Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 19-19 (más artículos en esta revista)

Señalización de las vías de mediación selectiva inducción de la óxido nítrico sintasa II por el factor de necrosis tumoral alfa del factor de crecimiento del nervio en respuesta a las células

BioMed Central
Michael Thomas S (msthomas@utmb.edu) [1], WenRu Zhang (wezhang@utmb.edu) [1], Paivi M Jordania (pmroozen@utmb.edu) [1], H Uri Saragovi (uri.saragovi @ mcgill . Ca) [2], Giulio Taglialatela (gtaglial@utmb.edu) [1]
[1] Departamento de Biología Celular y Neurociencias, la Universidad de Texas Rama Médica en Galveston, Texas - EE.UU.
[2] Departamento de Farmacología y Terapéutica, McGill University, Montreal, Quebec, Canadá

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Resumen
Antecedentes

La inflamación y el estrés oxidativo juegan un papel fundamental en la neurodegeneración asociada con insultos agudos y crónicos del sistema nervioso. En particular, las neuronas afectadas suelen ser sensibles a tróficos y depende de factores como el factor de crecimiento del nervio (NGF). Nos mostró anteriormente en NGF-PC12 células que respondan factor de necrosis tumoral alfa (TNF α) y NGF sinérgicamente inducir la expresión de la producción de radicales libres de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Hemos propuesto que responda NGF-podría ser selectivamente las neuronas expuestas a la iNOS mediada por el daño oxidativo, como consecuencia de niveles elevados de TNF α. Con el objetivo de identificar posibles dianas terapéuticas, en el presente estudio se investigaron las vías de señalización implicadas en NGF / TNF-α promovido iNOS inducción.

Métodos

Western Blot, RT-PCR, factor de transcripción de genes específicos de los sistemas de reportero, las células mutantes que carecen de la baja afinidad del receptor p75NTR NGF y transfections de TNF α / receptores de NGF quiméricos se utilizan para investigar los eventos de señalización asociados con NGF / TNF-α en la inducción de iNOS promovido células PC12 .

Resultados

Nuestros resultados muestran que la expresión iNOS resultantes de NGF / TNF α tratamiento combinado puede ser obtenido en células PC12. PC12 células mutantes que carecen de p75NTR no respondió, lo que sugiere que p75NTR se requiere para mediar iNOS expresión. Además, las células transfectadas con quimérico TNF α / receptores de NGF demostrado que la presencia simultánea de ambos p75NTR y TrkA señalización es necesaria para crear sinergia con TNF α para mediar iNOS expresión. Por último, nuestros datos muestran que la NGF / TNF-α promovido iNOS inducción requiere de la activación de factor de transcripción nuclear factor kappa B (NF-κ B).

Conclusión

En conjunto, nuestro modelo in vitro sugieren que las células teniendo tanto la alta y baja afinidad para los receptores de NGF pueden mostrar mayor sensibilidad a TNF α en términos de expresión iNOS ser selectiva y, por tanto, en situación de riesgo durante aguda (por ejemplo, neurotrauma) o crónica (por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas), las condiciones en que Altos niveles de citoquinas pro-inflamatorias en el sistema nervioso producen patológicamente. Nuestros resultados también sugieren que la modulación de NF-κ B, promovido transcripción selectiva de los genes podrían servir como posible diana terapéutica para prevenir neuroinflammation inducida por daño neuronal.

Antecedentes

Neuroinflammation se cree que juegan un papel en la neurodegeneración asociada a una variedad de insultos agudas y crónicas tanto en la central (SNC) y periférico (PNS) del sistema nervioso [1, 2]. Ejemplos de neurotraumatic neurodegenerativas o condiciones donde la ocurrencia o papel de neuroinflammation se ha documentado incluyen lesiones nerviosas periféricas [3 - 6], aguda y crónica lesión de la médula espinal [7 - 11], la lesión cerebral traumática [12 - 14], los accidentes cerebrovasculares [15 -- 17], la esclerosis lateral amiotrófica (ALS, [18 - 20] y la Enfermedad de Alzheimer (AD, [21 - 24].

