Folicular-dendríticas como células derivadas de monocitos humanos

Hasta el día de hoy, la ontogenia folicular de células dendríticas (FDCs) ha permanecido sin resolver [1, 2]. Incluso el trasplante de experimentos han dado lugar a resultados contradictorios [3 - 11]. Los investigadores contemplando una médula ósea han sugerido que el origen profesional de estas células presentadoras de antígeno se derivan tanto de la [5] linfoide o mieloide los linajes [10]; de monocitos en particular [12, 13], o incluso de las células del estroma de la médula ósea [6, 11, 14, 15]. Alternativamente, FDCs han sido reclamados se origine en los órganos linfoides local de los precursores mesenquimales [6, 7, 11, 14, 16 - 18]. Hasta el momento, sin embargo, no se dispone de protocolo para generar FDCs in vitro putativo de sus progenitores [2].

Los monocitos es cada vez más reconocido como la piedra angular de un sistema de diferenciación de plástico. En consecuencia, las conclusiones de un origen de los monocitos macrófagos [19] y las células dendríticas (CDs) [20]; (para revisión ver [21]] han sido complementadas por las pruebas concretas de que microglia [22] y [23] osteoclastos puede Como resultado de este tipo de células también. Más resultados recientes han puesto de manifiesto que incluso los osteoblastos [24], células de los nervios, hepatocitos [25] y las células endoteliales [26] puede ser generada a partir de monocitos ciertos subconjuntos. Por lo tanto, su notable capacidad de desarrollo fuertemente indica que el hecho representa un monocitos células madre somáticas.

Nuestros resultados anteriores demostraron que el hueso / hígado / riñón isoenzimas de Fosfatasa alcalina (AP), es también expresado en células obtenidas de ex vivo-explantados cuerpo extraño granuloma, así como en derivados de los monocitos in vitro granuloma. Co-expresión de CD68 asignado tales AP ^pos células mieloides al linaje. Curiosamente, se encontraron cultivadas de osteoblastos que se fagocíticas y co-AP y expresaron CD68. En conjunto, estos resultados firmemente implícita a osteoblastos y macrófagos se derivan de una fuente común [27, 28]. AP del hueso / hígado / riñón isoenzimas También se expresa por los osteoblastos, las células endoteliales activadas, retículo células del estroma [29]], así como por FDCs [30]. En consecuencia, la hipótesis de que AP expresión puede constituir un vínculo entre los monocitos y células mesenquimales [27]. En efecto, al tratar de identificar las señales de provocar AP expresión en monocitos, encontramos que transitoriamente hasta reguladas en el GM-CSF inducida por la proliferación de los monocitos culturas. AP expresión se mejoró aún más prolongada y por IL-4. En ausencia de IL-4, AP-regulado se redujo, mientras que los marcadores típicos de los osteoclastos, como tartrato resistente a la fosfatasa ácida y vitronectin receptor, se expresaron [27].

Nuestro presente trabajo tiene como objetivo determinar si FDCs pueden derivarse de los monocitos linaje. Como resultado de ello, presentamos pruebas de que en determinadas condiciones libres de suero altamente purificada monocitos humanos en diferenciar funcionalmente competente FDC-como las células. Las bajas concentraciones de Il-4 y GM-CSF en combinación con dexametasona (DEX) fueron utilizados para inducir AP expresión como una característica notable de estas culturas acompañado de algunas de las características más importantes de FDCs, expresión de CD35 [31, 32], Células B rosetting y emperipolesis [33], así como el antígeno de captura y retención por tiempo prolongado [34].

Monocitos humanos altamente enriquecido muy agotado de los linfocitos y cultivadas durante 12 o 15 días en presencia de IL-4 (25 U / ml), el GM-CSF (3 U / ml) y DEX (0,5 μ M), fuertemente adherido a El sustrato, exhibió múltiples formas, así como numerosas proyecciones y prosperó en las inmediaciones de una de la otra. Normalmente, estas variantes de células expresó enérgicamente AP (Fig. 1], con un máximo en el día 12. Estas células se conocen como primarias FDC-como las células. Para una máxima expresión de los tres inductores AP tenían que estar presentes para actuar sinérgicamente, mientras que el GM-CSF más IL-4 en la ausencia de expresión de DEX inducida AP, en menor medida, sólo (Fig. 2a-d]. IL-4 se podría sustituir por IL-13 (100 U / ml) (no demostrado).

