A dos puentes disulfuro Kazal dominio de Phytophthora exposiciones estables actividad inhibidora contra la serina proteasas de la familia subtilisina

Proteasas desempeñan funciones esenciales en los sistemas biológicos, no sólo la digestión de proteínas y el volumen de negocios, sino también una diversidad de procesos específicos [1]. Para regular la actividad de las proteasas y de evitar el daño en las células, los organismos también producen inhibidores de la proteasa [1]. Hasta el momento, 48 familias de diferentes inhibidores de la proteasa se han descrito, una de las cuales es la serina Kazal familia de los inhibidores de la proteasa (I1 familia) [1]. Kazal tipo de los inhibidores se distribuyen ampliamente en los animales, apicomplexans y oomycetes. Se cree que juegan un importante papel en el mantenimiento normal de los procesos celulares y fisiológicas de los animales [2, 3], y la patogénesis de los mamíferos y las plantas parasitarias apicomplexans patógenos oomycetes [4 - 7]. Kazal-como los inhibidores de la proteasa serina se definen por un motivo conservado en sus secuencias de aminoácidos. Típico Kazal dominios contienen seis residuos de cisteína que forman una 1-5/2-4/3-6 disulfuro de bonos patrón [3, 8]. La mayoría de Kazal dominios descritos hasta ahora pertenecen a esta clase. Sin embargo, una nueva clase de Kazal dominios que se ha descrito en los últimos años, en la que la tercera y sexta cysteines faltan resultando en la pérdida de la fianza disulfuro 3-6 [3, 7, 9]. Estos dos puentes disulfuro de dominios se denominan en atípica Kazal dominios.

Atípico Kazal dominios se notificaron los primeros humanos en el inhibidor de proteinasa serina LEKTI, un 15-inhibidor de dominio asociado con la grave enfermedad congénita, síndrome de Netherton [2, 9]. Dominio 2 y 15 de LEKTI son típicos Kazal dominios con total 6 residuos de cisteína, mientras que los otros 13 dominios representan dos atípico puente disulfuro Kazal dominios [3, 9, 10]. La funcionalidad de algunos atípicos Kazal dominios de LEKTI ha sido examinada. Dominio 1 de LEKTI no inhibe ninguna de las proteasas estándar [11]. Dominio 6 exposiciones significativas actividad inhibitoria sobre tripsina, pero esta inhibición es sólo temporal [3, 9, 11]. Una proteína recombinante que contiene cuatro dominios de LEKTI atípicos (dominio 6, 7, 8 y 9) inhibe tanto la tripsina y subtilisina un permanente [10], lo que indica que los dominios Kazal atípicas pueden ser eficaces inhibidores. Sin embargo, no está claro si un solo dominio atípico puede ser un inhibidor estable. Multi-dominio de las interacciones podrían ser responsables de la actividad inhibitoria estable observado para la proteína recombinante [10]. Adicional estructurales y funcionales de los estudios sobre atípico Kazal dominios son necesarios para comprender el impacto de los puentes disulfuro de inhibidor de la actividad y la estabilidad.