Las neuronas sensibles a los insultos neuroinflammatory suelen depender para su supervivencia de meta factores neurotróficos derivados tales como el factor de crecimiento del nervio (NGF), el cerebro-factor neurotrófico derivado (BDNF) o neuroglia derivados factor neurotrófico (GDNF). Las mismas condiciones neurodegenerativas también se han asociado con la presencia de altos niveles dañinos de los radicales libres conducen a especies patológicos de estrés oxidativo [25]. Por ejemplo, la participación inflamatoria en la patogenia AD ha propuesto basada en parte en observaciones de aumento de los niveles de las citoquinas pro-inflamatorias factor de necrosis tumoral alfa (TNF α) y la interleucina-1 beta (IL-1 β) en el líquido cefalorraquídeo y la corteza cerebral de pacientes con AD [26, 27]. Además, entre las más afectadas son las neuronas en la AD basal anterior neuronas colinérgicas (BFCN, [28 - 30]], que dependen de apoyo trófico por objetivo derivado de NGF [31, 32]. Además, hay pruebas de la presencia de daño oxidativo en el cerebro AD [33 - 36]. Del mismo modo, el daño neuronal tras la lesión medular aguda o lesión nerviosa periférica se ha demostrado que entrañan un neuroinflammatory así como el estrés oxidativo componente [1, 8, 10, 11, 37 - 39], traumatismo craneoencefálico y se sabe también que se asocia Con un aumento de las concentraciones de citoquinas inflamatorias, y la reducción del número de neuronas colinérgicas basal anterior [13, 40 - 42].

Por lo tanto, me parece que hay una íntima relación entre citoquinas pro-inflamatorias, el estrés oxidativo y factores tróficos que subraya la neuropatológicos consecuencias de la extrínseca (por ejemplo, traumáticas) o intrínsecos (por ejemplo, relacionados con la enfermedad) un daño al sistema nervioso. Nuestro trabajo anterior ha demostrado que, en respuesta a NGF rata feocromocitoma (PC12) células TNF α induce la expresión de los radicales libres de óxido nítrico (NO), la síntesis de la enzima NOS II (iNOS) sólo en presencia de NGF actúa a través de su receptor de alta afinidad TrkA [43 ]. De hecho, los niveles de NOS perturbado y NO-derivados daño oxidativo se han notificado en tanto aguda como crónica, condiciones neurodegenerativas [25], incluyendo lesiones de la médula espinal [44 - 46], derrame cerebral [47, 48] y el AD [49 - 53]. Sin embargo, el TNF α por sí sola no ha demostrado ser un eficaz inductor de iNOS promotor de la actividad humana [54] o de rata cortical iNOS expresión cuando se administra intracerebroventricularly [55]. No obstante, TNF α se ha demostrado que contribuyen a la muerte de NGF dependientes de las neuronas in vitro [56] e in vivo [57, 58]. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren anterior, la atractiva idea de que un mecanismo mediante el cual el aumento de los niveles de TNF α afectar a determinados factor trófico de las neuronas de respuesta puede implicar NO-derivados daño oxidativo provocado por un efecto aditivo sobre la inducción de la iNOS. La comprensión de los mecanismos moleculares de mediación de la sinérgica NGF / TNF-α promovido la inducción de la iNOS puede por lo tanto proporcionar nuevos objetivos terapéuticos para la prevención de ciertos eventos neurodegenerativos asociados con lesiones agudas o crónicas del sistema nervioso.

Aquí mostramos que un reversible expresión de la iNOS, producida en las células PC12 por la exposición simultánea a NGF y TNF α, requiere de la presencia simultánea de ambos la baja afinidad p75NTR y la alta afinidad de los receptores TrkA NGF. Además, la utilización de inhibidores específicos de genes y un reportero de ensayo, que demuestran que tales efecto sinérgico de la combinación de NGF / TNF α tratamiento es mediado por el factor de transcripción factor nuclear kappa B (NF-κ B).

Métodos
Materiales

Todos los reactivos y productos químicos de rutina se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.), salvo que se indique lo contrario. Recombinante humano y de rata TNF IGF rata y se obtuvieron a partir de R & D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU., purificado ratón NGF de Harlan Bioproducts, Indianapolis, IN, EE.UU., y pyrrolidine dithiocarmbamate (PDTC), el inhibidor del proteasoma octapeptide (ISP), PD98059, K252a y 1400 W de Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU..

Clonal líneas celulares

Stock culturas de las células de rata feocromocitoma (PC12; una especie de regalo del doctor Lloyd Greene, la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE.UU.) y PC12 células que carecen de la baja afinidad del receptor p75NTR NGF se mantuvieron en 75 cm 2 frascos de cultivo de tejido en 10 ml RPMI-1640 medio de cultivo suplementado con 5% inactivado por calor suero bovino fetal en una celda humidificado incubadora a 37 ° C mantiene en el 5% de la atmósfera de CO 2. La mitad de las medianas fue sustituido cada dos días y las células se dividieron, una vez por semana para mantener la viabilidad celular.

