Genetic Vaccines and Therapy, 2005; 3: 7-7 (más artículos en esta revista)

Un combinado nucleocapsid vacuna induce vigorosa SARS-CD8 + T de la respuesta inmune celular

BioMed Central
Ali Azizi (aliazizi555@yahoo.ca) [1], Susan Aucoin (saucoin@cheo.on.ca) [1], Helina Tadesse (htade096@uottawa.ca) [2], Rita Frost (frost@cheo.on. Ca) [1], Masoud Ghorbani (mghorbani@yahoo.com) [1], Catalina Soare (catalinasoare@yahoo.com) [1], Turaya Naas (turayanaas@hotmail.com) [1], Francisco Díaz-Mitoma ( Diaz@cheo.on.ca) [1]
[1] Enfermedades Infecciosas y Vacunas del Centro de Investigación, Hospital de Niños de Eastern Ontario Research Institute, 401 Smyth Road, Ottawa, ON, K1H 8L1, Canadá
[2] Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Ottawa, Ottawa, ON, K1H 8M2, Canadá

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Resumen

Varios estudios han demostrado que las células de la respuesta inmune mediada por desempeñar un papel crucial en el control de la replicación viral. Como tal, un candidato debe obtener la vacuna contra el SRAS amplia CD8 + T de la respuesta inmune celular. Varios grupos de ratones fueron inmunizados solo o en combinación con SARS-nucleocapsid inmunógeno. Un alto nivel de SRAS específicos-CD8 + T-respuesta celular se demostró en ratones que recibieron de ADN que codifica el SARS-nucleocapsid, proteínas XIAP y como coadyuvante. También observó que la administración conjunta de un plásmido que expresa nucleocapsid, proteínas recombinantes y montanide / CpG induce altos títulos de anticuerpos de los ratones inmunizados. Además, esta vacuna enfoque merece una investigación más a fondo como una posible vacuna contra el SRAS.

Introducción

La epidemia de SRAS había una alta tasa de mortalidad, así como un enorme impacto económico en todo el mundo. El tratamiento con fármacos antivirales o una vacuna eficaz no está disponible para la protección contra esta enfermedad [1, 2]. El SARS-CoV es un solo varados ARN-virus que ha sido identificado como un nuevo tipo de coronavirus. El genoma es de unos 30 kb de largo y contiene cuatro proteínas estructurales: la espiga, sobre, la matriz nucleocapsid y en el mismo orden que otros coronavirus [3, 4]. Sin embargo, el análisis de secuencias de SARS-CoV con otros miembros de la familia coronavirus no mostraron más de 20% de homología de nucleótidos [5].

El SARS-NC gen codifica una proteína de 46 kDa que participa en la transcripción y replicación del virus e interfiere con el ciclo celular de las células de acogida [6]. Estudios anteriores en otros coronavirus miembros sugieren que esta proteína es altamente inmunogénica y puede ser un buen blanco para el diseño de una vacuna eficaz [7 - 10]. La expresión de NC en células CHO llevó a la observación de que esta proteína se pliega espontáneamente en partículas similares al virus (VLP). Estas partículas son efectivamente incorporadas en varias etapas del ciclo de vida del virus, incluido el montaje, gemación de las células, y el receptor vinculante que conduzca a la fusión de membranas. Las partículas virales presentes también a los antígenos el sistema inmune en una estructura que imita el virión infecciosas [11 - 13].

Vacunas de ADN son capaces de inducir tanto humoral y celular y la respuesta inmune han demostrado su eficacia en varios modelos experimentales [14, 15]. Hay varios eucariotas vectores recombinantes que expresan proteínas de manera eficiente. Sin embargo, la captación de antígenos y su presentación son elementos fundamentales en las estrategias de vacunación de ADN. Una de las estrategias para aumentar la potencia de las vacunas de ADN es para prolongar la supervivencia de las células presentadoras de antígenos (APC), en especial las células dendríticas. Estudios anteriores muestran que la supervivencia de las células dendríticas está en el aumento de la presencia de factores anti-apoptóticos como XIAP. Este enfoque ha resultado en una mayor cantidad de antígeno específico de los linfocitos T CD8 + [16, 17].

