de la proliferación de microglia

La detección de células de microglia utilizando Isolectin IB 4 (de Griffonia simplicifolia), que tiene una fuerte afinidad por microglia, pero no astrocitos. Un Alexa Fluor 488 conjugada de isolectin IB 4 (10 ng / ml) se añadió a las culturas activado con LPS/IFN- γ y tratados con IL-1 β, AA o prión proteína / péptido y se incubaron durante 15 minutos a 37 ° C. Células teñidas (microglia) se visualiza y contados por ver bajo un microscopio de fluorescencia (488 nm de excitación, emisión de 530 nm).

3-nitrotirosina inmunocitoquímica

Mezcla de culturas neuronal-glial fueron teñidas con el peroxinitrito marcador, 3-nitrotirosina (3-NT). Culturas fueron sin tratar (control) o tratados con LPS/IFN- γ, PMA, LPS/IFN- γ / PMA o FeTPPS + LPS/IFN- γ / PMA. Culturas fueron fijadas con paraformaldehido 4% y luego incubadas con 10 μ g / ml de anti-nitrotirosina anticuerpo monoclonal (Upstate). El principal anticuerpo se detectó mediante un Cy3-anticuerpo secundario conjugado (Jackson ImmunoResearch Laboratories). 3-NT-positivas las células se visualiza utilizando un microscopio de fluorescencia (546 nm de excitación, emisión de 590 nm).

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como media ± error y se analizaron mediante ANOVA de importancia.

Resultados
Inflamatoria de la neuroglia en la activación neuronal-glial culturas no conduce a la muerte sustancial de la co-neuronas cultivadas

Un maduro cultivo mixto (16-18 días in vitro) de las neuronas granulares y cerebelosa neuroglia (22% astrocitos y microglia 2%) se utilizó para investigar la inflamación activados neuroglia la muerte neuronal inducida. La neuroglia en la neuronales-gliales culturas se activa con una combinación de endotoxina (lipopolisacárido, LPS) y citoquinas pro-inflamatorias (interferón-γ, IFN-γ), o diferentes combinaciones de citoquinas pro-inflamatorias incluyendo el factor de necrosis tumoral-α ( TNF-α) y la interleucina-1 β (IL-1 β). La muerte neuronal se evaluó 48 horas después de tratamiento con activadores de la inflamación (LPS/IFN- γ, TNF-α y IFN-γ, IL-1 β / IFN-γ o TNF-α y la IL-1 β / IFN-γ). Dos nuclear tintes se utiliza para la tinción de las culturas y para evaluar la necrosis y la apoptosis: la célula-impermeable yoduro de propidio (PI) para la tinción de células necróticas y permeables a la célula Hoechst 33342 utilizado para caracterizar cualquier neuronal muestra signos de núcleos de condensación de la cromatina nuclear o la fragmentación ( Característico de la apoptosis). Aunque relativamente pequeño, niveles significativos de la muerte neuronal se induce tras la activación con LPS/IFN- γ, TNF-α y IFN-γ o TNF-α y la IL-1 β / IFN-γ, pero no IL-1 β / IFN-γ (Cuadro 1].

Para confirmar que la neuroglia en la cultura había sido activado para expresar iNOS, hemos utilizado una simple mancha de óxido nítrico sintasa (NOS) actividad (NADPH diaforasa tinción) que nos permite visualizar con células NOS actividad y distinguir entre los astrocitos y microglia basado en Morfología. Además se analizan los niveles de nitrito en el medio de cultivo como medida de la producción (cuadro 1]. No activado culturas no mostró NADPH diaforasa en la tinción de neuroglia, pero de bajo nivel se observó en la tinción de las neuronas (probablemente debido a nNOS) y se correlaciona con el bajo nivel de nitritos presentes en el medio (Figura: 1a; el cuadro: 1]. Sin embargo, después del tratamiento con LPS/IFN- γ, una alta proporción de neuroglia (astrocitos y microglia) teñidos intensamente de la actividad diaforasa (Figura: 1b]. El tratamiento con TNF-α y IFN-γ, IL-1 β / IFN-γ o TNF-α y la IL-1 β / IFN-γ resultado mucho menos diaforasa tinción de neuroglia, y poco o nada de nitrito de elevación, lo que indica una necesidad de LPS Para inducir la expresión iNOS sustancial.