Vectores de expresión

Transfección transitoria de las células se realizó mediante un sistema de paquetes liposomal. En pocas palabras, el 1,2 pmol vector de expresión se mezcla con DMRIE-C (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) en un 1:3 ratio de ADN a liposomas. El ADN / liposomas fueron diluidos en 400 μ l de suero libre transfección medio (Optimem) y luego añade a aproximadamente 100000 células en un 12 y placa de cultivo celular. Las células fueron autorizados a ocuparse de la liposomal ADN durante 3 horas antes de que se lavó, y regresó al medio de cultivo celular. Las células se recuperarse a las 24 horas antes de cualquier tratamiento. El quimérico cDNA que codifican las proteínas que lleva el dominio extracelular del receptor TNFR1 y los dominios transmembrana y citosólica de los receptores de NGF (ya sea p75NTR o TrkA) fue una especie de regalo del doctor Eric Shooter y preparado como se describe [77], (Universidad de Stanford , Palo Alto, Ca, EE.UU.). El p-SEAP expresión vector, que contiene el gen SEAP en virtud de NF-kB, AP1 o potenciador de control de la CRE, se adquirió de Clontech (Palo Alto, CA, EE.UU.). Medio condicionado de células transfectadas con los vectores de la SEAP reportero fue ensayada por la fosfatasa alcalina por medio de la toma de muestras y la utilización de la Gran quimioluminiscente EscAPe SEAP ensayo (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Western blot

Las células fueron lisadas SDS utilizando un buffer de lisis de base (2% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1 mM de cada uno de TDT, y PMSF cóctel inhibidor de la proteasa). Después de un helado de lavado PBS, las células fueron lisadas con SDS y la lisis de amortiguación sonicated brevemente antes de aclarar por centrifugación en 20000 g durante 20 minutos a 4 ° C. Después de la centrifugación el sobrenadante se recogió el contenido de proteínas y se midió usando el estándar de ensayo de la proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Extractos de proteínas (40 μ g) se diluyeron en buffer muestra 6X y cargaron en un 6% SDS-gel de poliacrilamida. Geles se ejecute durante una hora a 100 V, y luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa noche a la mañana a 25 V. Todas las incubaciones fueron a temperatura ambiente en el 0,5% de Tween en salina tamponada de Tris (TTBS). Las membranas se bloquearon durante una hora en el 5% de leche en TTBS. Primaria monoclonal anti-iNOS (Signal Transduction Laboratories, San Diego, CA, EE.UU.) o policlonal anti-TNFR1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) se diluyeron en el 2,5% en la leche TTBS a 1:1000 y las membranas se incubaron Con el anticuerpo durante una hora a temperatura ambiente. Membranas se lavaron tres veces durante diez minutos cada uno en TTBS antes de incubar durante una hora con un rábano picante-peroxidasa secundaria de anticuerpos (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.) a 1:7500 en leche de 2,5% en TTBS. Por último, las membranas se lavaron de nuevo en TTBS tres veces durante diez minutos cada uno. Inmunorreactivas bandas se visualizaron por una mancha de detección quimioluminiscente occidental kit (Amersham Biosciences, Piscatay, NJ, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Las imágenes fueron capturadas utilizando una cámara de 12 bits monocromo (OAR, Upland, California, EE.UU.).

Transcriptasa inversa ensayo de reacción en cadena de la polimerasa

ARN total fue extraído con el Kit de Extracción Trizol (Gibco BRL, San Diego, CA, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Una μ g de RNA total de cada muestra se aplicó a la lista para ir RT-PCR Beads (Amersham Biosciences, Piscatay, NJ, EE.UU.) y se utiliza para completar el protocolo de amplificación de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Primer secuencias de rata iNOS fueron los siguientes; adelante 5'-GGA CAC GAA TGG AGT CAG-3 'y revertir 5'-GGA CAG TAA ACA TGG CCG CAC-3'. Amplificación de las muestras se ejecutan en geles de agarosa y teñido con bromuro de etidio. Las imágenes fueron capturadas utilizando una cámara de 12 bits monocromo (OAR, Upland, California, EE.UU.).

