Recíproca función de las ciclinas y ciclina quinasa p21 ^WAF1/CIP1 inhibidor de la proliferación de linfocitos, allo-activación inmune y la inflamación

Alloimmune activación, causadas por la proliferación aberrante de los linfocitos T es uno de los principales eventos post trasplante en receptores de trasplante de órganos. Actual de los fármacos inmunosupresores, por tanto, son diseñadas para inhibir la proliferación de linfocitos T. Nuestros estudios previos han demostrado que los fármacos inmunosupresores, ciclosporina (CsA) tacrolimus (TAC), y sirolimus (SRL), además de la inhibición de la proliferación de linfocitos y la IL-2 también induce la expresión de TGF-β y otras moléculas fibrogénicos [1 - 3] que conduzca a Nefrotoxicidad y rechazo crónico. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar estrategias alternativas para lograr el aumento de la inmunosupresión para la supervivencia del injerto con menos nefrotoxicidad. La inmunosupresión más eficaz que se puede lograr por la inhibición directa de la proliferación de linfocitos T. Dado que la expresión de las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclina y citoquinas pro-inflamatorias se incrementa durante la proliferación de linfocitos T (4), el control de la proliferación de las células T en la regulación de la expresión de ciclinas podría inhibir allo-activación inmune y la inflamación. P21WAF1/CIP1 es uno de los más potentes inhibidores de ciclina quinasa y, por tanto, tiene el potencial de control de la expresión de ciclinas y activación de linfocitos.

Hemos demostrado que la CsA, TAC y SRL [4 - 6] induce la expresión de la ciclina kinasa inhibidor p21WAF1/CIP1 y también in vitro e in vivo sobre-expresión de los linfocitos p21WAF1/CIP1 resultados en la disminución de la respuesta a estímulos mitógenos y una mayor sensibilidad A los efectos inhibitorios de la ciclosporina [7]. El presente estudio fue diseñado para estudiar la expresión de ciclinas durante la activación de células T, el rechazo de aloinjertos, y el efecto de p21WAF1/CIP1 sobre estimulación mitogénica y alogénico, las citoquinas pro-inflamatorias y la supervivencia del injerto en un modelo de trasplante de corazón de rata.

Linfocitos de los sujetos sanos (n = 4, obtenidos a partir de sangre del Centro de Greater Milwaukee, Milwaukee) fueron separados como se describe [1]. Por mRNA estudios, los linfocitos (1 × 10 ⁶ / ml) se cultivaron con PHA (2 μ g / ml), con y sin CsA (100 mg / ml) durante 4 h, las células fueron lavadas dos veces con PBS y las células se almacenan en Trizol a -80 C durante la preparación de ARN.

Hetrotopic trasplantes de corazón se realizaron según lo descrito por nosotros [8]. Se utilizó Lewis (LEW, RT1 ^1), y Wistar-Furth (WF RT1 ^u), ratas, que representan disparidad genética completa en ambos mayores y menores de histocompatibilidad loci. Isografts se realizaron en LEW-LEW alogénico mientras que los trasplantes se realizaron en WF-LEW trasplante combinaciones. La inmunosupresión se utilizó CsA a dosis de 2,5 mg / kg para toda la duración del experimento descrito. Las ratas fueron supervisados diariamente por allograft pruebas de la desaceleración y el fracaso y en el momento de rechazo, s animales fueron sacrificados y el bazo se utilizaron para preparar los linfocitos y se broche de órganos congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 C hasta el aislamiento de ARN.

ARN total fue aislado de los linfocitos con Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y tejidos con SV RNA Kit de aislamiento (Promega, Madison, WI). Pureza de RNA fue confirmada en una proporción de 260/280 nm. 1 μ g de ARN transcrito fue invertir en cDNA utilizando un superíndice transcripción reversa kit de Invitrogen (Carlsbad CA). La amplificación de mRNA expresión fue logrado por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando primers específicos para secuencias p21WAF1/CIP1, β-actina, IL-2, TNF-α; Ciclinas G, Ciclinas E, D3 Ciclinas, IL-6, y IL-10 se describen por nosotros [4 - 6]. Los productos de PCR se resolvieron en el 1% la electroforesis en gel de agarosa, bromuro de etidio manchadas específicas bandas se visualizaron bajo luz ultravioleta y fotografiadas. El análisis densitométrico de las bandas específicas se hizo con Alpha-Imager (Alpha Innotech Corp, San Leandro, CA) y los datos se representan como la proporción de los genes específicos de β-actina. Se realizó el análisis del ciclo para cada primer par para seleccionar un número de ciclos de amplificación para cada gen estudiado.