CD8 + específicas de las células T juegan un papel importante en el control de la infección viral [18 - 20]. La activación de las células CD8 + específicas resultados en la secreción de citoquinas inflamatorias (IFN-γ y TNF-α) [21] y la síntesis de moléculas efectoras, como perforin y granzymes que mata a las células infectadas, la disminución de la replicación del virus y el virus de la carga [22, 23].

En el presente estudio se caracteriza celular y la respuesta inmune humoral a la infección por SARS-CoV en los ratones que recibieron una ADN-NC construir solo o en combinación con proteínas y diferentes adyuvantes. La combinación de DNA-NC, proteínas XIAP y suscitó una importante lucha contra el SRAS CD8 + T-independiente de la respuesta de células T CD4 + de la respuesta inmune celular.

Materiales y métodos
Cultivo de células

De ovario de hámster chino (CHO), las células fueron cultivadas a 37 ° C, 5% de CO2 en la Iscove modificado Dulbecco Medio (IMDM: Sigma, St Louis, MO) y se complementa con 10% de suero fetal Becerro (FCS: Life Technologies, Grand Island, NY), 100 U / ml penicilina y 100 μ g / ml gentamyin.

Construcción de plásmidos de ADN

ARN total fue purificado utilizando un kit de extracción RNeasy (Qiagen, Mississauga, Ont) de los tejidos de los pulmones autopsia de un paciente que murió a causa de SARS. A la escuela para pedir NC (1,2 kb) gen fue amplificado utilizando primers específicos (avance ejemplo: 5'-ggatccatgtctgataatggaccc-3 '; invertir ejemplo: 5'-gaattcttatgcctgagttgaatc-3'). La amplificación fue purificado utilizando el kit de extracción QIAquick gel (Qiagen) y clonado en el PCR 2,1 TOPO-TA vector (Invitrogen, Burlington, Ont) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la digestión del plásmido, la banda de 1,2 kb correspondiente a la CN-gen fue clonado en sub-BamHI EcoRI y sitios de pVAX-1 que contiene un promotor CMV alto nivel de expresión in vivo. El fragmento fue también sub-clonado en el pEF6-Myc/His (Invitrogen) y pQE vectores (Qiagen). El pEF6 vector fue diseñado para producir más de proteínas recombinantes en células de mamíferos y las líneas se utilizó para establecer una línea celular estable mediante el uso de un gen resistente blasticidine. El vector pQE Tri sistema se utiliza para la producción de proteínas en las bacterias. Estos vectores permiten en última instancia, para la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad inmovilizados metal. Todas las construcciones de expresión fueron confirmados y se caracteriza por las enzimas de restricción y análisis de secuencias de nucleótidos.

Expresión de la proteína recombinante nucleocapsid

JM109 células CHO y las bacterias fueron transfectadas con pEF6 y pQE vectores que contienen NC vector o solo. Con el fin de aumentar y mantener la expresión de la proteína NC, NC estable expresando CHO línea celular se estableció utilizando blasticidine-complementado medio. Las células fueron cosechadas, sonicated y lisadas en buffer de lisis (25 mM Tris base, 2,5 mM Mercaptoethanol, 1% Triton-X100 y un cóctel de inhibidores de la proteasa). Cell pellets se centrifuga y el sobrenadante se incubó con el TALON metal resina (Clontech, Palo Alto, CA) durante una hora. Después de la incubación, la mezcla de resina de proteínas-se añadió a las columnas y lavados tres veces con 20 volúmenes de cama Tris-Cl, NaCl (pH 8). La proteína recombinante se eluye con 150 mM imidazol.