Citometría de flujo

Una μ g de anticuerpo contra TrkA o p75 NTR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) fue etiquetada con Zenon Rabbit IgG kit de etiquetado de Molecular Probes (Eugene, OR) según las instrucciones del fabricante y se incuba durante 1 hora con las células en Suspensión. Después de la incubación, las células se visualizaron etiquetados y cuantificarán mediante un Becton Dickinson FACS Vantage Flow Cytometer fijado en el instrumento adecuado parámetros.

Análisis estadístico

En su caso, los datos se expresaron como media + / - error estándar de la media (SEM), y analizada por estudiante unpaired t de dos colas de prueba con la significación fijada en p <0,05.

Resultados
Combinado NGF y TNF α inducir iNOS mensaje y proteínas

El panel superior de la figura 1 se muestra un western blot iNOS en la detección de células PC12 tratados simultáneamente con 10 ng / ml NGF y 10 ng / ml de TNF α en la presencia o ausencia de 50 nM K252a, un inhibidor de la phosphorylative eventos asociados con activación de los receptores tirosina quinasa Que se ha demostrado que bloquear la función de la alta afinidad del receptor de NGF TrkA [61]. Se observó una marcada inducción de la expresión iNOS sólo en células simultáneamente tratadas con NGF y TNF α, mientras que el tratamiento por sí solo ni suscitó ningún efecto. Además, K252a completamente abolido NGF / TNF-α promovido iNOS inducción, lo que sugiere que TrkA función es esencial para mediar en ella. Como se muestra en el panel inferior de la figura 1, junto con el aumento de los niveles de proteína también había una inducción de la iNOS mRNA en células PC12 tratados con NGF y TNF α, pero no en las células tratadas con cualquiera de los factores por sí solo.

NGF y TNF α son a la vez necesarias para la expresión sostenida iNOS

Figura 2A muestra Western-Blots detección de iNOS en las células tratadas con concentraciones crecientes de NGF (panel superior) o TNF α (panel inferior), en la presencia o ausencia de una cantidad fija de TNF α o NGF, respectivamente. De cualquier factor es ineficaz cuando se suma sola a ninguna de las concentraciones. Sin embargo, hubo un marcado aumento dosis-respuesta en iNOS expresión cuando el aumento de las concentraciones de NGF o TNF α se añadieron en la presencia de una cantidad fija de TNF α o NGF, respectivamente. Figura 2B muestra un representante occidental blot iNOS expresión en la detección de células continuamente tratados con NGF y TNF α en comparación con las células en las que el tratamiento combinado fue retirada después de 24 hr. La expresión de iNOS regresó a basal, indetectable, los niveles entre 24 y 48 horas después de la retirada de ambos TNF α y NGF. Además, como se muestra en la figura 2C, el retiro de cualquiera de NGF o TNF α por sí sola fue suficiente para abolir iNOS expresión inducida por el tratamiento combinado, tanto en el de proteínas (panel superior) y ARNm (panel inferior). Para excluir la participación de factores desconocidos suero, NGF / TNF-α promovido la inducción de la iNOS se determinó en células cultivadas de 24 Horas en el suero libre o en medio definido N2 (Figura 2D]. Hubo una inducción de iNOS detectable tanto en el suero de libre definido y medianas cultivos celulares, aunque mucho más reducida en condiciones libres de suero, que es previsible que las células PC12 no sobreviven por períodos más largos de tiempo (24-48 horas), en ausencia de N2 suero o suplementos. Desde la insulina está presente tanto en el suero y la N2 suplemento, y puede activar el factor de crecimiento tipo insulina (IGF) del receptor, nos pregunta si TNF α pueden aportar sinergias con IGF, en las que también está presente en el suero, para inducir la expresión iNOS. Los resultados se muestra en la Figura 2E indican que este no es el caso.

TNF α / NGF mediada por iNOS expresión es independiente de la actividad enzimática NOS

Con el fin de determinar si la actividad enzimática de la iNOS puede jugar un papel en el mantenimiento de TNF α / NGF-hemos promovido la señalización PC12 células pretratadas con dos inhibidores de EEUU que antes de TNF α / NGF tretament. El pretratamiento con N (G)-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) no afectó la expresión de iNOS inducida por el NGF / TNF α tratamiento combinado (Figura 3A]. El mismo resultado se observó más si un inhibidor específico de iNOS (1400 W) se utilizó en lugar de L-NAME (Figura 3B]. Concentraciones de 1400 W utiliza aquí han sido previamente demostrado ser eficaz en la inhibición de forma selectiva la actividad iNOS en células PC12 por otros [78]. Estos resultados sugieren que la expresión sostenida iNOS en respuesta de la combinación de NGF / TNF α tratamiento es independiente de los EEUU actividad enzimática.