Relativamente puro neuronal culturas (CGC culturas aisladas, tal como se describe en la sección de metodología y luego tratados con 10 μ M cytosine arabinoside en 18 horas para inhibir la proliferación de neuroglia), que consta de 97 ± 4% de las neuronas, 2 ± 1% astrocitos y el 1 de ± 1% Microglia no se vieron afectados por la presencia de citocinas solas (media% de la cromatina condensada-(CC) y yoduro de propidio-positivos (PI) neuronas ± SEM, de 3 de culturas separadas, el control: CC: 4 ± 3%, PI: 8 ± 4 % Y 10 ng / ml IL-1 β: CC: 3 ± 2%, PI: 7 ± 3% y 10 ng / ml de TNF-α: CC: 3 ± 2%, PI: 9 ± 4%). Además, no significativas se observaron efectos adversos, incluso si las concentraciones de IL-1 β o TNF-α se aumentó 10 veces (media ±% de las neuronas de 1 SEM cultura; control: CC: 4 ± 3%, PI: 8 ± 4 %, 100 ng / ml de IL-1 β: CC: 4 ± 2%, PI: 5 ± 4%; 100 ng / ml de TNF-α: CC: 4 ± 2%, PI: 6 ± 4%) o si se combina con 10 ng / ml IFN-γ tratamiento (media ±% de las neuronas SEM, de 2 de culturas separadas, el control: CC: 4 ± 3%, PI: 8 ± 4% y 10 ng / ml IL-1 β + IFN-γ: CC: 3 ± 2%, PI: 5 ± 3% y 10 ng / ml de TNF-α + IFN-γ: CC: 3 ± 3%, PI: 7 ± 2%).

Estos resultados sugieren que las citocinas no tienen toxicidad directa de las neuronas, y aunque el óxido nítrico (NO) es producido por iNOS expresada en la activación neuroglia siguientes con LPS/IFN- γ, no es capaz de matar a los compañeros de neuronas cultivadas por sí sola, o Las cantidades de NO producido no son suficientes para inducir la muerte generalizada de estas maduras neuronal culturas.

La activación simultánea de iNOS y NADPH oxidasa resulta en la muerte neuronal masiva, mediada por peroxinitrito

Como NO producido por inflamatorio activado neuroglia no indujo sustancial de la muerte neuronal, que investigó si simultánea de la producción de superóxido en el peroxinitrito resultante sería más tóxicos para las neuronas. Peroxinitrito se forma a partir de la difusión limitada de la reacción de NO con el superóxido. En virtud de la inflamación en el cerebro, la NADPH oxidasa es la principal fuente de superóxido, por lo tanto, hemos utilizado forbol 12-myristate 13-acetato (PMA) para activar esta enzima y generar una fuente de superóxido en el neuronales-gliales cultura. Como el número de NADPH-diaforasa positivas neuroglia fue mayor después del tratamiento con LPS/IFN- γ, γ LPS/IFN- utilizado para inducir la expresión iNOS en la neuroglia y proporcionar una fuente de NO. Se encontró que el tratamiento de cultivos neuronales-gliales con LPS/IFN- γ / AMP por 48 horas la muerte neuronal inducida por amplia (Figura: 2a]. Tratamiento de las culturas con el PMA sólo inducidos por sí solo bajos niveles de la muerte neuronal, similar a la observada con el tratamiento LPS/IFN- γ solo. Sin embargo, tanto la activación de NADPH oxidasa y iNOS es sinérgica para inducir la muerte neuronal. Esto se evitó la muerte neuronal por un inhibidor de la iNOS (1400W), la NADPH oxidasa (apocynin) un peroxinitrito scavenger (FeTPPS), pero no por un bloqueador del receptor de NMDA (MK-801).

Como PMA activa la vía de la proteína quinasa C, de los efectos de la AMP podría deberse a razones distintas de estimular la microglial NADPH oxidasa, como el aumento de iNOS expresión más conducente a la producción de NO y NO por la muerte neuronal, y no peroxinitrito. Sin embargo, los niveles de nitrito y nitrato en el medio de cultivo de cultivos neuronales-gliales tratados con LPS/IFN- γ / PMA no eran diferentes a las que se encuentran en la ausencia de PMA (Figura: 2b].