La proliferación de las células se determinó a través de ³ H-timidina incorporación que se describió anteriormente (1-2). Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Un total de 3 experimentos individuales investigación de la proliferación de las inalteradas y p21WAF1/CIP1 células Jurkat [descrito en el ref. 7] se realizaron en no activado y con la APS. En pocas palabras, se añadieron 200000 células en cada pocillo de una ronda final de 96 y placa. PHA (2 μ g / ml) se añadió a los pozos, los controles fueron sin PHA. Las células se cultivaron por 64 horas a 37 ° C en el 95% de aire y 5% de CO ₂ enriquecido medio ambiente. Los cultivos fueron pulsados con ³ H Thymidine (1 μ Ci así) de los últimos 16 h de incubación, las células fueron cosechadas y radiactividad contado utilizando un scintillation counter. ³ H-Thymidine captación se expresa como el promedio de los cargos por minuto de tres muestras. La magnitud de las células Jurkat T proliferación de las células p21WAF1/CIP1-augmented inalterada y se investigaron en reposo después de la estimulación mitogen.

MLR se realizó con esplenocitos de isografts, no tratados y tratados de CsA en los receptores de trasplante (LEW) como respondedores y irradiado esplenocitos de los donantes cepa (WF) como estimuladores. El estimulador de respuesta o de las células se cultivaron por sí sola como controles negativos. ³ H Thymidine captación se expresa como la mediana de los cargos por minuto de tres muestras. El grado de proliferación determina la reactividad de allo-entre estos grupos de ratones y ratas.

Para entender la relación entre las ciclinas, las citoquinas pro-inflamatorias y p21WAF1/CIP1 durante la proliferación de linfocitos e inhibición, nosotros estudiamos el ARNm de la ciclina G, ciclina D3, IL-2, IL-6, TNF-α, y en p21WAF1/CIP1 Linfocitos activados en la presencia o ausencia de CsA. La expresión del ARNm de la IL-2 se utilizó como control y la inhibición de la activación de los linfocitos. Los resultados de un representante de los tres experimentos se muestra en la Figura 1A. Mitogen activación de los linfocitos provocado un aumento de la IL-2, G ciclinas y D3, TNF-α, IL-6 y p21WAF1/CIP1 ARNm (carril 2), en comparación con los linfocitos no tratados (carril 1). Como era de esperar, CsA inhibe la expresión de la IL-2 y TNF-α mRNA obstante IL-6 mRNA no fue completamente inhibido. Más interesante, mientras que la inhibición de los linfocitos por CsA también dio lugar a una significativa disminución de la expresión de ciclinas G, y D3 ARNm, y un incremento en la expresión de ciclina kinasa inhibidor p21WAF1/CIP1 ARNm (carril 3) se observó.

Los resultados obtenidos a partir de tres experimentos como la relación de cada gen con β-actina (media ± SEM) se presentan en la Figura 1B. Una disminución estadísticamente significativa en las citoquinas pro-inflamatorias IL-2 (p <0.016), IL-6 (p <0,02), TNF-α (p <0,03) y de las ciclinas; Ciclinas D3 (p <0,01) y Ciclina G (p <0,008) se observó en marcado contraste con un aumento significativo de p21 (p <0,03) en los linfocitos activados en presencia de CsA. CsA tratamiento también produjo un aumento de expresión de la proteína p21 en los linfocitos activados (Figura 1C]. Este aumento fue alrededor de 2 veces.