Como resultado de exhaustivos estudios bioquímicos de la tercera dominio de pavo ovomucoid proteína realizado por el difunto Michael Laskowski Jr y colaboradores, se sabe bastante acerca de la relación entre el dominio y la secuencia de inhibición de especificidad en Kazal inhibidor de la proteasa de serina interacciones. Este trabajo culminó con la elaboración de una secuencia basada en la aditividad de reactividad algoritmo, de aquí a que se refiere como en el algoritmo de Laskowski, que predice la inhibición constantes (Ki) Kazal entre dominios y una serie de seis serin proteasas basa únicamente en la secuencia de Inhibidores de la [12, 13]. Estudios estructurales de Kazal dominio de los complejos de la proteasa reveló que hay 12 posiciones de contacto (P6, P5, P4, P3, P2, P1, P1, P2, P3, P14, P15 y P18 ') responsable de las interacciones entre Kazal dominios y sus afines serina proteasas [12, 14 - 16]. Cambios en noncontact residuos a menudo no afectan a las constantes de equilibrio (Ka, el recíproco de Ki), mientras que los cambios en contacto con residuos de alteraciones significativas en el resultado de Ka [12]. Entre en contacto con residuos de los 12, P3, el segundo de residuos conservados de cisteína, y P15 ", una asparagine conservadas, muestran grandes variaciones en las de origen natural Kazal dominios, pero los otros diez están en contacto con residuos hipervariables [12]. Por lo tanto, el algoritmo Laskowski se estableció sobre la base de los residuos en las 10 posiciones de contacto y permite el cálculo de Ki Ka o de un Kazal de dominio en contra de un conjunto seleccionado de seis serin proteasas basado en el dominio sola secuencia [12, 13, 17] . Este algoritmo fue desarrollado sobre la base de 191 variantes de pavo ovomucoid tercero de dominio (19 aminoácidos mutantes en los diez más el contacto con los residuos de tipo salvaje) y se validó con un número típico de Kazal dominios [12, 13, 17]. En teoría, el algoritmo debe ser aplicable a los dominios Kazal atípico ya que el faltante residuos de cisteína son diferentes de los residuos hipervariables contacto. Sin embargo, la exactitud de la predicción de algoritmo en la reactividad de los atípicos Kazal dominios no ha sido probado (M. Laskowski, Jr. Pers.).

Kazal-como los inhibidores de la ubicuidad en oomycetes [7], un grupo de microbios eucariotas que incluye muchas devastadores patógenos de las plantas [18]. Un total de 35 putativo extracelular de proteínas con 56 predijo Kazal-fueron identificados como dominios de cinco especies de plantas patógenas oomycete [7]. Entre ellos, los inhibidores Kazal Phytophthora infestans EPI1 y EPI10 inhibir e interactuar con la patogénesis relacionados con subtilisina P69B-serina proteasa como de la planta de tomate, sugiriendo un papel en la virulencia [7, 19]. Ambos EPI1 y EPI10 contener un atípico Kazal de dominio [7, 19]. Atípico dominios son comunes en Kazal-como los inhibidores de patógenos de plantas oomycetes. Una cuarta parte (14/56) de oomycete Kazal dominios pertenecen a este tipo [7]. Estos dominios están distribuidos en 14 diferentes proteínas a partir de tres especies de Phytophthora, P. Infestans, P. Y P. ramorum Sojae, algunas de las cuales tienen múltiples dominios. Sorprendentemente, el análisis filogenético de los 56 dominios reveló que todos los atípicos dominios forman un grupo significativamente distinta (M. Tian, Z. Liu y S. Kamoun, manuscrito en preparación), lo que sugiere que la pérdida de un puente disulfuro en Kazal-como Phytophthora Dominios es anterior a la especiación. Caracterización de la atípica Kazal dominios ayudará a entender la bioquímica y las funciones biológicas de estos inhibidores.

EPI1 P. infestans es un candidato ideal para caracterizar atípico Kazal dominios. EPI1 fue identificado como un apretado vinculante inhibidor de la subtilisina un e inhibe e interactúa con subtilisina P69B-como serina proteasa [7]. EPI1 se compone de dos putativo Kazal dominios, dominio EPI1a atípicos y típicos de dominio EPI1b [7]. El 12 predijo en contacto con los residuos de ambos dominios Kazal seguir el consenso, con el P3 y P15 'cysteines conservadas y asparagines, respectivamente, y los 10 restantes en contacto con residuos de la variable en relación con otros dominios Kazal. En este estudio, que predice la inhibición de EPI1a constantes y subtilisina EPI1b a un Laskowski utilizando el algoritmo [12]. El dominio EPI1a atípico, pero no el típico dominio EPI1b, se prevé que sea un fuerte inhibidor de la subtilisina A. Un recombinante EPI1a estable exhibió actividad inhibitoria contra subilisin A, y parece el único responsable de la inhibición y la interacción con tomate P69B subtilase, proporcionando pruebas de que la Faltan dos residuos de cisteína y de los correspondientes disulfuro de bonos podría no ser esencial para el inhibidor de la reactividad y la estabilidad. Este informe también sugiere que la aditividad basada en la secuencia de reactividad algoritmo (Laskowski algoritmo) originalmente desarrollado y validado con los típicos Kazal dominios pueden funcionar con precisión para atípico dominios.