NGF / TNF α promovido iNOS inducción requiere el factor de transcripción NF-κ B

La figura 4 muestra los resultados de las células PC12 transfectadas transitoriamente con un reportero de la fosfatasa alcalina secretada construcción genética (SEAP) promovido por potenciador secuencias específicas de factor nuclear kappa B (NF-κ B), el activador de la proteína 1 (AP-1), el elemento de respuesta a cAMP ( CRE) o Tal (no inducible de control). Veinticuatro horas después de transfección las células fueron tratadas con 10 ng / ml cada una de TNF α y NGF (sola o combinada) y SEAP liberados en el medio de cultivo (un índice de la activación del factor de transcripción endógena) fue ensayada 3 hr y 12 h más tarde. A las 3 h, las células tratadas con TNF α mostró un aumento significativo de NF-κ B, pero no la actividad AP-1 o CRE. Las células tratadas con NGF solos a los 3 Horas mostró ningún aumento significativo de NF-κ B, AP1 o actividad de la CRE. Cuando las células fueron expuestas a la combinación de NGF / TNF α tratamiento, hubo un robusto aumento de NF-κ B, actividad que fue significativamente mayor que la respuesta inducida por el trato individual con TNF α. Por otra parte, ni la AP-1, ni CRE actividad fueron significativamente afectados por la combinación de NGF / TNF α tratamiento. A las 12 h, tanto TNF α y NGF / TNF α tratamientos combinados aumentó significativamente NF-κ B actividad, pero no fueron estadísticamente significativamente diferente. NGF-células tratadas mostraron un incremento significativo en la AP-1 y CRE actividad a las 12 h, mientras que NF-κ B, la actividad no se vio afectada. Como resultado de ello, hubo también un aumento significativo de la AP-1 y CRE actividad suscitado por el NGF / TNF α tratamiento combinado a las 12 hr. Ni NGF ni TNF α (sola o combinada) suscitó ningún efecto sobre el control de la construcción de reportero de Tal, ya sea en 3 o 12 Horas.

La participación de NF-κ B fue más explorado por determinar la medida en que la inhibición farmacológica de NF-κ B el bloque de NGF / TNF-α en la inducción de iNOS promovido células PC12. Como se muestra en la figura 5A, el tratamiento de las células PC12 con cualquiera de las dos pyrrolidine di-thio-carbamato (PDTC) o el inhibidor del proteasoma octapeptide PSI (dos eficaz NF-κ B inhibidores que tienen mecanismos de acción [8, 63 - 65], completamente abolido NGF / TNF-α promovido iNOS inducción. En este experimento, PD98059, un inhibidor selectivo de MAPK, se utilizó como control negativo. Ambos NF-κ B bloqueado inhibidores de NF-κ B-transcripcional mediada la actividad según lo determinado por los genes reportero SEAP ensayo (Figura 5B ), Mientras que PD98059 no tuvo ningún efecto. Sin embargo, PD98059 completamente bloqueado NGF-promovido neurite resultado (Figura 5C], un evento que en el PC12 células depende de la activación de MAPK [66]. Además, en consonancia con los resultados presentados en la figura 4, la inhibición De la actividad NOS por L-NAME no afecta a NF κ B activación por NGF / TNF α tratamiento combinado (Figura 5D].

NGF / TNF-α promovido iNOS inducción requiere la presencia simultánea de ambos la p75NTR y receptores TrkA NGF

A continuación, subcloned una línea celular PC12 mutante (PC12 p75NTR (-)), que carece de expresión p75NTR conservando TrkA en niveles comparables con los de tipo salvaje células PC12 (Figura 6A]. NF-κ B, la actividad no aumentó significativamente por el NGF / TNF α tratamiento combinado con los niveles inducidos por el TNF α sola en PC12 p75NTR (-) (Figura 6B]. En consonancia con este hallazgo, PC12 p75NTR (-) de las células expuestas a la combinación de NGF / TNF α tratamiento no mostraron la inducción de la expresión iNOS, en comparación con la línea de células madre (Figura 6C]. Es importante señalar que el PC12 p75NTR (-) de las células utilizadas aquí expresar TNF α del receptor de tipo 1 (TNFR1) a niveles comparables (o incluso superior) a las células de tipo salvaje PC12 (Figura 6D]. Por lo tanto la falta de inducción de la iNOS NGF / TNF α tratamiento combinado en estas células no pueden atribuirse a la falta de respuesta de TNF α (como también puede ser apreciado por la NF κ B, la respuesta inducida por el TNF α sola muestra en la figura 6B].