La justificación de estos experimentos es nuestra hipótesis de que en los no tratados y el rechazo de los receptores de los trasplantes cardíacos, alloimmune activación dará lugar a un incremento en la expresión de mRNA de las ciclinas en los linfocitos y el tratamiento con CsA se alloimmune inhibir la activación y, por tanto, expresión mRNA de las ciclinas que conduzcan a la Prolongación de la supervivencia del injerto. Para probar esto, se estudió la expresión mRNA de las ciclinas G, D3 y E en los linfocitos de rechazo (sin tratamiento) y no el rechazo de los receptores (CsA tratadas) en una rata cardíaco heterotópico allograft utilizando un modelo plenamente MHC mal [WF (RTl ^u) En LEW (RTl ^l)] cepa combinación. Los resultados (Figura 2A] demuestran que la expresión de ciclinas G, D3 y E fue significativamente mayor en los linfocitos no tratados procedentes de los receptores de aloinjertos cardíacos (carriles 4, 5), en comparación con los tratados con CsA (2,5 mg / kg) durante 30 días (Carriles 1-3). Las ratas no tratadas rechazó injerto entre 8-10 días después de trasplante mientras que las ratas tratadas con CsA no rechazó y fueron sacrificados en el día 30 ^º. Casi idéntica expresión de la limpieza de genes β-actina en los linfocitos de estas ratas también se muestra (Figura 2A]. Los resultados de la CsA no tratados y tratados receptores también se presentan como la relación de cada ciclina a β-actina (media ± SEM); ciclina D3 (0,43 ± 0,05 vs 0,16 ± 0,04, p <0,03); ciclina G (0,45 ± 0,02 ± 0,1 vs 0,03, p <0,003) y de ciclina E (0,46 ± 0,03 vs 0,1 ± 0,04, p <0,007). Estos resultados (Figura 2B] obtenidos a partir de un semi-PCR cuantitativa análisis demuestran que la activación aberrante alloimmune responsables de rechazo del injerto se asocia con el incremento en la expresión de ciclinas. Más significativamente, el tratamiento disminuyó significativamente CsA mRNA expresión de las ciclinas, alloimmune activación y la prolongación de la supervivencia del injerto.

Para confirmar que el incremento en la expresión de ciclinas en los linfocitos de rechazo de las ratas se debe a la activación alloimmune, se realizó reacción mixta de linfocitos (MLR), utilizando células de bazo de los animales donantes (WF) como estimuladores y esplenocitos de los beneficiarios (LEW) como respondedores. Tres grupos fueron estudiados; isografts (control), sin tratar aloinjertos (A), y tratados con CsA aloinjertos (B). Después de cinco días de duración MLR linfocitos fueron cosechadas y lavadas. ARN fue preparado; invertir transcribe a cDNA, y se amplificó por RT-PCR para ciclina D3, IFN-γ, TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA. Como se muestra en la Figura 2C expresión mRNA de la ciclina D3 fue mayor en los linfocitos de aloinjertos grupo A sin tratamiento, en comparación con los linfocitos B de isografts grupo. Este incremento en la expresión de ciclina D3 correlacionado con la citoquinas pro-inflamatorias IFN-γ y TNF-α MRNA expresión. La expresión de la IL-6 y IL-10 mRNA no fue estadísticamente significativa entre los grupos Ay B. CsA tratamiento ciclina D3 expresión disminuido en un 50% y redujo estadísticamente significativa (p <0,03) IFN-γ mRNA expresión. En la activación de linfocitos MLR ensayo se cuantificó ³ H-timidina captación de ensayo. Proliferación de los linfocitos no tratados de aloinjertos fue significativamente mayor (dos de cola valor p = 0,02) en comparación con los tratados con CsA aloinjertos (media ± SEM de los cargos por minuto, n = 3, 11796 ± 7575 ± 728 vs 360). Estos resultados apoyan las conclusiones de los estudios de trasplante de rata que la alloimmune resultados en el incremento en la expresión de ciclinas mRNA que se correlaciona con la producción de citoquinas pro-inflamatorias. Allo-activación inmune es demostrado por el aumento de la proliferación de linfocitos MLR ensayo, que se redujo de CsA en los animales tratados.