Por triple tinción encontramos AP y AP ^{pos neg} células que expresan membrana CD35 (receptor de complemento I) (Figura 3a]. Ambos, AP ^pos, así como las células CD35 ^pos, podrían ser co-manchados de la monocitos / macrófagos marcador CD68, mostrando de este modo el origen mieloide de las células (Figura 3a]. Para el control, AP expresión está prácticamente ausente, y sólo de vez en cuando CD35 fue visto en paralelo monocitos culturas donde había sido inducido a distinguir en macrófagos (Figura 3b].

El común de leucocitos marcador CD45 está fuertemente regulada en el FDC-al igual que las células, evidentemente, correlacionando con expresión AP (Fig. 4a], en comparación con constitutivamente CD45 ^pos macrófagos (Fig. 4b].

Cuando cultivadas durante 14 días o más, homotipica agrupación espontánea, de células B rosetting y emperipolesis, así como mantener el antígeno en su forma nativa (véase más adelante) fueron verificable como característica características funcionales de FDCs. Para estos experimentos, inicialmente autólogo de células B (no se muestra) y posteriormente el de células B Raji línea fue empleada (véase la Fig. 5a, y 5b de células B rosetting y emperipolesis por la FDC-como las células).

Antígeno de la retención por un período más largo de tiempo puede considerarse como el más distintivo de la definición y la función de FDCs. Con el fin de investigar si los monocitos cultivados derivados expresar esta propiedad, se emplearon peroxidasa de rábano (HRPO) como modelo de antígeno, que ofrece la ventaja de ser fácilmente detectable por una norma HRPO sustrato de reacción. La enzima se ofreció en forma de complejos inmunes de IgG humana / HRPO-IgG anti-humano.

Complejos también fueron atrapados por los monocitos derivados de la FDC-como los macrófagos y las células. En FDC-como células HRPO sigue plenamente enzimáticamente activa hasta los 16 días de prueba (Fig. 6 bis, c]. En cambio, el control de los macrófagos había casi completamente degradadas de la enzima a las 4 y 16 días, respectivamente (Fig. 6b, d], ya observables después de 4 h (no se muestra). Inmuno-complejos fuertemente cargado células CD35 co-expresada como el típico marcador FDC (Fig. 6c], mientras que el control de los macrófagos sólo marginalmente expresaron CD35. Sólo una cantidad mínima de células reveló HRPO actividad (Fig. 6d].

Sobre la base de estas conclusiones, un fenotipo más maduro FDC fue diferenciable de la AP ^pos fenotipo bajo estimulación secundaria. Cuando day12 AP ^pos FDC-como las células fueron pulsados por un nuevo de 3 a 5 días con 10 ng / ml de TNF-α, que fueron inducidos por el aumento de expresión de ICAM-1 (CD54) (Fig. 7] y VCAM (CD106) Ligeramente hasta reguladas (Fig. 7c, véase también el cuadro 1]. En el control de los macrófagos culturas estos marcadores fueron vistos sólo de vez en cuando (Fig. 7b, d]. Las dos moléculas de adhesión, así como sellos distintivos de CD35 son funcionalmente competente FDCs in vivo [15, 35]. Culturas con el que se completa el TNF-β (LT-α) [36, 37] no mostraron efectos similares y hasta IFN-γ-CD54 sólo reguladas, pero reguladas por CD35 (no se muestra). Funcionales como marcadores de células B antígeno rosetting y retención no fueron más arriba-regulada por la estimulación secundaria (no se muestra).

A lo largo de todo el período de la cultura, la diferenciación de los monocitos derivados de serie se pusieron a prueba en dos días de intervalos de 5-bromodeoxyuridine (BrdU) incorporación. El máximo de 1% de las células positivas se midió a los pocos días de 6 a 10 (no expuestos). Este resultado claramente excluido el resultado de un determinado subconjunto de células (s) al tiempo que subraya directa derivación de células AP ^pos de monocitos.