Para confirmar las proteínas, las muestras se mezclaron con tampón de carga Laemmli, hervida por 5 minutos y cargado en un 10% en gel de poliacrilamida. Las proteínas fueron luego transferidos a una membrana de nitrocelulosa por electroforesis transferencia. Las membranas fueron bloqueadas con 5% de la leche en polvo en PBS-Tween 20 (PBS-T) y se incubaron con 1 / 3000 de dilución de un suero de un paciente de SRAS durante tres horas a temperatura ambiente. Después de un lavado con PBS-Tween, la blots fueron incubadas con IgG anti-humano conjugado-HRP (BioRad, Hercules, CA) durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, los blots fueron lavados y se incubaron con reactivo ECL (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) por un minuto y expuestos a la película de rayos X (Kodak).

Microscopía Electrónica

Células CHO transfectados con el ADN, ya sea expresando NC vector o vector de ADN por sí solo fueron cosechadas y lavadas con PBS. Pellets fueron fijadas con glutaraldehido al 2%. Las células fueron lavadas dos veces en sodio 0,1 M cacodylate buffer a 4 ° C. Las células fueron fijadas con un 2% de Tetróxido de Osmio de 2 horas a 4 ° C. Después de un lavado con agua destilada, las células fueron deshidratados con un aumento de la concentración de etanol y embebido en resina espolón. Thin fueron teñidos con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las secciones fueron seleccionados utilizando una JEOL 1010 en microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Adyuvantes

CpG oligodeoxynucleotide (5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3 ') fue proporcionada por Coley (Ottawa, ON). Montanide ISA-51 aceite mineral adyuvante se adquirió de Seppic Inc (París, Francia). El pcDNA3 construir expresando 1,5 kb XIAP gen que codifica un anti-apoptóticos producto génico es una especie de regalo del doctor Korneluk RG [24].

Vacunación Animal

Seis a ocho semanas de edad, los ratones hembra B6/C3/F1 (Charles River, St Constant, PQ) fueron vacunados por vía subcutánea en la base de la cola con 50 μ g de ADN construir expresar el gen nucleocapsid, 5 μ g de proteína nucleocapsid y 50 μ l Montanide de ISA-51 (Seppic) / 30 μ g CpG (Coley), o 50 μ g pcDNA3-XIAP en cada vacunación. Cada ratón fue impulsado tres veces, en un mes intervalos. Catorce días después de que el último impulso, los ratones fueron sacrificados y su bazo y la sangre se recogió para la realización de nuevos ensayos o para el almacenamiento a largo plazo en medio de criopreservación.

Medición de anticuerpos por ELISA

96 y placas de ELISA fueron recubiertos noche a la mañana a 4 ° C con la proteína NC, y los pozos se lavaron con PBS que contenía 0,05% de Tween 20 y luego bloquearon con 1% de BSA en PBS. Serie de suero fue diluido añadido y se incubaron durante 2 horas a 37 ° C. Las placas se lavaron y se incubaron durante 2 h con un 1 / 2000 de dilución de un conjugado peroxidasa-afinidad-purificado de conejo anti-ratón secundaria de anticuerpos (Bio-Rad, Richmond, CA). Las placas se lavaron tres veces y desarrollado con O-phenylendiamine dihidrocloruro de sustrato (OPD) (Sigma, St Louis, MO). La reacción de color se detuvo con HCl 1N y se leyó absorbancia a 490 nm con un lector de placas de ELISA (Bio-Rad).