La inhibición de dos constantes Kazal dominios de EPI1 contra subtilisina A se predijo Laskowski utilizando el algoritmo de [12] basada en la secuencia de sus 10 hipervariables en contacto con los residuos (Fig. 1]. Curiosamente, el atípico Kazal dominio EPI1a se predijo a ser un fuerte inhibidor de la subtilisina A con una Ki de 4,3 nM, un valor que es notablemente similar al determinado experimentalmente Ki de 2,77 + / - 1,07 nM para toda la EPI1 Una proteína contra subtilisina [7]. En cambio, el típico Kazal dominio EPI1b, que contiene el juego completo de seis residuos de cisteína, puede no ser funcional contra subtilisina A desde el predicho Ki fue elevado a 50 mM. Por lo tanto, estos análisis computacional predijo que el dominio EPI1a atípico es el único responsable de la inhibición de la subtilisina A.

Para probar la actividad de la proteasa inhibidora EPI1a y EPI1b, los dos dominios Kazal de EPI1, y evaluar las predicciones de la Laskowski algoritmo, expresado y purificado los dos dominios recombinante en Escherichia coli como proteínas de fusión con la etiqueta BANDERA epítopo en el amino - Terminal. Las secuencias de las proteínas recombinantes se muestra en la Fig. 2A. La masa molecular predicho para EPI1a-FLAG (rEPI1a) y EPI1b-FLAG (rEPI1b) fue 10181 y 8996 Da Da, respectivamente. Para determinar la pureza de la purificado proteínas recombinantes, que corrió 0,5 μ g de rEPI1a purificada y rEPI1b en SDS-PAGE gel y teñidos con nitrato de plata. Bandas de la espera se observaron tamaños para ambas proteínas. Sólo hay una única banda de la rEPI1b, indicando alta pureza (Figura 2B]. La muestra puso de manifiesto dos rEPI1a de cerca de la migración de las bandas (Figura 2B]. Las dos bandas reaccionaron a la BANDERA anticuerpos y es probable que represente rEPI1a con y sin la señal OMPA péptido, que se encuentra inmediatamente antes de la BANDERA péptido en el vector pFLAG-ETA y se encarga de secretada expresión en E. Coli. Similar liberación de la proteína madura se comúnmente observadas con otras proteínas expresadas utilizando pFLAG-ATS (M. y S. Tian Kamoun, inédito). También manchado el gel cargado con la proteína purificada rEPI1a con azul de Coomassie. En comparación con el grupo correspondiente a la rEPI1a sin OMPA, el más lento de la migración de la banda fue mucho más débil (datos no presentados), que indica la versión de secretada rEPI1a fue el principal componente de la proteína purificada rEPI1a solución. Además de estas dos bandas, no se detectaron otras proteínas por tinción de plata rEPI1a lo que sugiere que la preparación fue muy pura.

Hemos realizado ensayos de inhibición de subtilisina por incubando un 0,2 μ M de subtilisina con un 0,2 μ M de rEPI1a, rEPI1b control de amortiguación o en un volumen de 50 μ l. El resto de la proteasa actividad se mide a través de la proteasa QuantiCleave ™ Kit de ensayo tal como se describe en métodos. En reiterados ensayos, se encontró rEPI1a para inhibir el 91% de la medición de la actividad de subtilisina A, mientras que rEPI1b no muestra ninguna inhibición significativa (Fig. 3]. Estos resultados son consistentes con la predicción de la Laskowski algoritmo (Fig. 1]. Es poco probable que la etiqueta BANDERA interferido con las actividades de la inhibitoria, considerando que tanto el rEPI1a activa e inactiva rEPI1b llevar la BANDERA secuencia y de que estos experimentos se llevaron a cabo en paralelo.