Para determinar si peroxinitrito generado por neuroglia llega a las neuronas, la neuronal-glial culturas se les realizó pruebas de nitrotirosina inmunoreactividad. Positivamente manchadas neuronas (y neuroglia) fueron sólo visto después del tratamiento con LPS/IFN- γ / PMA (Figura: 3] y no en la presencia del peroxinitrito scavenger FeTPPS o cuando son tratados con LPS/IFN- γ (datos no presentados) o PMA sola (datos no presentados). Sin embargo, no PI-positivo neuroglia o cambios en la morfología nuclear gliales se observaron en ninguna de las condiciones, lo que implica que a pesar de que están expuestos a peroxinitrito no gliales inducir la muerte.

ATP es que se sabe que son liberados por las neuronas y la neuroglia en una variedad de condiciones, y se ha informado a activar el microglial NADPH oxidasa a través de los receptores P2X7 [26]. Se encontró que el ATP rápidamente estimulado superóxido y el peróxido de hidrógeno por la producción aislada microglia, que fue sensible a diphenyleneiodonium (DIP), un inhibidor de la NADPH oxidasa (ATP: 80 ± 7 picomoles H 2 O 2 / minuto / 1 × 10 5 microglia). Sin embargo, la ATP no inducir la muerte neuronal por sí sola, o en sinergia con LPS/IFN- γ tratamiento (datos no presentados), probablemente debido a que es rápidamente hidrolizada en medio de cultivo celular [35]. Por lo tanto, hemos utilizado un no hidrolizable de ATP analógica, 2'-3'-O-(4 - benzoylbenzoyl)-ATP (BzATP), conocido por ser un agonista de los receptores P2X7 [36]. BzATP también fue encontrado para estimular DIP-sensibles de la producción de peróxido de hidrógeno aislados microglia, que fue comparable a la producida por la PMA (control: 12 ± 3; PMA: 204 ± 50; BzATP: 124 ± 15 picomoles de H 2 O 2 / minuto / 1 × 10 5 microglia). BzATP no inducir la muerte neuronal por sí solo, sino que los efectos sinérgicos en la muerte neuronal en la expresión iNOS presencia (Figura 4]. LPS/IFN- γ / BzATP la muerte neuronal inducida fue bloqueada por los inhibidores de la iNOS, NADPH oxidasa y una peroxinitrito scavenger, pero no por el bloqueador del receptor de NMDA.

La activación de la microglia en neuroglia enriquecido neuronal-glial culturas potentemente mata neuronas cultivadas co -

Nos hemos dado cuenta de que la IL-1 β o ácido araquidónico (AA) puede activar la microglial NADPH oxidasa, aunque en menor medida que la PMA (control: 12 ± 3; IL-1 β: 37 ± 20; AA: 24 ± 4 picomoles H 2 O 2 / minuto / 1 × 10 5 microglia). Por lo tanto, si la prueba de IL-1 β o AA podría synergise con LPS/IFN- γ para inducir la muerte neuronal. La adición de cualquiera de IL-1 β AA o no inducir la muerte neuronal mayor que el inducido por LPS/IFN- γ sí solo hasta 48 horas después de las adiciones (datos no presentados). Sin embargo, si esas culturas se mantuvieron durante 6 días, nos encontramos con que se produjo la muerte neuronal generalizada (Figura: 5 bis, b], y fue bloqueada por los inhibidores de la iNOS, NADPH oxidasa, una peroxinitrito scavenger y un bloqueador del receptor de NMDA. El tratamiento con la IL-1 β o AA por sí solo no tiene ningún efecto en la supervivencia neuronal, pero sí aumentar el número de microglia en culturas neuronal-glial (Figura: 5c]. El tratamiento con LPS/IFN- γ se encontró que inhibe la proliferación de microglia, pero en presencia de IL-1 β o AA esta inhibición se superó y dar lugar a un aumento progresivo del número de microglia y la posterior muerte neuronal. El mitógenos efectos de la IL-1 β o AA son probablemente mediado por el peróxido de hidrógeno después de la estimulación de la NADPH oxidasa (datos no publicados) y encontramos que inhibidor de la NADPH oxidasa, apocynin, impidió que este aumento en el número de microglia. Nitrito y nitrato (NO X), los niveles (Figura: 5d] fueron mayores en cultivos tratados con IL-1 β AA o más LPS/IFN- γ, pero no en la presencia de apocynin, que bloquean la proliferación microglial, lo que sugiere que fueron los predominantes microglia Fuente de NO y / o peroxinitrito.