Proliferación de ensayo

Esplenocitos de ratones inmunizados fueron resuspendidos en el 2 × 10 6 células / ml en RPMI 1640 con 10% FCS, de 50 μ M β-mercaptoetanol y 100 U / ml penicilina / estreptomicina. A 100 μ l alícuota que contiene 2 × 10 5 células se añadió a cada pocillo de una placa de 96 así. La proteína NC (100 μ l en el 20 μ g / ml) se añadió a cada pocillo por triplicado. Como control positivo, las células también se estimuló con forbol 12-myristate 13-acetato y ionomycin (PMA / ION). Después de 72 h de la cultura, 1 μ Ci [3 H] timidina (Amersham, Arlington Heights, IL) se añadió a cada pocillo. Después de 16 h de incubación, las células fueron cosechadas en fibra de vidrio y filtermats incorporación de timidina se midió con un contador beta Microbeta (Wallac, Turku, Finlandia).

Tinción intracelular de citoquinas

Sangre fresca y esplenocitos de ratones inmunizados IMDM se cultivaron en los medios de comunicación en presencia de 10 μ g / ml brefeldin A (Sigma) y estimuladas in vitro con la proteína NC (10 μ g / ml), expresada en bacterias. En cada experimento, un control negativo (sin estimulación), control positivo (PMA / ION) y una proteína irrelevante (VIH-1 gp120 proteína) se incluyó en el control de la producción espontánea de IFN-γ. Dieciséis horas después de la incubación, las células fueron lavadas una vez (1600 rpm durante 5 min), con 3 ml de PBS / 2% FCS / 0,01% Azida y de superficie-manchado durante 15 min con la etiqueta PE-Ab ratón para CD3, TC-etiquetados para Ab Ratón CD4 o CD8 α (Caltag Laboratories, Hornby, ON). Las células fueron lavadas que el anterior, fija y permeabilized utilizando 100 μ l de cada una de AyB, la fijación de permeabilización solución (Caltag Laboratories). Las células se tiñeron con intracelularmente ratón anti-IFN-γ-FITC Ab etiquetados y se incubaron durante 30 min (en la oscuridad) a 4 ° C. Tras el lavado, las células fueron analizadas por FACScan (Becton Dickinson, Mississauga, ON). Un aumento de 0,1% de la producción de IFN-gamma de las células durante el control no se considera como respuesta positiva a la vacunación.

ELISPOT ensayo

Multipantalla-HTS placas (Millipore, Bedford, MA) fueron recubiertas con 10 μ g / ml de anti-IFN-γ ratón anticuerpos (mAb AN18, Mabtech, Mariemont, OH) en PBS más de la noche a 4 ° C. Las placas fueron lavadas con PBS y bloqueado con IMDM con 10% FCS y 100 U / ml penicilina / estreptomicina durante 1 h a temperatura ambiente. El medio se eliminaron y 4 × 10 5 suspensión celular (100 μ l / así), incluido el SRAS NC proteína expresada en bacterias (10 μ g / ml) o irrelevantes antígenos en la misma concentración se agregaron y se incubaron durante 30 horas a 37 ° C. Después de la incubación, las células fueron retirados; placas fueron lavadas con PBS +0,05% Tween 20 y se incubaron con 1 μ g / ml de anti-biotina ratón anticuerpos IFN-γ (mAb R4-6A2-Biotina, Mabtech) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de más lavados, 100 μ l / así de 1 / 2000 Estreptovidina-ALP-PQ (Mabtech) en PBS + 0,5% FCS se añadió y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron que el anterior y desarrollados con 100 μ l por pocillo BCIP / NBT fosfatasa alcalina (Moss Inc) durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con enjuagar los platos con agua del grifo. El número de puntos se analizaron con un lector de ELISPOT.

Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar En cada experimento se utilizaron cuatro animales por grupo. El t-test se aplicó en el análisis estadístico de los datos. El valor de p menor o igual a 0,05 fue considerado significativo.