Como una fuente alternativa, que utiliza derivados de los monocitos del 8 - 10 días a culturas en las que - como primer paso - la proliferación ha sido inducido con el GM-CSF a 25 U / ml. Células transferidos de esta condición, y de inmediato presentó a la FDC-inducir condiciones especificadas más arriba, dejado de proliferar y adquirió la primaria completa fenotipo de la FDC-como las células (no se muestra).

En el presente estudio, hemos demostrado por primera vez la generación in vitro de la FDC-como las células de los monocitos como putativo sus precursores. Monocitos humanos fueron preparados por la adhesión selectiva combinada con revertir la sedimentación como un nuevo procedimiento con el fin de eliminar la indeseable no adherentes poblaciones de células. Este protocolo permitió una virtual enriquecimiento de los monocitos al tiempo que se evita cualquier interferencia con anticuerpos planteando el riesgo potencial para la evocación de acontecimientos adversos de activación celular.

Nuestros datos demuestran claramente que los monocitos de sangre periférica pueden ser inducidas a differentiatiate en FDC-como las células. Similar a la anterior dilema sobre la ontogenia de células T-trópico células dendríticas (CDs) [21], la búsqueda del origen de FDCs siempre ha sido complicada por su inestable marcador de perfil, mostrando que FDCs aisladas de los órganos linfoides fácilmente perder típico antígenos Tales como la República Democrática del Congo-1, CD21, CD23, y en la cultura KiM4 [35, 38, 39]. Por razones prácticas, por lo que decidió tomar ventaja de un AP isoenzima que se ha descrito para ser expresadas por FDCs [30], pero no por los monocitos, los macrófagos y monocitos derivados de países en desarrollo (véase Tab. 1). En realidad, nuestros experimentos anteriores habían puesto de manifiesto que este marcador se ancla en monocitos inducible en determinadas condiciones, lo que sugiere AP expresión como indicativo para el desarrollo de la plasticidad de estas células [27]. Como un paso lógico, al intentar generar FDCs in vitro, se convierte primero en monocitos AP ^pos células, aquí denominado FDC primaria-como las células.

Típicamente, el antígeno leucocitario común CD45 está fuertemente regulada por AP en ^pos de células, así como en las células con morfología similar que sugiere una transdifferentiation en no leukocytic células. Ausencia de CD45 se ha descrito para FDCs por Schriever et al. [40]. La co-expresión de CD68, sin embargo, indica que el origen de los monocitos AP ^pos células.

Etiquetado de CD35 (receptor de complemento I) es de uso habitual en la histología de discriminar FDCs de otros tipos de células dendríticas, así como de histiocitos [31, 32]. En nuestro trabajo estable CD35 se expresa en monocitos derivados de la FDC-como las células. Una vez más, encontramos los monocitos / macrófagos marcador CD68 en las células CD35 ^pos que también fue evidente en CD35/AP co-expresión de las células. Control de los macrófagos se tiñeron sólo marginalmente o negativa para CD35.

Al establecer las condiciones para la generación de ^pos AP células, el suero fue encontrado a dar resultados variables. Por lo tanto, hemos desarrollado una completamente libres de suero diferenciación protocolo. Las bajas concentraciones de IL-4 y GM-CSF se encontraron más DEX para actuar como inductores básicos. Dentro de los 12 a 15 días de la cultura, estas condiciones suscitaron una celda que muestra los marcadores y las funciones de FDCs. Por el contrario, esta combinación de factores que impidieron la diferenciación de los macrófagos o células T trópico células dendríticas de monocitos.

IL-4 en las concentraciones de un orden de magnitud inferiores a los establecidos para la diferenciación de células T trópico países en desarrollo había sido demostrado para generar grandes aplanado y adherente con multa células dendríticas protuberancias. Esas células han mostrado para expresar tanto, AP, así como la mieloide marcador CD68 [27]. Nuestra próxima experimentos revelaron que la IL-4 puede ser sustituido con éxito por la IL-13, que será un objeto de nuevos estudios.