EPI1 inhibe e interactúa con la patogénesis relacionados con P69B subtilase de tomate [7]. Para probar cuál de los dos dominios de EPI1 inhibe P69B, que utilizó por primera vez agroinfiltration transitoriamente a expresar P69B fusionados con la etiqueta epítopo HA en el C-terminal de hojas de Nicotiana benthamiana. Líquidos intercelulares se obtuvieron de las hojas, ya sea infiltrado con Agrobacterium tumefaciens que contiene pCB302-P69B, o A. Tumefaciens que contiene el vector binario vacío pCB302-3. 10 μ l de los líquidos intercelulares de los dos tratamientos se utilizaron en-gel en los ensayos de la proteasa. Una banda de la proteasa distintos adicional se observó en la muestra expresando P69B-pero no en el control de lo que sugiere que P69B-HA es funcional (Fig. 4A]. 10 μ l de P69B-expresando N. Benthamiana líquidos intercelulares fueron incubadas con 20 pmol de la EPI1 proteína recombinante rEPI1 [7], rEPI1a, rEPI1b, o de amortiguación y de la actividad de la proteasa restantes se detectó en el ensayo de la proteasa-gel. REPI1a, que contiene el dominio atípico Kazal, inhibe completamente la P69B banda similar a rEPI1. REPI1 y rEPI1a también inhibe la actividad de otras dos de las proteasas extracelulares N. Benthamiana (Fig. 4B]. La identidad de estos N. Benthamiana proteasas es desconocida, pero que también podría ser subtilisina como serina-proteasas, como homólogos de tomate P69. En estos experimentos, rEPI1b no exhibió ninguna inhibición hacia P69B u otras bandas de la proteasa.

Anteriormente rEPI1 mostró que interactúa con P69B [7]. En este sentido, si la prueba atípica Kazal dominio EPI1a interactúa con P69B subtilase por coimmunoprecipitation. Coimmunoprecipitation se realizó en BTH inducida tomate líquidos intercelulares incubadas con rEPI1a, rEPI1b o control de amortiguación utilizando anticuerpos BANDERA covalentemente ligada perlas de agarosa. Western blots secuencialmente se hibridó con P69 y FLAG antisueros y reveló que P69 subtilases co-precipitado con rEPI1a (Fig. 5]. Esto indica que rEPI1a interactúa con P69 subtilases. Desde la P69 familia de subtilases tener al menos seis homólogos (P69A-P69F) [20, 21] y el péptido utilizarse para generar la P69 antisueros se conserva entre varios homólogos [7], no podemos concluir que P69B subtilase es la única proteína que Fue derribado con rEPI1a. En contraste con rEPI1a, rEPI1b no puede ser detectada después de coimmunoprecipitation con BTH inducida tomate líquidos intercelulares (Fig. 5]. Sin embargo, rEPI1b se detectó en el control coimmunoprecipitations con la extracción de amortiguación de los líquidos intercelulares tomate (datos no presentados), lo que sugiere que esta proteína no es estable en BTH inducida tomate líquidos intercelulares.

Para determinar si es un EPI1a temporal o estable inhibidor de la subtilisina, se realizó el análisis de la estabilidad incubando subtilisina A con o sin rEPI1a para aumentar los períodos de tiempo y la medición de la actividad de la proteasa restantes. Para determinar la concentración óptima de EPI1a para la estabilidad de los análisis, que por primera vez ensayos de inhibición con diferentes concentraciones de EPI1a (Fig. 6A]. La concentración de 0,15 μ M de EPI1a dado lugar a la inhibición de los niveles de alrededor del 80% de la actividad de la proteasa medido y fue seleccionado para el análisis de la estabilidad. Esta concentración se encuentra dentro de la parte lineal de la curva (Fig. 6A], lo que sugiere que la hidrólisis de rEPI1a podría ser fácilmente detectado como una disminución de la actividad inhibitoria. La actividad inhibitoria de rEPI1a no mostró disminución de más de 3 horas de incubación con subtilisina A (Fig. 6B], lo que indica que EPI1a estable es un inhibidor de la subtilisina A. Estos resultados están en marcado contraste con las interpretaciones de dominio de LD-6 LEKTI, que perdió el 50% de la actividad inhibidora después de 1 hora de incubación con tripsina y la pérdida de todos los efecto inhibitorio después de 3-4 horas [3].