Resultados
La construcción de los vectores de ADN y la expresión de SRAS-nucleocapsid proteína en bacterias y células de mamíferos

Para aumentar la potencia de la respuesta inmune específica, la de larga duración NC se amplificó por RT-PCR y ligated en plásmido pVAX-1 bajo el control del citomegalovirus humano promotor. Para la expresión y la purificación de la proteína recombinante NC en células CHO y bacterias, el gen fue amplificado NC también sub-clonado en pEF6-Myc/His y pQE Tri-sistema de vectores. NC expresar proteínas, las células CHO y E. coli (JM109) fueron transfectadas con pEF6 y pQE vectores de genes de codificación de la NC, respectivamente. Para aumentar el rendimiento de la proteína recombinante, una línea estable de células CHO se creó mediante un selectivo blasticidine gen resistente, lo que permite un eficiente purificación de la proteína recombinante. Las células fueron cosechadas, lisadas y las proteínas recombinantes fueron purificados de acuerdo con los métodos estándar. La expresión de la proteína NC transfectadas en células fueron verificados por el Western Blot (Fig 1] y la tinción de inmunofluorescencia CHO células infectadas con el vector-NC o el vector solo. Antibody planteadas en conejos a la NC proteína expresada en bacterias reaccionado enérgicamente en la región perinuclear del SARS-NC-CHO línea celular (datos no presentados).

La asamblea de NC proteínas en partículas similares al virus (VLP)

Las células CHO transfectadas con pEF6-NC solos o vector se examinaron por microscopía electrónica de transmisión. Observamos paquetes de VLP de la misma como la morfología de las partículas de tipo salvaje tanto dentro como fuera de las células infectadas por el pEF6-NC. Sin embargo, ni el modelo de transfectadas las células, ni las células transfectadas con el vector viral-por sí solo mostró como partículas (Fig 2]. Estas observaciones demuestran que nuestra expresión de la construcción de las proteínas sintetizadas NC suficiente proteína dentro de las células infectadas para facilitar la formación de VLPs.

La detección de títulos de anticuerpos en ratones inmunizados con la vacuna candidata combinaciones

Para el análisis de los títulos de anticuerpos contra NC, cinco grupos de ratones fueron cebados y reforzado con SARS-nucleocapsid inmunógeno solo o en combinación. Dos semanas después del último impulso, el suero fue recolectado y títulos de anticuerpos se determinó por ELISA. El grupo recibió de proteínas y montanide / CpG mostró una media mayor título de anticuerpos IgG en comparación con el grupo que recibió el vector de ADN + XIAP y ADN-NC solo. Este grupo (NC proteína + montanide / CpG) también mostró un título de anticuerpos ligeramente mayor en comparación con el grupo recibió ADN-NC + NC y proteína XIAP. Sin embargo, el más alto de SARS-CoV-respuesta de anticuerpos específicos se detectó en ratones inmunizados con una combinación de ADN-NC, proteínas y montanide / CpG (Fig 3].

Combinación de ADN, la proteína recombinante y XIAP inducir mayor nivel de CD8 + T de la respuesta inmune celular

Para evaluar si la vacunación con nucleocapsid mediada por células aumenta la respuesta inmune, y la sangre fresca esplenocitos de ratones inmunizados fue recuperado, estimulado, y teñidas de superficie CD4 y los linfocitos T CD8 +, así como el interferón gamma intracelular. El nivel de la producción de IFN-γ de células T CD4 + en sangre fresca (Fig 4] y esplenocitos (datos no presentados) de los ratones inmunizados no demostró una significativa de células T CD4 + de respuesta contra el SARS-NC proteína. Sin embargo, el grupo que recibió NC-DNA, de proteínas y montanide / CpG demostrado mayores niveles de IFN-γ que producen los linfocitos T CD4 +.

Esplenocitos también fueron estimulados con proteínas NC, y la proliferación de linfocitos CD4 se realizó con tritio, la timidina. Sin embargo, una alta proliferación de las células-T no se detectó con este ensayo (datos no presentados).