Para confirmar nuestra anterior in vitro e in vivo que p21WAF1/CIP1 estudios sobre expresión se inhibe la proliferación de linfocitos y la expresión de IL-2, que realizó los estudios que utilizan las células T Jurkat. Jurkat células T fueron transfectadas con el vector vacío de ADN plásmido (ADN control) y p21WAF1/CIP1 sentido plásmido de ADN. Utilizamos células Jurkat T para estos experimentos, debido a la facilidad con que estas células pueden ser transfectadas primaria, en comparación con las células T; estos p21WAF1/CIP1 sobre-expresión de las células Jurkat T se describen anteriormente [7]. No se observaron diferencias en la proliferación de células Jurkat normal de las células Jurkat y transfectadas con el vector vacío de ADN. P21WAF1/CIP1 el Control y la sobre-expresión de las células T Jurkat fueron activadas con PHA (2 μ g / ml) durante 4 h para IL-2 mRNA expresión estudios y 24 h para la proliferación de estudios que utilizaron ³ [H]-timidina captación de ensayo. Los resultados demuestran que las células Jurkat control, pero no p21WAF1/CIP1 sobre-expresión de las células Jurkat T, respondieron a la estimulación por mitógenos PHA (Figura 3A]. PHA estimulación dado lugar a un incremento en la expresión de ARNm de la IL-2 en células Jurkat, no en p21WAF1/CIP1 sobre-expresión de las células Jurkat (Figura 3B]. Estos resultados indican que la sobre-expresión p21WAF1/CIP1 prestados células Jurkat no responden a los estímulos mitógenos, posiblemente p21WAF1/CIP1 sobre expresión no permite el aumento de ciclina expresión, impidiendo así la activación de linfocitos por la PHA. Un incremento en la expresión de la proteína p21 en cuatro diferentes conjuntos de p21-overexpressing células Jurkat T (carriles 2-4) en comparación con las células Jurkat T transfectadas con el vector vacío de ADN plásmido (carril 1) también se muestra (Figura 3C] que sugiere el aumento de la proteína p21 Expresión en estas células p21 overexpressing.

Los experimentos realizados en este estudio fueron diseñados para comprender el papel de las ciclinas en mitogen-allo y estimulación de las células inmunes y también, si la inhibición de las ciclinas se correlacionan con las citoquinas pro-inflamatorias. También estudió si p21WAF1/CIP1 modulación en los receptores de trasplante cardiaco modula allo-y estímulos mitógenos y allograft supervivencia. Los resultados demuestran que durante la activación de linfocitos, mRNA expresión de las ciclinas y las citoquinas pro-inflamatorias es significativamente mayor y CsA inhibe la activación de linfocitos, mRNA expresión de las ciclinas, las citoquinas pro inflamatorias, pero inducida por la proteína p21 y la expresión mRNA.

Estudios [9 - 12] han demostrado que la expresión de la ciclina D3, cdk6, y ciclina E se activa en la IL-2 de los linfocitos T estimulados. Sin embargo, el nuevo hallazgo de este estudio es que la expresión de mRNA en ciclinas activan los linfocitos se correlaciona con la de las citoquinas pro-inflamatorias, y la expresión de las ciclinas y las citoquinas pro-inflamatorias es inhibida por agente inmunosupresor CsA. Estas conclusiones no son novedosas demostrado anteriormente. Nuestros resultados hacen hincapié en que la progresión del ciclo celular y la inflamación son eventos concertados por lo tanto, la regulación de control del ciclo celular puede dar lugar a disminución de la inflamación.

Nuestros resultados in vitro sobre el incremento en la expresión de mRNA en ciclinas activan los linfocitos fueron reproducidas en vivo en nuestros estudios. El ARNm expresiones de ciclina D3, G E y en los linfocitos (posible predominantemente células T, CsA inhibe la proliferación de los linfocitos T) aisladas de bazo de los no tratados receptores de trasplante cardíaco de rata fueron significativamente más altos que aquellos tratados con ciclosporina. El incremento en la expresión de ciclinas pueden representar una incontrolada allo de la activación inmune en estas ratas. Desde CsA tratamiento resultó en la inhibición de la activación inmune allo-y el aumento de la supervivencia del injerto acompañada de una significativa inhibición de la expresión de mRNA en ciclinas CsA tratados. Esto posiblemente se debe a la CsA alloimmune mediada por la inhibición de la activación. Estos resultados indican la presencia de un activo durante la progresión del ciclo celular allo de la activación inmune. Por lo tanto, el control de la progresión del ciclo celular debe impedir la inflamación conduce a la mejora de la supervivencia del injerto. Estos resultados se apoyan en nuestros estudios con MLR culturas utilizando linfocitos de los receptores de trasplante de corazón de rata. Un aumento de la proliferación de los linfocitos acompañados incremento en la expresión de ciclinas y de citoquinas pro-inflamatorias mRNA cuando respondedores de los linfocitos se utilizaron ratas no tratadas, en comparación con los de isografts CsA o ratas tratadas receptores de trasplante de corazón. Una vez más, estos linfocitos se activan posible predominantemente células T, la proliferación de los linfocitos T es un componente clave de reparto de la activación inmune. Por lo tanto, estos resultados presentan en apoyo a nuestra manera de pensar que la inhibición de la activación inmune allo-acompaña disminuido expresión de las ciclinas y las citoquinas pro-inflamatorias.