Dado que la IL-1 β y AA estimulado la proliferación microglial (en la presencia o ausencia de LPS/IFN- γ), que quería probar si el aumento de la densidad microglial se LPS/IFN- γ sensibilizar a la muerte neuronal inducida. Así que investigó si el enriquecimiento de la microglia en la población neuronal-glial cultura seguida de la activación inflamatoria generalizada daría lugar a la muerte neuronal. El neuronal-glial cultura utilizados en la última sección se enriquece con microglia añadiendo recién aisladas microglia. LPS/IFN- γ activación de un microglia-rica (15% microglia, frente al 2%) neuronal-glial cultura traducido en todas las neuronas dendríticas perdiendo rápidamente sus procesos y reducción de volumen del cuerpo celular (Figura: 6b], además de la cromatina Condensación o yoduro de propidio tinción de los núcleos a las 48 horas de tratamiento (Figura: 6a]. Esto se evitó la muerte neuronal por inhibidores de la iNOS, NADPH oxidasa, una descomposición peroxinitrito catalizador y un bloqueador del receptor de NMDA. La adición de microglia solo (no activada) no afectó la supervivencia neuronal (Figura: 6a, sin tratar). En apoyo de microglia como la clave tipo de células inflamatorias en la neurodegeneración, LPS/IFN- γ activación de astrocyte enriquecido neuronal-glial culturas no dio lugar a la generalización de la matanza de co-neuronas cultivadas (aislamiento de las culturas neuronales-gliales como normal, pero en chapada Confluente una cama de astrocitos; datos no presentados).

Proteína priónica o PrP106-126 inducir la muerte neuronal en presencia de activación inflamatoria mediada por la microglia y la activación de NADPH oxidasa

El prión péptido, PrP106-126, ya ha sido demostrado para activar microglia, que causa la proliferación y la producción de ROS [37, 38]. Recientemente hemos descubierto que la proteína priónica y péptido estimular la NADPH oxidasa en aislados microglia (control: 12 ± 3; proteína priónica: 29 ± 3; PrP106-126: 38 ± 13 picomoles de H 2 O 2 / minuto / 1 × 10 5 Microglia). Hemos decidido investigar si la adición de PrP106-126 a expresar iNOS-neuroglia en neuronal-glial culturas llevaría también a la demora en la neurodegeneración, mediada por peroxinitrito y microglia. La adición de la proteína prión o PrP106-126 por sí sola no afecta a la supervivencia neuronal en estos madura neuronal-glial culturas, pero sí dar lugar a la proliferación microglial (Cuadro 2]. En presencia de iNOS gliales (tras el tratamiento LPS/IFN- γ), PrP106-126 o proteína priónica no exacerbar la muerte neuronal durante un periodo de 2 días, pero son sinérgicos en la muerte co-neuronas cultivadas a los 6 días (Figura: 7 bis, b], mientras que un péptido codificado de la secuencia PrP106-126 no tuvo ningún efecto. La muerte neuronal fue impedida por el bloqueo de la producción de iNOS (1400W), o superóxido de NADPH oxidasa (apocynin), a través de la eliminación de peroxinitrito (FeTPPS), o mediante la inhibición de los receptores NMDA (MK-801). Además, la muerte neuronal fue acompañado por la proliferación de microglia, que fue bloqueado por apocynin (Figura: 7c]. Nitrito y nitrato, fueron también reprimidos en presencia de apocynin, así como 1400W (Figura: 7d].

Discusión

Encontramos que LPS/IFN- γ inducida NOS actividad dentro de neuroglia cultivadas, pero relativamente poco de la muerte inducida de co-neuronas cultivadas. No ha sido previamente informado de que LPS / iNOS inducida por citoquinas en la expresión neuroglia es suficiente [5, 8, 39, 40] o insuficiente [41 - 43] para inducir la muerte de la co-neuronas cultivadas. Del mismo modo, in vivo, se ha reportado que la expresión iNOS es suficiente [44, 45] o insuficiente [46 - 48] para inducir la muerte neuronal. Esto sugiere que, o bien existe un nivel de umbral para el NO / iNOS la muerte neuronal inducida [49], o NO / iNOS inducida por la muerte neuronal esté condicionada al cumplimiento de algunos otros factores. Recientemente hemos informado de uno de esos condicional factor (hipoxia) que con synergises NO / iNOS para inducir la muerte neuronal [31]. En este informe hemos comprobado la hipótesis de que NO / iNOS la muerte neuronal inducida está condicionada a la activación microglial NADPH oxidasa.