Es importante destacar que los corticosteroides como DEX AP sinérgicamente mayor expresión. DEX, anteriormente empleados para inducir osteoblastos de médula ósea mesenquimales derivados de células madre [41], se ha demostrado que inhiben la diferenciación de los macrófagos y DC [42]. Cuando la diferenciación de los monocitos FDCs, que ahora han encontrado que la IL-4 y el DEX en sinergia para inducir la AP ^pos fenotipo.

GM-CSF, que se aplicó sistemáticamente en bajas concentraciones parecía simplemente para servir como un factor de supervivencia, además de su contribución a la diferenciación. Su exigencia real es en gran medida dependiente de los donantes, lo que indica que el desarrollo de las propiedades de arranque monocitos pueden variar según el estado inmunológico del donante. Además, hemos experimentado que a veces exógenos GM-CSF puede ser omitido sin afectar a la diferenciación hacia células ^pos AP, que se podría explicar por una producción autocrina de GM-CSF por los monocitos en la cultura [43].

Tras 12-15 días de la cultura, la mayoría de los monocitos derivados de las células muestras de la AP ^pos fenotipo, aunque no proliferan a lo largo de este período de tiempo. Este alto porcentaje de células AP ^pos cuantitativos, por lo tanto, refleja claramente la diferenciación y monocitos argumenta en contra de la posibilidad de que la FDC-al igual que las células podrían haber ampliado de una pequeña población de células contaminantes.

Por otra parte, hemos utilizado los monocitos en la que - como primer paso - la proliferación ha sido inducido por la adición de GM-CSF en concentraciones más altas. Células transferidos de esta condición y presenta a la FDC-inducir condiciones adquirido la AP ^pos fenotipo también. Como consecuencia de ello, la combinación secuencial de la proliferación y diferenciación podría surgir como el método de elección cuando se considera la producción en gran escala de la FDC-como las células de monocitos, por ejemplo cuando se enfrentan con la necesidad de hacer uso de tales células aplicación terapéutica.

Membrana expresión de ICAM-Iy VCAM FDCs en que se ha descrito como un requisito previo para la interacción de las células B FDCs y dentro de los tejidos linfoides. Se encontró una fuerte sobre regulación de ICAM-I secundaria después de la estimulación con TNF-α. Sin embargo, que ya obtuvo funcionalmente competente FDC-como células capaces de células B antígeno rosetting y retención que expresó enérgicamente CD35 en el marco del TNF-α-condición básica gratuita.

Desarrollo funcional de los centros germinales, así como el mantenimiento de la función de la FDC ha afirmado que dependen en gran medida de la participación de los miembros de la familia del TNF (TNF-α y LT-α y β) [36, 37]. Generación in vitro de la FDC-como las células, tal como se describe en este documento, que parece ser en gran medida independiente de LT-α y β, mientras que el TNF-α puede causar una mayor maduración de la FDC fenotipo. La expresión de HLA-DR, que es controvertida, pero positivamente encontrado por algunos autores [35, 39], fue hasta regulada por el TNF-α y (Tabla 1].

Otros factores, sin embargo, inhibitoria. Linfocitos debían ser eliminadas, en la medida de lo posible - que, sobre todo cuando está activada, inhibe la observada transdifferentiation. En concreto, IFN-γ puede ser el factor principal: cuando se añade a los monocitos tan pronto como al inicio de la cultura, es estrictamente inhibido AP ^pos fenotipo, como hemos demostrado antes [27]. Cuando se añade en un segundo paso después de 12 días de cultura, el IFN-γ-regulado hasta la expresión de CD54, sino hacia abajo-CD35 regulado.

De la nota, especificando emperipolesis la prolongada engulfment de células B es una única propiedad que la FDC, en el marco de centros germinales, está implicada en la protección de internalizadas transitoriamente la apoptosis de las células B [33]. Se prevé que esta propiedad puede ser útil para preservar inmunogénica o tolerogenic B desencadenó células in vitro para su posterior aplicación clínica.