Atípico Kazal dominios con dos puentes disulfuro se producen en moléculas biológicamente importantes. 15-El dominio humano LEKTI inhibidor de la proteasa serina que lleva 13 atípico Kazal dominios está asociado con el trastorno congénito grave síndrome de Netherton [2]. Los inhibidores de la proteasa EPI1 y EPI10 de p. Infestans contener un atípico Kazal de dominio y han sido implicados en la virulencia de este patógeno devastador planta [7, 19]. Aunque la estructura y función de los dominios de Kazal atípico LEKTI se han estudiado los efectos de la pérdida de Cys 3, Cys 6 y disulfuro de la correspondiente fianza de inhibidor de la reactividad y la estabilidad no se evaluaron, y no hay pruebas que demuestren que un solo atípico Kazal Dominio puede ser un inhibidor estable por sí mismo [3, 10, 11]. En este estudio, se describe que la atípica EPI1a dominio de los dos-EPI1 de dominio es una proteína estable subtilisina inhibidor de la familia de serina proteasas. No hay pérdida de la actividad inhibitoria se encontró incluso después de incubar EPI1a con subtilisina A durante 3 horas. La pérdida de Cys 3, Cys 6 y disulfuro de la correspondiente fianza no tiene mayores efectos adversos sobre la actividad inhibitoria o de la estabilidad, lo que indica que estos dos residuos de cisteína podría no ser esencial para la función de Kazal dominios. Este hallazgo es importante para determinar la bioquímica y las funciones biológicas de los inhibidores Kazal contengan atípico Kazal dominio (s). Kazal-como las proteínas, se han registrado en los animales, apicomplexans, oomycetes, así como la bacteria Nitrosomonas europaea [7]. La disponibilidad de la secuencia genómica de una diversidad de organismos es probable que revelan un creciente número de atípicos inhibidores Kazal. Por ejemplo, hasta la fecha, un total de 14 atípico Kazal dominios han sido identificados en las plantas patógenas oomycetes [7].

El mecanismo estructural subyacente a la estabilidad de EPI1a no está claro. La estructura tridimensional de la atípica dominio 6 (LD6), de LEKTI se determinó. La estructura general de LD6 asemeja a la de tres dimensiones típico pliegue de Kazal de tipo inhibidores, pero la columna vertebral de su geometría canónica bucle no está bien definida, que ofrece una posible explicación de su actividad inhibitoria temporal [11]. Hay 13 residuos entre el primer residuo de cisteína (Cys 1) y el segundo (Cys 2) en LD6, en lugar de 6-9 en el más típico Kazal dominios [11]. La falta de una fianza y disulfuro de la secuencia más larga se extiende entre las dos primeras cysteines se han propuesto para ser los factores responsables de la inestabilidad de LD6 [11]. De hecho, la secuencia más larga se extiende entre las dos primeras cysteines podría explicar la diferencia entre EPI1a y LD6. Sólo hay 3 residuos entre 1 y Cys Cys 2 en EPI1a, que es más corto que en la mayoría de Kazal dominios. El tramo más largo de la secuencia LD6 podría dar lugar a la anormal canónica bucle y no permanentes actividad inhibitoria. El trabajo futuro para determinar la estructura tridimensional de EPI1a y compararla con LD6 de LEKTI y otros Kazal dominios debería ayudar a desentrañar el mecanismo estructural en que se basa la funcionalidad de dominios atípico Kazal.