Inmune mediada por células respuestas fueron evaluadas por tinción intracelular de citoquinas. El grupo que recibió DNA-proteína NC + NC y Montanide / CpG suscitó mayores niveles de CD8 + T-nucleocapsid a las células en comparación con los grupos receiveing DNA-proteína NC NC o más adyuvante. Sin embargo, el más alto NC-CD8 + específicas de células T se detectó respuesta en ambos esplenocitos (datos no presentados) y la sangre fresca (fig. 5] en ratones que recibieron la construcción del ADN, la proteína recombinante NC y XIAP adyuvante.

Para confirmar los resultados obtenidos por la tinción intracelular de citoquinas, que llevó a cabo una ELISPOT IFN-γ de ensayo para medir NC-específica de células T respuestas de los esplenocitos de ratones inmunizados. Los grupos de ADN + XIAP, DNA-proteína NC y NC + montanide / CpG no mostraron un alto número de células in situ (SFC). IFN-γ potentes respuestas se observaron en los ratones inmunizados con la combinación de DNA-proteína NC + NC y adyuvantes (fig. 6]. Sin embargo, tras la sustitución de los adyuvantes montanide / CpG con XIAP, SFCs fueron más de dos veces mayor (p = 0,01). Aunque, IFN-γ puede ser producido por tanto estimulada antígeno CD4 + y CD8 + T las células, más probable es que el IFN-γ observó respuesta fue generado por efectoras CD8 + T-células, citometría de flujo demostró desde los linfocitos T CD8 + como los principales productores de IFN - Γ en este estudio.

Discusión

La epidemia de SRAS se encuentra actualmente bajo control. Sin embargo, la ausencia de un agente terapéutico eficaz en contra de este virus letal, agravado por la amenaza de su resurgimiento, ha dado pie a los esfuerzos de investigación para desarrollar una vacuna eficaz. Estudios previos indican que el pico de proteína es responsable de la unión del virus a la enzima de conversión de angiotensina 2 (ACE2) [25 - 27]. El pico de proteína contiene epítopos que pueden obtener anticuerpos neutralizantes en la acogida de especies por lo que resulta un buen objetivo para el desarrollo de una vacuna contra el SRAS [28 - 31]. Sin embargo, la mutación de esta proteína podría afectar a la virulencia de los virus que permite a escapar de la respuesta inmune específica [32, 33]. Otros grupos de investigación han hecho esfuerzos para desarrollar vacunas basadas en virus nucleocapsids ya que estas proteínas virales han conservado regiones. Milich McLachlan y mostró que la viral nucleocapsid contiene células T dependientes e independientes epítopos. Desnudo (athymic) ratones inmunizados con el VHB-nucleocapsid solos desarrollar altos títulos de IgM, IgG2a y IgG2b anticuerpos que son los predominantes en Th1 respuestas de anticuerpos [34]. Hay pruebas de que la estructura específica de plegado nucleocapsids viral es responsable de su alta inmunogenicidad [35].

El éxito de la inmunización depende de varios factores, como el tipo de antígeno, la vía de administración y el uso de adyuvantes. Mittal et al. [36] mostró que los ratones inmunizados por vía intramuscular, por vía intraperitoneal o subcutánea tienen mayores títulos de anticuerpos de los ratones inmunizados por vía oral o por vía intranasal. En este estudio, los ratones fueron vacunados por vía subcutánea, ya que la vía de administración se ha utilizado con éxito en el pasado [37 - 39].