Ha sido demostrado que la estimulación de los PMA microglia resultados en la producción de superóxido a través de la estimulación de la NADPH oxidasa [50] y, en presencia de LPS/IFN- γ activado neuroglia (de la producción de NO iNOS), la superóxido se combina con el NO para formar peroxinitrito [32]. Hemos encontrado que si la NADPH oxidasa se vio estimulada por PMA en presencia de LPS/IFN- γ activado neuroglia, que tuvo como resultado una amplia muerte de la co-neuronas cultivadas, mientras PMA inducida por sí solo muy poco la muerte neuronal. En fisiopatológicos condiciones, los niveles de ATP extracelular puede aumentar [51], y la ATP puede activar purinergic receptores (más específicamente los receptores P2X7), que puede conducir a la activación de la NADPH oxidasa [26]. Se utilizó un agonista de los receptores P2X7 (BzATP) para activar la NADPH oxidasa en presencia de iNOS expresión (LPS/IFN- γ activado culturas), y hemos encontrado la muerte neuronal amplia, comparable a la inducida por LPS/IFN- γ / PMA. Neuronales-gliales culturas activado con LPS/IFN- γ / PMA o LPS/IFN- γ / BzATP retraso en la muerte neuronal inducida por que se produjeron más de 2 días. Esto es en parte debido a la duración de iNOS expresión, pero también implica que una vez que se genera peroxinitrito la muerte neuronal no es inmediata.

En ambos casos (LPS/IFN- γ / PMA o LPS/IFN- γ / BzATP), inhibidores de la iNOS o NADPH oxidasa o un scavenger de peroxinitrito impedido esta muerte neuronal, que implican a peroxinitrito como el potencial mediador de la muerte neuronal y la fuente de Peroxinitrito como NO de iNOS y superóxido de NADPH oxidasa. El peroxinitrito marcador putativo de nitrotirosina, se encontró en las dos neuronas y neuroglia algunos, lo que implica que γ LPS/IFN- / PMA resultado en el tratamiento hace que la producción de peroxinitrito reacciona con las neuronas. Además, el peroxinitrito descomposición catalizador evita la aparición de nitrotirosina-positivas neuronas siguientes LPS/IFN- γ / PMA tratamiento. FeTPPS Se ha demostrado que reaccionar rápidamente y catalizar la descomposición del peroxinitrito extracelular [52] y de inhibir la tirosina nitration [53]. La presencia de nitrotirosina inmunoreactividad en neuroglia no parece inducir la muerte gliales. Se ha encontrado que la neuroglia-hasta puede regular sus defensas antioxidantes para ser más resistentes al estrés oxidativo [54], lo que puede explicar la falta de cambio en la morfología gliales.