La identificación de estas nuevas células diferenciadas como FDC-como células culmina en la manifestación de almacenamiento de antígeno por largos períodos de tiempo en su forma nativa. Esta capacidad ha sido descrito como una característica única de FDCs [34], pero, a nuestro conocimiento, ni para otros tipos de células dendríticas ni por los macrófagos. Concretamente, en FDC-como el antígeno de las células, siempre HRPO-como los complejos de IgG, se mantuvo en una forma enzimática activa hasta 16 días a prueba. La actividad enzimática fue localizado perinuclearly. En contraste, los macrófagos eliminan el material en cuestión de horas. Otros estudios ponen de manifiesto la voluntad precisa cinética de la absorción, celular sub-distribución, el almacenamiento y la posible re-expresión en la superficie de la FDC ultraestructurales investigaciones.

Monocitos derivados de la FDC-al igual que las células pueden ser generados in vitro. Obviamente, uno pertinentes empleo de este sistema es impulsar en la mayor aclaración de las bases inmunológicas de las células B de memoria. Además, las culturas de FDCs amplias facilitar la investigación sobre los mecanismos subyacentes a la captura y preservación funcional de antígeno. Luego, debido a la retención de antígenos es que se sabe que son explotados por las entidades patógenos como el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) [44], así como priones [45], cerca de la investigación de estos procesos in vitro brinda la esperanza de un progreso importante en la Estas áreas. Por ejemplo, Smith et al. Demostrado muy bien en FDCs aislados humanos, y en modelos murinos igual, que la FDC-atrapado por VIH-1 sigue siendo altamente infecciosa durante largos tiempos, que parece ser debida a la protección de este virus de la degradación [46]. Por último, pero no menos importante, este novedoso protocolo podría prefigurar incluso después aplicaciones clínicas de la FDC autólogo FDCs o conservados células B similares a los que actualmente los estudios clínicos realizados con células T-trópico países en desarrollo. En conclusión, el presente hallazgos pueden abrir nuevos horizontes para descubrir los secretos de antígeno y almacenamiento de patógenos por FDCs, con evidentes implicaciones inmunológicos y clínicos.

Otros grupos han mostrado otros tipos de células a partir de monocitos transdifferentiate precursores. Sin embargo, todos estos estudios sufrido de la falta de unas condiciones determinadas (por ejemplo, utilizando el suero, los medios de comunicación o indefinido acondicionado-señales derivadas de linfocitos) y / o empleado una subfracción monocitos como iniciador en la población. En cambio, ahora introducir una vía común, y definir las señales necesarias, para permitir que los monocitos cuantitativamente a convertir en un estado de desarrollo de alta plasticidad de la que-al igual que las células FDC puede deducirse. Hay que destacar que nuestros resultados no per se dar una pista definitiva en cuanto a la vía normal de la diferenciación de la FDC. En realidad, contemplando la real existencia de dicha ruta principal diferenciación puede deshacer la principal vía de la generación de la FDC o una ruta de salvamento, respectivamente. Normal FDCs in situ expresar algunos marcadores mieloides como CD14 y CD68, pero no CD11b. Sin embargo, la FDC tumores se han descrito también para expresar CD68 [47 - 49]. En cualquier caso, la vía mieloide desribed aquí, obviamente, complementa nuestros hallazgos previos en la ontogenia de células T-dirigida países en desarrollo que en los monocitos [20] y sus precursores mieloides [50] pueden ser inducidas a convertirse en cuantitativo de células T-trópico países en desarrollo, Como ahora se reconoce.

Curiosamente, AP CD35 y expresión, así como el antígeno de captura se observó que de vez en cuando surgen espontáneamente en células individuales dentro de los macrófagos de control de las culturas. De este modo, se hace cada vez más evidente que los monocitos, los macrófagos, células T trópico países en desarrollo y FDCs pertenecen a un continuo desarrollo de un sistema de plástico de las células que son muy interconvertible. Más datos ampliar este fin de osteoblastos, que son poco diferenciadas de un subconjunto monocitos [24], lo que contribuirá a que nuestros resultados sobre la superposición de fenotipos entre los osteoclastos, osteoblastos, las células dendríticas y los macrófagos [27].