Los resultados obtenidos en PC12 p75NTR (-) indican que p75NTR es esencial para mediar la inducción de la iNOS combinados TNF α / NGF tratamiento mientras que los resultados obtenidos utilizando K252a (Figura 1] sugiere un papel destacado para TrkA. Con el fin de determinar en última instancia, la función relativa de los dos receptores de NGF en la mediación TNF α / NGF-promovido iNOS inducción que hicimos uso de las células PC12 transfectadas transitoriamente con vectores de expresión para la codificación de quimérico TNF α / receptores de NGF construido tal y como se describe por Rovelli et al. [77]. Estas construcciones llevan el ligando vinculante dominio de los humanos TNFR1 y la transducción de señales de dominio de los receptores de NGF rata, ya sea TrkA o p75NTR. Anteriormente, se ha demostrado que la transfección con estas quimeras permite TNF-promovido NGF señalización [77]. Figura 7 muestra un western blot iNOS en la detección de células PC12 individual o simultáneamente transfectadas con receptores quiméricos TNF α teniendo el dominio intracelular de p75NTR (p55/p75NTR) o TrkA (p55/TrkA). Transfectadas las células fueron tratadas ya sea con TNF α y NGF solo, o con ambos TNF α y NGF. Como se esperaba, el combinado TNF α / NGF tratamiento induce una sólida expresión de la iNOS en estas células PC12, independientemente de la presencia de cualquier transfectadas expresión vector. Como también se esperaba, no fue lo único que NGF obtener iNOS expresión en ninguna de las células transfectadas. Del mismo modo, TNF α por sí solo no inducir iNOS en células transfectadas con cualquiera de las dos p55/p75NTR o quimérico p55/TrkA receptores. Sin embargo, inducido por TNF α rápidamente iNOS expresión en las células transfectadas con ambos p55/p75NTR y p55/TrkA receptores quiméricos.

Discusión

El trabajo que aquí se presenta surge de nuestra observación de que la iNOS original de la expresión y la posterior producción de NO puede ser sinérgica inducida por NGF y TNF α-TrkA en una forma dependiente de las células PC12 en [43]. Nuestros resultados actuales investigó la vías de señalización implicadas. Como estamos constantemente observado una mayor expresión iNOS NGF, si se añade a la vez TNF α, proponemos que se indujo la expresión iNOS selectivamente en células NGF-sensible. Estos resultados no nos permiten descartar la posibilidad de que factores intermedios inducido por TNF α o NGF puede jugar un papel en la sensibilización de las células indirectamente a NGF o TNF α, respectivamente. Sin embargo, los resultados que se muestran en la Figura 2 parece excluir esta posibilidad. En efecto, si bien la retirada de NGF y / o TNF α permite una rápida ablación de expresión iNOS (Figura 2B], ni tampoco NGF TNF α es suficiente por sí sola para sostener expresión iNOS tras la retirada de TNF α o NGF (Figura 2C]. Estas observaciones sugieren que la presencia continua y simultánea de los dos factores es necesario para mantener la inducción de iNOS / expresión, y que la sensibilización a través de una célula de cebado mecanismo parece poco probable. No obstante, otros investigadores han atribuido el aumento de TNF α toxicidad en células PC12 NGF a la diferenciación inducida [67]. Sin embargo, nuestros resultados parecen excluir que la diferenciación de las células PC12 puede haber jugado un papel. En primer lugar, en nuestras condiciones experimentales iNOS expresión se produce tan pronto como 3 hr después de la exposición a la combinación de NGF / TNF α tratamiento [43], antes que cualquier diferenciación morfológica inducida por NGF. En segundo lugar, mientras que NGF bloqueo de la diferenciación inducida por el inhibidor de MAPK PD98059 (Figura 5C, [68]], no tuvo ningún efecto sobre NGF / TNF-α promovido iNOS expresión (Figura 5A], bloqueo de NF κ B no afecta a la diferenciación inducida por NGF (Figura 5C], pero completamente inhibido iNOS expresión.