El mecanismo de peroxinitrito la muerte neuronal inducida es todavía poco clara, pero se ha propuesto involucrar a los daños de ADN inducida por la activación PARP [55], el daño a la cadena respiratoria mitocondrial [56], y la peroxidación lipídica [57]. Aún es controvertido si peroxinitrito-implica la muerte neuronal inducida por la activación de los receptores NMDA [58, 59]. Se encontró que un bloqueador del receptor de NMDA-no impidió que los relativamente muerte neuronal aguda inducida por LPS/IFN- γ / PMA o LPS/IFN- γ / BzATP, pero relativamente lento prevenir la muerte neuronal inducida por LPS/IFN- Γ / IL-1 β o γ LPS/IFN- / AA, aunque en ambos casos la muerte fue impedido por un decomposer peroxinitrito. Es posible que la baja sostenida en los niveles de peroxinitrito inducir la muerte neuronal a través de los receptores NMDA, mientras que alta, niveles agudos inducir la muerte por otros medios, pero no hemos probado este directamente. Hemos encontrado que la IL-1 β o AA activado NADPH oxidasa de producción de peróxido de hidrógeno en menor medida que la AMP, pero, como el PMA, ya sea la IL-1 β o AA synergised con LPS/IFN- γ para inducir la muerte neuronal mediada por peroxinitrito después de la activación de iNOS y NADPH oxidasa. Sin embargo, la muerte neuronal inducida por LPS/IFN- γ / IL-1 β o γ LPS/IFN- / AA producido a lo largo de 6 días, en lugar de 2 días como con LPS/IFN- γ / PMA o LPS/IFN- γ / BzATP. Esta relativa demora podría deberse a la reducción del nivel de activación de NADPH oxidasa y, por tanto, la producción de peroxinitrito. Además, Il β-1 o AA proliferación microglial causados durante los 6 días de las culturas, lo que puede haber contribuido al retraso en la muerte neuronal. Recientemente hemos observado que la IL-1 β AA o estimulado la proliferación microglial en microglia-astrocyte culturas a través de la producción de peróxido de hidrógeno de la NADPH oxidasa (manuscrito en preparación). Aquí hemos demostrado que la IL-1 β AA o estimular la proliferación de microglia en neuronal-glial culturas, incluso en presencia de LPS/IFN- γ (que a su vez inhibe la proliferación microglial). Con el fin de probar si un aumento de la microglia que potenciar LPS/IFN- γ inducida por la muerte neuronal, hemos añadido extra a la microglia aislados neuronal-glial cultura, microglial aumento de la población del 2% al 15% de las células de los compañeros de la cultura. En tal microglia enriquecido las culturas, LPS/IFN- γ la muerte neuronal inducida fue aumentado considerablemente. Estas observaciones sugieren que la microglia son esenciales para activar neuroglia inflamatoria inducida por la muerte neuronal, y una de las razones para esto puede ser la expresión de NADPH oxidasa, que es predominantemente localizada a microglia [24].

Encefalopatías espongiformes transmisibles (Las enfermedades transmitidas por priones) son letales enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la progresiva acumulación de una isoforma resistente a la proteasa (PrP sc), de la proteína prión normal de acogida (PrP c), en placas de amiloide [60]. Una respuesta inflamatoria, principalmente mediada por la microglia, es visto en el post-mortem tejido cerebral, en modelos transgénicos de la enfermedad, y en la cultura [61]. Un péptido, que consta de residuos 106-126 (PrP106-126) de la proteína priónica humana, reproduce muchos de los mecanismos patológicos implicados en estas enfermedades y ofrece un buen modelo in vitro. Contrariamente a los datos publicados [38, 62], se observó que no existen neurotoxicidad después de la adición de PrP106-126 por sí sola a esta madurez neuronal-glial cultura. Se encontró que tanto la proteína prión y PrP106-126, pero no un péptido codificado, estimuló la proliferación microglial cuando se añade a neuronal-glial culturas, y esta proliferación fue bloqueado por un inhibidor de NADPH oxidasa. Tanto la proteína prión y péptido se sinérgica en matar neuronas en la presencia de iNOS gliales, en un peroxinitrito y microglia-dependiente mecanismo. La adición de la isoforma celular de la proteína priónica a cultivos de células que previamente se haya demostrado que no tienen efectos tóxicos [34]. Sin embargo, en presencia de iNOS gliales encontramos a niveles significativos de inducir la muerte neuronal, aunque significativamente menor que la inducida por PrP106-126.

Conclusión

Hemos demostrado que madura en un cultivo mixto de las neuronas y la neuroglia, la activación de la NADPH oxidasa iNOS o solamente no en forma significativa la muerte neuronal, pero que la activación simultánea de ambos es sinérgica en la muerte co-neuronas cultivadas. Esta muerte neuronal parece ser dependientes de la microglia, y la proliferación microglial es en sí mismo estimulado por la activación de la NADPH oxidasa. Estos resultados sugieren una doble clave hipótesis inflamatoria de la neurodegeneración; es decir, que la activación de la iNOS gliales o NADPH oxidasa por sí solo puede ser relativamente benigna, pero cuando se activan junto peroxinitrito que causan la muerte neuronal mediada. La condicionalidad de NO / iNOS inducida por la muerte neuronal permite conocer con mayor detalle los mecanismos inflamatorios de la neurodegeneración y sugiere que microglial NADPH oxidasa puede ser un objetivo terapéutico clave.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

PM participó en el diseño de este estudio, que el trabajo de laboratorio, análisis de datos y escribió partes importantes del documento. CG concibe el estudio, participaron en su diseño y ayudó a redactar el manuscrito. Ambos autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada por el BBSRC, MRC y la enfermedad de Alzheimer Research Trust.