Estos resultados confirman que el control de la progresión del ciclo celular juega un papel importante en la proliferación de células T / activación. Papel de la p21 en otros aspectos de la proliferación de linfocitos se ha estudiado. Estudios de Balomenos et.al, [13] Santiago-Raber et al [14] y Brian et al [15] demostraron que los linfocitos T de p21WAF1/CIP1 ^{- / -} ratones proliferado significativamente más que los ratones de tipo salvaje a la estimulación. Los resultados obtenidos en nuestros estudios que p21WAF1/CIP1 modulación altera la progresión del ciclo celular y el sistema inmunológico. Jackson et al [16] mostraron que el aumento de los niveles de p21WAF1/CIP1 al final de G (1) podría prevenir cdk mediada por la entrada en la fase S, lo que proliferativa apatía también en experimentos con p21WAF1/CIP1 sobre-expresión de Jurkat T Células.

Los resultados de este estudio son importantes ya que p21 es una de las más potentes de los reguladores del ciclo celular y es conocida para inhibir la proliferación de células de dos maneras distintas. P21 se une a Cdk2 e inhibe PCNA (Antígeno nuclear de células proliferantes), que es una proteína auxiliar en la DNA polimerasa del ADN necesario para la síntesis de nucleótidos y de los impuestos especiales-n-reparación [17]. PCNA tiene 6 sitios de unión para p21 [18]. Los estudios también [19] demostraron que la PCNA vinculante y inhibitoria actividades residir en el dominio C-terminal de p21, en comparación con la ubicación de la actividad inhibidora CDK conservadas en el dominio N-terminal. Los autores también concluyeron que las CDK y PCNA inhibitoria dominios impedido la replicación del ADN sugiere una doble función de p21 como un inhibidor del ciclo celular in vivo. Hemos realizado estos estudios exclusivamente con ciclina kinasa inhibidor p21WAF1/CIP1, aunque p53 y ciclina kinasa inhibidores (p27, p16) han demostrado inhibir el ciclo celular p16 y aún p21WAF1/CIP1 inhibir la progresión del ciclo celular a través de distintos mecanismos [20]. El objetivo específico de p16 es la Cdk/4cyclin D compleja y en un modelo de tumor, p21WAF1/CIP1 y p16 no mostró efectos aditivo o sinérgico [21]. Además, en contraste con p21WAF1/CIP1, la expresión de p27 no está bajo el control transcripcional de expresión y su ARNm se mantiene sin cambios durante el ciclo celular [22]. Además, los altos niveles de p27, pero no se observan p21WAF1/CIP1 silente en la mayoría de las células y la inhibición de los niveles de p27 precede a la progresión del ciclo celular [23]. Aunque ambos p21WAF1/CIP1 y p27 son esenciales en la respuesta de las células a mitogens, p21WAF1/CIP1 proporciona un mejor equilibrio entre las ciclinas y ciclina kinasa inhibidores [24] haciendo hincapié en su importancia en la inhibición de la proliferación y la inmunosupresión. Por lo tanto, es posible que p21WAF1/CIP1 sobre expresión podría interrumpir el ciclo celular y también evitar el progreso inflamación. Es bien sabido que durante la activación de células T, la expresión de citoquinas pro-inflamatorias IFN-γ, TNF-α y la IL-6 es un incremento significativo. Dado que las células T son los principales mediadores de la activación inmune-allo, este incremento en la expresión de citocinas en receptores de trasplante de órganos resultados en rechazo del injerto [25 - 27]. Nuestros resultados demuestran un aumento paralelo en la expresión de las ciclinas y las citoquinas pro-inflamatorias. Por lo tanto una inhibición / regulación de la progresión del ciclo celular de células inmunitarias en más de la ciclina kinasa inhibidor p21WAF1/CIP1 disminuiría tanto allo-activación inmune y la inflamación en los receptores de trasplante.