En el presente estudio se informan también de que la inducción y el mantenimiento de la iNOS por la expresión combinada de NGF / TNF α requiere tratamiento continuo de novo iNOS mRNA síntesis, presumiblemente debido al factor de transcripción reglamento. En efecto, la abolición de iNOS actividad enzimática no tuvo ningún efecto sobre NGF / TNF-α promovido iNOS inducción (Figura 4A, B]. Por lo tanto, la participación de los comentarios positivos debido a la NO parece poco probable. Por otro lado, el análisis de la actividad transcripcional de NF-κ B, AP-1 y CRE reveló que NF-κ B más probable es que medie sinérgica iNOS inducción por TNF α y NGF. Desde la inducción de iNOS puede observarse ya en 3 hr después de NGF / TNF α tratamiento combinado en células PC12 [43], los resultados que se muestran en la figura 5 sugieren que NF-κ B es el único factor de transcripción entre los experimentados aquí, que responda a las simultáneas El tratamiento con NGF TNF α y de una manera coherente con la inducción de la expresión iNOS. De hecho, mientras que el TNF α solos inducida NF κ B, a las 3 h, esta inducción fue significativamente menor que el promovido por el combinado NGF / TNF α tratamiento. Independientemente de la medida en que NF κ B se activa o si diferencias cualitativas en la subunidad B NF κ composición en respuesta a TNF α en comparación con NGF / TNF α tratamiento puede desempeñar un papel en la inducción de iNOS expresión aún no se ha establecido. No obstante, la inhibición de NF-κ B completamente inhibido iNOS mientras que la inhibición de la inducción era ineficaz MAPK (Figura 5A]. Por último, la inhibición de la actividad de NOS no bloquear NGF / TNF-α promovido activación de NF κ B, de este modo aún más el apoyo a la idea de que la orientación NO Mayo aguda asociada mejorar el estrés oxidativo, pero no puede representar a la mayoría de enfoque amplio para lograr una corrección a largo plazo de estos acontecimientos.

Estudios anteriores indicaron que NGF puede inducir NF-κ B, actuando a través de la baja afinidad del receptor p75 NTR [70]. Así, la participación de NF-κ B en la mediación NGF / TNF α efectos combinados sugieren un papel para p75NTR. De hecho, hemos encontrado que las células mutantes PC12 que la falta de la expresión del receptor p75NTR no respondió en términos de expresión iNOS cuando simultáneamente tratados con NGF y TNF α. En consonancia con este hallazgo, en PC12 células mutantes que carecen de p75NTR expresión NF-κ B, la actividad no fue inducido por la combinación de NGF / TNF α tratamiento por encima de los niveles observados en las células tratadas con TNF α sola (Figura 6B].

PC12 células que teniendo sólo el receptor TrkA no respondió el combinado NGF / TNF α tratamiento sugiere que la señalización de p75NTR en combinación con TNF α es necesario para inducir iNOS expresión. Por otra parte, nuestro trabajo anterior ilustra la importancia de TrkA asociada a la señalización en la mediación NGF / TNF-α promovido la inducción de la iNOS [43] (véase también la figura 1]. Estos resultados son sólo aparentemente en contraste. En efecto, en un sistema ciertamente artificial haciendo uso de las construcciones de quiméricos se observó que sólo en la presencia de ambos TNF-α responda NGF receptor de señalización puede TNF α promover iNOS expresión cuando se añade por sí solo. Si esto es una consecuencia de la simultánea, pero independiente de señalización de los dos tipos de receptores de NGF [79] o la contratación de elementos de señalización intracelular exclusivamente impulsado por la activación simultánea de ambos receptores de NGF 'dominios de señalización que queda por investigar. Por otra parte, estos resultados excluyen la posibilidad de que la acción combinada de TNF α y NGF pueden derivar de la interacción todavía no han sido descritas (s) de los dominios extracelulares de sus respectivos receptores siguientes ligando vinculante.