El algoritmo Laskowski fue elaborado y validado basado en típico Kazal dominios [12, 13]. El algoritmo explota un análisis exhaustivo de todas las variantes de aminoácidos en los diez hipervariables en contacto con residuos de pavo ovomucoid tercio de dominio, un típico Kazal dominio. La precisión del algoritmo para predecir la reactividad de los atípicos Kazal dominios no se ha evaluado (M. Laskowski Jr,. Pers.). Aquí encontramos que el algoritmo predijo correctamente que el programa ampliado de inmunización de los dos dominios es probable que inhiben subtilisins. Nuestros datos experimentales mostraron que el atípico Kazal dominio EPI1a inhibido subtilisina A, e inhibe e interactuó con P69 subtilase similar a la totalidad de la proteína EPI1 [7]. Además, el uso del algoritmo, la atípica Kazal dominio EPI1a se predijo a ser un fuerte inhibidor de la subtilisina A con un Ki previsto del 4,3 nM, que se encontraba en muy buen acuerdo con el determinado experimentalmente Ki de 2.77 + / - 1.07nM [7] . Como se esperaba desde el predicho Ki de 50 mM, la típica EPI1b de dominio no es un eficaz inhibidor de la subtilisina A. En resumen, parece que la Laskowski algoritmo funciona con precisión para atípico Kazal dominios como EPI1a. Quizás, esto es, dado que el 3 y Cys Cys 6 residuos típicos de Kazal dominios no están en contacto con las posiciones. Sin embargo, nuestras observaciones y de la concordancia entre los datos experimentales y predijo sugieren que los cambios estructurales graves que podrían resultar de la pérdida de un puente disulfuro en atípica Kazal dominios puede no afectar a la especificidad de las interacciones entre Kazal dominios y sus afines serina proteasas.

Atípico Kazal dominios son muy abundantes en los inhibidores de la proteasa de serina de plantas patógenas oomycetes. Catorce de un total de 56 Kazal-al igual que los dominios identificados en cinco plantas patógenas oomycetes tienen sólo cuatro cysteines. Dos de estos Kazal-como los inhibidores de EPI1 y EPI10 de p. Infestans objetivo de la defensa relacionados con la proteasa P69B de la planta de tomate. El primer dominio de Kazal atípico EPI1 parece ser exclusivamente funcional y en la inhibición de la interacción con P69B. En el dominio de tres EPI10, la segunda de dominio también es un dominio atípico que se predice que sea funcional contra subtilisina Laskowski basado en el algoritmo [19]. Estos resultados plantean algunas cuestiones interesantes. ¿Cuáles son los bioquímicos y biológicos consecuencias de la pérdida de los puentes disulfuro? ¿Hay alguna evolución de las ventajas de dos puentes disulfuro Kazal largo de los tres puentes disulfuro de dominio en contrarrestar y co-anfitrión con la evolución de las proteasas? Adicional estudios funcionales y estructurales son necesarias para abordar estas cuestiones.

En este estudio, la funcionalidad de un puente disulfuro atípico Kazal dominio EPI1a de Phytophthora se caracterizó. EPI1a se predijo a ser un fuerte inhibidor de la subtilisina Un utilizando la aditividad basada en la secuencia de reactividad algoritmo (Laskowski algoritmo). Ensayos de inhibición y coimmunoprecipitation experimentos mostraron que recombinante dominio exhibido EPI1a estable actividad inhibitoria contra subilisin A, y fue el único responsable de la inhibición y la interacción con tomate P69B subtilase, proporcionando pruebas de que los dos desaparecidos y sus correspondientes cysteines disulfuro de bonos no son esenciales para la estabilidad y reactividad inhibidor . Este informe también sugiere que el algoritmo Laskowski originalmente desarrollado y validado con los típicos Kazal dominios pueden funcionar con precisión para atípico Kazal dominios.

El putativo diez hipervariables en contacto con residuos de EPI1a y EPI1b se identificaron basado en la semejanza con los animales Kazal dominios canónica [14 - 16] y se muestra en la Fig. 1. Predijo constantes de inhibición de la EPI1 dominios contra subtilisina A (Carlsberg) fueron generados por los Dres. Qasim MA y M. Jr Laskowski, Universidad de Purdue, con la aditividad basada en la secuencia de reactividad algoritmo (Laskowski algoritmo) descrita por Lu et al. [12].