Por otra parte, como se mencionó antes, incluso clases de células generalmente se considera que el desarrollo distantes del linaje mieloide pueden ser fácilmente obtenidos de los monocitos cuando se proporcionan señales adecuadas. Por lo tanto, cuando reconoce los monocitos como una de las especies que antes eran ignorados células madre somáticas, parece poco probable que este tipo de células fascinante ya ha divulgado todo su potencial. No será realmente emocionante testimonio que ontogenéticas sorpresas y promesas terapéuticas el futuro podrá celebrar.

En este sentido, aporta pruebas de que los monocitos pueden ser transdifferentiated in vitro en células que se asemejan a FDCs por varios marcadores y funciones. Inmunocitoquímico co-coloraciones sugieren que las células tenían un origen mieloide. Una característica atractiva de nuestras conclusiones isthat theyprecisely describir los estímulos que permita una transdifferentiation de monocitos en células de la FDC-como se define en el suero sin condiciones. Como resultado de ello, al igual que las células FDC-ahora pueden ser cuantitativamente producidos in vitro por primera vez, con lo que ofrece un amplio espectro de aplicaciones que van desde la investigación básica a la clínica el empleo.

Leucocitos se obtuvieron de leukapheresis saludable de los donantes de sangre, además de con suero suministrado por el servicio de transfusión de sangre, Hospital Universitario, Goettingen. Células mononucleares fueron preparados por norma Ficoll-Hypaque (Nycomed, Oslo, Noruega) gradiente de sedimentación, diluido con PBS a una densidad final de 1,068, lo que resulta en un factor de enriquecimiento de monocitos de un 70%, y lavados libres de plaquetas. En algunos experimentos, se obtuvieron a partir de monocitos counterflow elutriation (Elutra, Gambro, Martinsried, Alemania). Las células fueron sembradas en microcubetas en 30,000 monocitos / así, en presencia de 10% de 0,45 μ m filtrada humanos agrupados en suero y se permite que se adjunte a una hora. Con el fin de obtener altamente purificada monocitos no inscritos células fueron separados de los monocitos por un ahorcamiento soltar técnica de aquí a que se hace referencia como revertir la sedimentación:-Piso inferior pozos se llenaron con medio de cultivo para formar un menisco convexo, la microplacas se convirtió entonces suavemente Boca abajo y cultivadas durante 2 h en la posición invertida. El soporte de células no inscritos se snicked off, y la adherencia de las células alrededor del 95% de pureza (FACS análisis de las células CD14 positivas, no demostrado) fueron cultivadas en más de 100 μ l de la diferenciación medio: CellGro medio libre de suero (CellGenix, Freiburg, Alemania) suplementado con N-acetil-L-alanil-L-glutamina (Biochrom, Berlín, Alemania), la penicilina y la estreptomicina (Biochrom), 10 ^-6 M dinatrium fosfato de dexametasona (Ratiopharm, Ulm, Alemania), 25 U / ml recombinante Humanos Il-4, 3 U / ml recombinante humano GM-CSF (R & D Systems, Wiesbaden, Alemania). Linfocitos, si bien presentes, además, fueron arrastrados por las aguas en el segundo día. Una vez a la semana, medio más aditivos se intercambiaron por completo. Durante toda la preparación de células y de la cultura se trató de minimizar la evaporación y paso a pH alcalino. Al día 15 se dieron por terminadas las culturas o, en su defecto, otros inductores (TNF-α recombinante, LT-α y β, IFN-γ (R & D Systems)) se añadieron al día 13, por otros tres días. Para el control, los macrófagos se diferenció en medio consistente en el 50% cada uno "Medio 199" y RPMI (Biochrom) suplementado con penicilina / estreptomicina y el 10% de calor-inactivadas suero humano (agrupados de 30 donantes sanos).