Por lo tanto, nuestros resultados combinados indicaría que existe una vía de la participación de NF-κ B, y que exige la simultánea expresión o de los dos tipos de receptores de NGF que es sinérgica inducido por TNF α y NGF para promover la expresión de iNOS. Esto es de especial interés dado que los tipos de neuronas que expresan ambos receptores TrkA y p75NTR son limitados y que se sabe que son afectadas en condiciones neurodegenerativas donde neuroinflammation y citoquinas pro-inflamatorias han demostrado desempeñar un papel importante. En particular, la expresión simultánea de TrkA y p75NTR en el SNC es principalmente BFCN limitada a los que se sabe que son particularmente afectados en la EA. De hecho, también se han descrito otras vías de señalización que requieren de la expresión simultánea de ambas TrkA y p75NTR [71, 72], así como la convergencia de TrkA y señalización mediada por p75NTR afectar a NF-κ B [73]. Según informes recientes, en las neuronas de TNF-promovido señalización selectiva se producen en presencia de los agonistas de glutamato NMDA [4] ilustran la importancia de considerar la señalización "contexto" cuando el estudio de los efectos del tratamiento de citoquinas.

En general, nuestros datos indican la posibilidad de que la convergencia entre NGF-promovido trófico de señalización y TNF α podría poner en peligro la NGF-selectivamente las neuronas de respuesta en condiciones de neuroinflammation a causa de una acción sinérgica entre TNF α y NGF para inducir iNOS expresión. Por ejemplo, el TNF α overexpressing ratones transgénicos muestran la neurodegeneración selectiva de NGF-responda basal anterior neuronas colinérgicas [57] y TNF α administración directa en el cerebro de ratones resulta en un deterioro de la función colinérgica basal anterior [58]. Sin embargo, si la inducción de la iNOS y de los daños oxidativos pueden desempeñar un papel en estos dos modelos queda por determinar [80].

Conclusión

TNF α y NGF, concertada a través de la participación de eventos de señalización NF κ B de la actividad y la orientación transcripcional NGF-responda células teniendo tanto la alta y baja afinidad para los receptores de NGF, convergen para estimular de nuevo la transcripción de iNOS. Nuestros resultados actuales son pertinentes a las condiciones neurodegenerativas como AD [22, 74], los accidentes cerebrovasculares [17, 75], ELA [20, 76] y la médula espinal de lesiones [8, 10], donde neuroinflammation y los altos niveles de citoquinas pro-inflamatorias han Se ha demostrado que desempeñan un papel significativo y propuso como objetivos terapéuticos.

Lista de las abreviaturas

AraC, cytosine β-D-arabinofuranoside; AD, la enfermedad de Alzheimer; BDNF, factor neurotrófico derivado del cerebro; BFCN, basal anterior neuronas colinérgicas; CNS, el sistema nervioso central; CRE, de AMP cíclico elemento de respuesta; GDNF, el factor neurotrófico derivado gliales; IGF , El factor de crecimiento tipo insulina; IL-1 β, la interleucina-1beta; iNOS, óxido nítrico sintasa inducible; MAPK, mitogen proteína quinasa activada; NF-κ B, factor nuclear kappa B; NGF, factor de crecimiento del nervio; NO, óxido nítrico; nNOS , El óxido nítrico sintetasa neuronal; NTR, neurotrophin receptor; PC12, feocromocitoma, PCN, la penicilina; PDTC, pyrrolidinedithyocarbamate; PSI, proteosome inhibidor; SDS, sodio dodecylsulfate; SEAP, secretada fosfatasa alcalina; SEM, el error estándar de la media; estreptococo, estreptomicina TNF α, factor de necrosis tumoral alfa; TrkA, como troponina-quinasa del receptor A; TTBS, tris-salina tamponada con entre 20;

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MST participó en la concepción y diseño del estudio, llevado a cabo la mayor parte de los experimentos, realizó el análisis de los datos, y redactó el manuscrito. PMJ participó en el diseño del estudio en particular, en cuanto a los experimentos de IGF. WZ participó en el diseño del estudio y la coordinación y la experiencia proporcionada por RTPCR y retirada experimentos. SUH clonado el sub-PC12 p75NTR (-) de las células y participó en el diseño del estudio y la interpretación de los resultados de experimentos con estas células. GT participado en la concepción, el diseño del estudio, la coordinación y la ayudó a redactar y revisar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Esta obra fue financiada en parte por el desarrollo de la investigación por la concesión de UTMB Sealy Dotada Fondo para la Investigación Biomédica. Michael Thomas es NIEHS el apoyo de un subsidio de capacitación de becas pre-doctorales de T32 ES007254 Sealy UTMB y el Centro para el Envejecimiento de becas pre-doctorales.