Tomate () 7814 y N. Benthamiana plantas cultivadas en macetas a 25 ° C, humedad del 60%, menos de 16 horas de luz / 8 horas de oscuridad ciclo. Hemos utilizado el ácido salicílico analógico benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic ácido S-metil éster (BTH), para inducir a las proteínas PR. BTH tratamiento de las plantas de tomate seguido el mismo procedimiento descrito anteriormente [7].

E. coli XL1-Blue y A. Tumefaciens GV3101 se utilizaron en este estudio y fueron rutinariamente crecido en Luria-Bertani (LB) los medios de comunicación [22] a 37 ° C y 28 ° C, respectivamente. Plásmidos pFLAG-EPI1a y pFLAG-EPI1b para la expresión de la proteína se construyeron por la clonación con fines de la amplificación de PCR fragmentos de ADN correspondientes a la secuencia de codificación de Kazal dominios EPI1a y EPI1b junto con algunas secuencias de acompañamiento en EcoRI EcoRI y KpnI KpnI sitios de pFLAG-ATS (Sigma, St Louis, MO), que permite a un vector de expresión en E. secretada Coli. Los primers utilizados para la amplificación de epi1a son epi1a-F1 (5'-gcggaattcTCAAAGCCCGCAAGTCATCAG gcggaattcTCAAAGCCCGCAAGTCATCAG gcggaattcTCAAAGCCCGCAAGTCATCAG-3 ') y epi1a-R1 (5'-gcgggtaccTTACTTGCTGGGAGGCTGCTCGCCAG gcgggtaccTTACTTGCTGGGAGGCTGCTCGCCAG gcgggtaccTTACTTGCTGGGAGGCTGCTCGCCAG-3'). Los primers utilizados para la amplificación de epi1b son epi1b-F1 (5'-gcggaattcCACCGGTAGCTCCACTGGCGAGCAGC gcggaattcCACCGGTAGCTCCACTGGCGAGCAGC gcggaattcCACCGGTAGCTCCACTGGCGAGCAGC-3 ') y epi1b-R1 (5'-gcgggtaccTTATCCCTCCTGCGGTGTC gcgggtaccTTATCCCTCCTGCGGTGTC gcgggtaccTTATCCCTCCTGCGGTGTC-3'). La introducido EcoRI EcoRI y KpnI restricción KpnI sitios de la clonación están subrayados. Las letras en mayúsculas representan secuencias de genes específicas. La información detallada de la secuencia de proteínas de fusión expresó EPI1a-FLAG (rEPI1a) y EPI1b-FLAG (rEPI1b) se muestra en la Fig. 2A. Plásmido pCB-P69B es una construcción abierta con el marco de lectura del gen P69B [GenBank: Y17276] fusionados con la etiqueta HA (YPYDVPDYA) en el C-terminal clonado en el vector binario pCB302-3 [23] y se ha descrito en otra parte [ 19].

Las proteínas fueron sometidas a un 15% de sulfato de sodio dodecil-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a lo descrito previamente [22]. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con nitrato de plata siguiendo el método de Merril et al. [24] o con Coomassie azul brillante [22], o las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa apoyado (BioRad Laboratories, Hercules, CA) con un Mini Trans-Blot aparato (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Detección de complejos antígeno-anticuerpo se llevó a cabo con un Western blot kit de la fosfatasa alcalina (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Antisueros a P69 subtilases se plantearon en contra de un péptido específico para el tomate P69 familia [7]. Monoclonales anti-FLAG M2 anticuerpo fue comprado a Sigma (St. Louis, MO).

Expresión y purificación de rEPI1a y rEPI1b se realizó como se describió anteriormente para otros pFLAG-ATS derivados construye [7, 25]. Se determinaron las concentraciones de proteína utilizando el ensayo BioRad proteínas (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Para determinar la pureza, 0,5 μ g de la proteína purificada se ejecutan en un gel SDS-PAGE seguida de tinción con nitrato de plata.