También demuestran que las ratas transfectados con el ADN plásmido p21WAF1/CIP1 expresó p21WAF1/CIP1 más de mRNA en diferentes tejidos. Los beneficiarios de las PC allograft animales que recibieron la inyección intra-muscular de p21WAF1/CIP1 sentido de ADN plásmido ha aumentado significativamente la supervivencia del injerto en comparación con los receptores transfectados con el ADN plásmido vacío. Estos estudios muy preliminares sugieren que la sobreexpresión de p21 puede prolongar la supervivencia del injerto a un grado comparable a la prolongación de CsA. Otros estudios seguramente será necesario para confirmar y cuantificar el efecto de p21 en la supervivencia del injerto. Presentamos también los resultados que la única expresión de la IL-2 mRNA fue significativamente menor en los linfocitos y aislados de aloinjertos p21WAF1/CIP1 sobre-expresión de los receptores de trasplantes de corazón de rata.

Nuestro método de utilización del ADN plásmido para obtener in vitro e in vivo de transfección p21WAF1/CIP1 se basa en los datos apoyan la eficacia de la inyección intra-muscular de ADN plásmido para una serie de genes [28]. Una serie de estudios [29 - 32] han demostrado que no plásmido de ADN viral proporciona una sencilla, segura y viable alternativa para la terapia génica con derivados en el tejido muscular de alto nivel de expresión. Más significativamente plásmidos no inducir inmunidad neutralizantes, que permite la administración repetida. Rauh et al [33] a prueba la hipótesis de que la inyección intramuscular de ADN desnudo puede resultar en la distribución a distancia desde el lugar de colocación de la aguja, la facilitación de la transferencia de genes intramuscular. El uso de imágenes de ultrasonido transcutánea los autores demostraron que una solución de ADN plásmido directamente administrados por inyección intramuscular en los músculos esqueléticos de la extremidad se distribuye mucho más allá del sitio de la aguja de entrada y persistido durante 8-10 semanas. Por lo tanto, sobre la base de estos estudios y nuestra propia [7], creemos que la sobre-expresión p21WAF1/CIP1 se puede obtener a través de inyecciones intramusculares de ADN plásmido, que podría dar lugar a la disminución de la capacidad de respuesta de los linfocitos T para allo-y estímulos mitógenos.

En resumen, los resultados de este estudio demuestran que únicamente durante la activación de linfocitos, es la expresión de ciclinas y el aumento de la inhibición de la activación de los linfocitos por la ciclosporina inhibe la expresión de ciclinas y aumenta la expresión de la ciclina kinasa inhibidor p21WAF1/CIP1. La expresión de las ciclinas se correlaciona con la de las citoquinas pro-inflamatorias, como TNF-α y IFN-γ in vitro en linfocitos activados y linfocitos in vivo en animales de la rata con el rechazo de trasplantes de corazón. Estos estudios demuestran que las ciclinas y las citoquinas pro-inflamatorias son los principales mediadores de la asig-activación inmune y la alteración de la expresión p21WAF1/CIP1 puede modular la proliferación de linfocitos y allo-activación inmune. Estos estudios proporcionan pruebas exclusivamente en el papel de las moléculas de control del ciclo celular en allo de la activación inmune y permitirá el desarrollo de estrategias alternativas para obtener la mejora de la supervivencia del injerto en el trasplante de órganos. Por otra parte sobre la base de nuestros estudios publicados previamente, los resultados presentados en este estudio, y nuestro estudio recientemente publicado [34] creemos que podrían proporcionar una mejor p21WAF1/CIP1 inmunosupresión con menos efectos secundarios observados con el actualmente utilizado clínicamente fármacos inmunosupresores para los receptores de trasplante de órganos .