Procedimientos para la tinción de las células fueron fijadas en etanol / ácido acético (95% / 5%) durante 30 minutos o bien con frío metanol durante 5 min y 3 × rehidratada por lavado en agua destilada. Anticuerpos (de Dako, Glowstrup, Dinamarca, en caso de que no se indique lo contrario) se diluyeron en medio incrementado en un 10% de suero humano: anti-CD68 clon EMB11 1:100, anti-CD35 humano (FDC) 1:30, anti-CD54 humano 1: 800, anti-humano CD106 1:30, anti-humano HLA-DR 1:200, anti-CD45 humano 1:100, anti-CD22 humano 1:50, AP-IgM anti-humano 1:50, cabra-AP - IgG anti-ratón 1:30, anti-BrdU, (Amersham, Braunschweig, Alemania) sin diluir, ovino-PO-anti IgG de ratón, (Amersham) 1:300. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 ° C, la secundaria de anticuerpos a TA 45 min. Después de cada paso de incubación de los preparativos fueron lavadas con PBS. El PO-tinción, que contó con el H ₂ O ₂ (1 μ l / 5 ml) y diaminobenzidine (50 μ g / ml) en PBS / agua destilada 1:1. La AP-secundario conjugado con anticuerpos se detectaron Naphthol rápido / Rojo, Sigma Deisenhofen, Alemania, incluyendo el levamisol edogenous AP para inhibir la actividad. Tinción de los controles se realizaron por la omisión de anticuerpos primarios. El sustrato de las reacciones fueron observadas microscópicamente y se detuvo con PBS. Los preparativos fueron almacenadas en PBS / 1:1 glicerina a 20 ° C. Por immunodoublestaining la preparación después de la primera tinción procedimiento fue ampliamente lavados con PBS, el próximo inmunoticción se realizó con un anticuerpo secundario conjugado diferente.

El enzymecytochemical detección de AP se realizó con un kit de prueba de Sigma a la fabrica de acuerdo con instrucciones de la siguiente modificación: Las culturas se fijaron como se describe para inmunocitoquímica. La reacción de la enzima se llevó a cabo a TA 20 min.

Enzymecytochemical tinción se realizaron antes del inmunoticción. Después de la preparación enzymestaining fue 3 × lavado en agua destilada, la posterior inmunoticción se realizó como se describió anteriormente. Para más inmunoticción la preparación se lavan de nuevo ampliamente antes de la próxima inmunoticción se realizó con un anticuerpo secundario conjugado diferente.

La proliferación celular fue determinada por la incorporación de BrdU durante 24 h en los núcleos follwed por inmunomarcación con PO usando un kit de prueba de Amersham de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Con el fin de obtener agregados immunoglobulines una preparación purificada de inmunoglobulina (Polyglobin, Behringwerke, 10% de Ig en suero fisiológico) se utilizó en el 10% en PBS e incubadas durante 60 min a 60 ° C.

Raji células (células B humanos línea) se utiliza como una fuente de los linfocitos B. Para demostrar rosetting o emperipolesis, las células Raji fueron cocultured a las 3 × 10 ⁴ células / microtitulación con los monocitos derivados de las células. Después de 4 horas, las culturas se fijaron con etanol / ácido acético manchado, como el anterior y evaluados microscópicamente.

Peroxidasa de rábano (Calbiochem, Bad Soden / Ts, Alemania) se ha empleado como modelo de antígeno. La enzima se ofreció en forma de complejos inmunes de Ig humana (Behringwerke Marburg, Alemania), HRPO-IgG anti-humano (cabra), más HRPO de cabra anti-IgG para mejorar la reacción. Inmunocomplejos que se añadieron al 10% en el día 12 y el 15 por 30 minutos, posteriormente se cambió el medio. Después de más de incubación de hasta 16 días, los cultivos fueron fijadas con metanol durante 5 min. Y teñidas con peroxidasa como se describe para inmunocitoquímica y reaccionó durante unos 10-15 min. La reacción fue detenido por un lavado con agua destilada.

DH ha propuesto la AP ^pos fenotipo a ser el vínculo para FDCs. Ella ha creado el principal protocolo para la generación de células AP ^pos de monocitos, así como la mayoría de los experimentos. JHP ha desarrollado la novela describe los monocitos de depuración, introdujo el uso de Il-13, como equivalentes a Il-4. Él contribuyó al marco teórico.