La expresión transitoria de P69B-HA en la planta se realizó de acuerdo a la agroinfiltration método descrito anteriormente [26]. A. Tumefaciens cepas desempeño plásmidos pCB-P69B, vector vacío pCB302-3 [23], y pCB301-P19 (Win J. y S. Kamoun, inédito) se utilizaron. PCB301-P19 es una construcción que expresa la proteína P19 de tomate tupidas dobles de virus (TBSV), un supresor de post-transcripcional en el silenciamiento génico N. Benthamiana que mejora significativamente en la planta transitoria de expresión [27]. La noche a la mañana agrobacteria culturas fueron cosechadas por centrifugación a 2000 g por 20 min, y resuspendido en 10 mM MgCl _2, 10 mM MES (pH 5.6) y 150 μ M acetosyringone. Resuspendido agrobacteria culturas de pCB-P69B o pCB302-3 con una densidad óptica (OD ₆₀₀₎ de 1,0 se mezcla con igual volumen de una cultura de pCB301-P19 con una densidad óptica (OD ₆₀₀₎ de 2,0. Las mezclas se mantuvo a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se infiltraron en las hojas, de 6 semanas de edad N. Benthamiana plantas. Líquidos intercelulares de las hojas infiltrado se aislaron 5 días después de la infiltración.

Intercelulares fluidos fueron elaborados en base a tomate y N. Bethamiana hojas de acuerdo con el método de de Wit y Spikman [28]. Para las hojas de tomate, un 0,24 M sorbitol se utiliza como solución de extracción de amortiguación. Para las hojas de N. Benthamiana, una solución de 300 mM NaCl, 50 mM NaPO ₄ pH 7 [26] se utilizó como buffer de extracción. Los líquidos intercelulares se filtro esterilizado (0,45 μ M), y se utilizaron inmediatamente o almacenarse a una temperatura de -20 ° C.

En los ensayos de la proteasa-gel se realizaron con 10% SDS-gel de poliacrilamida que contiene 0,1% (w / v) de gelatina (BioRad Laboratories, Hercules, CA) a través de BIO-RAD zymogram del sistema de amortiguación, tal como se describe anteriormente [7].

Ensayos de inhibición de un subtilisina por EPI1 Kazal dominios han sido efectuados con colorimétricas QuantiCleave ™ Kit de ensayo de proteasa (Pierce, Rockford, IL). 0,2 μ M de subtilisina A (Carlsberg) (Sigma, San Luis, MO) fue preincubated con diferente cantidad de purificado EPI1 Kazal dominios, en un volumen de 50 μ l de buffer de 30 min a 25 ° C, y luego el resto de la actividad fue la proteasa Medidos con arreglo a los procedimientos que se describen anteriormente [7]. Análisis de la actividad inhibidora de estable rEPI1a contra subtilisina Una fue realizada por incubando 0,2 μ M de subtilisina con un 0,15 μ M de rEPI1a en 50 μ l de buffer (50 mM Tris, pH 8,0) durante un período de tiempo de 0-180 min a 25 ° C Y, a continuación, la medición de la actividad enzimática de residuos.

Coimmunoprecipitation de Kazal dominios rEPI1a y rEPI1b con BTH-tomate tratadas líquidos intercelulares se realizó a través de la etiqueta-FLAG proteína immunoprecipitation kit (Sigma, San Luis, MO), tal como se describe anteriormente [7]. 100 pmol de rEPI1a purificada o rEPI1b se preincubated con 300 μ l de los líquidos intercelulares de tomate durante 30 minutos a 25 ° C. 40 μ l de anti-FLAG fue agregado M2 resina y se incubaron a 4 ° C durante 2 h con agitación suave. La proteína se precipitó eluyen en 60 μ l de solución BANDERA péptido (150 ng / μ l) y se analizaron por SDS-PAGE y Western blot análisis.

MT, el diseño y la realización de experimentos de laboratorio húmedo, de la escritura manuscrita. SK, de la supervisión del trabajo experimental, de la escritura manuscrita.