Hemos promovido la respuesta inmune con adyuvantes montanide ISA-51/CpG o XIAP. Montanide es un adyuvante basado en aceite mineral que aumenta la respuesta inmune no específica [40, 41]. Se ha probado en ensayos clínicos y que tiene un buen perfil de reactogenicidad, por lo que es una coadyuvante ideal para uso humano. [42 - 44]. En una vacuna contra el VIH candidato estudio, que demostró que puede inducir fuerte montanide los títulos de anticuerpos contra el VIH-1 genes estructurales (gp120, gag y pol). CpG se encuentra también entre los más utilizados experimental adyuvantes; este adyuvante estimula las células dendríticas a través de Toll-like receptor 9 (TLR9), la inducción de maduración de las células y la mejora de la presentación antigénica y de las respuestas Th1. [45 - 47]. La combinación de montanide y CpG se investigó a la luz de un reciente estudio que demuestra que esta combinación es más efectiva que el uso de cualquiera de los adyuvantes solas [48]. Un grupo de ratones recibió XIAP como adyuvante basado en el hallazgo por Kim et al. Que los ratones inmunizados con el ADN de codificación XIAP muestran una fuerte respuesta inmune mediada por células contra el melanoma. Kim et al. Hipótesis fuerte de que esta respuesta puede ser debido a una mayor supervivencia de las células dendríticas o células T in vivo [16, 17].

Nucleocapsid tiene un papel fundamental en el ciclo de vida viral y podría ser un objetivo potencial para mejorar la respuesta inmune. También es de interés como un portador de partículas conservadas CD8 + T-epítopos de células que podrían ser adecuados para el desarrollo de una vacuna eficaz para el SARS-CoV.

Con el fin de caracterizar la respuesta inmune específica en nuestro candidato vacunas contra el SRAS, se utilizó una proteína recombinante expresada en bacterias de ensayos in vitro para la detección de CD4 + y CD8 + respuestas de células T, mientras que las vacunas contiene una proteína recombinante expresada en células CHO. Idealmente, los péptidos se usan para estimular respuestas CD8 + efectoras, sin embargo, todavía no es viable desde NC epítopos CTL todavía no se caracteriza en esta cepa de ratones. Es probable que las VLP son procesados por células presentadoras de antígenos y los epitopos presentes en un contexto MHC I, como lo sugiere el aumento de CD8 + T-cell respuestas observadas después de la vacunación.

Varios estudios han evaluado el SARS-CoV-NC proteínas como candidato vacuna. Por ejemplo, Wang et al. [49] mostraron una baja respuesta proliferativa a NC en ratones BALB / c que reciben un vector de ADN que expresa la proteína NC. A la debilidad de las células T CD4 + de respuesta también se observó en nuestro estudio. Dos estudios analizaron más humoral y celular mediada por la respuesta inmune en ratones inmunizados con vacunas de ADN expresando NC [50, 51]. Kim en al. Mostró que la vinculación de NC calreticulin aumento de la proteína a humoral y celular la respuesta inmune en los ratones vacunados en comparación con los ratones que recibieron ADN-NC solo. No hemos detectar un alto nivel de células T CD8 + respuesta inmune en ratones inmunizados con ADN-NC NC proteína o solo. Sin embargo, la inmunogenicidad de la vacuna de ADN nuestro candidato codificación NC fue mejorado con la co-administración de la proteína recombinante nucleocapsid y adyuvantes.

Zhu et al. Muestran un alto nivel de títulos de anticuerpos en ratones después de tres inyecciones de ADN-NC. Sorprendentemente, no detectar un alto nivel de títulos de anticuerpos en ratones inmunizados con ADN-NC solo.

En resumen, nuestros resultados indican que la inmunización con diferentes adyuvantes podría influir en el tipo de respuesta inmune. Los ratones que recibieron el ADN, las proteínas y montanide / CpG mostraron un alto nivel de los títulos de anticuerpos específicos contra NC. Sin embargo, la vacunación con combinaciones de ADN-NC, NC proteína recombinante y XIAP puede agregar a la amplitud de células mediada por la respuesta inmune. Estos resultados sugieren un nuevo enfoque para producir una vacuna eficaz contra la infección por coronavirus del SRAS.

Abreviaturas

XIAP: ligada al X inhibidor de la apoptosis.

NC: Nucleocapsid

Agradecimientos

Damos las gracias al personal de la instalación animal en la Universidad de Ottawa por su asistencia. Agradecemos a los Dres. Katrina Gee y Neera Malik de la lectura crítica del manuscrito.