Journal of Nanobiotechnology, 2005; 3: 9-9 (más artículos en esta revista)

Microscopía de fuerza atómica: una potente herramienta para imágenes de alta resolución de espermatozoides

BioMed Central
Sunil Kumar (sunilkumar1@gmail.com) [1], Koel Chaudhury (koel@smst.iitkgp.ernet.in) [1], Prasenjit Sen (psen0700@mail.jnu.ac.in) [2], Sujoy K Guha (Guha_sk@yahoo.com) [1]
[1] School of Medical Science and Technology, Indian Institute of Technology, Kharagpur 721 302, India
[2-110067, India

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Resumen

Microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en la única técnica capaz de tiempo real de imágenes de la superficie de una célula viva en la nano-resolución. Desde AFM proporciona la ventaja de observar directamente la vida biológica de las células en su medio ambiente, esta técnica ha encontrado muchas aplicaciones en farmacología, biotecnología, microbiología, la biología estructural y molecular, la genética y otros campos relacionados con la biología. AFM también ha demostrado ser una herramienta valiosa para los biólogos reproductiva. Una revisión exhaustiva sobre las diversas aplicaciones de la AFM a células de esperma se presenta. AFM ha sido ampliamente aplicado para la determinación de la estructura y características topológicas de los espermatozoides. Unstained, no fijadas espermatozoides fisiológicas naturales en sus alrededores se pueden visualizar por esta técnica que proporciona valiosa información sobre las características morfológicas y patológicas defectos en células de esperma como imágenes tridimensionales con detalles topográficos precisos. Defectos de la cabeza espermática y el acrosoma en la punta de la cabeza responsable de la fertilización, puede ser examinado y correlación con la falta de integridad funcional de la célula. Cantidad considerable de trabajo se informó sobre los detalles estructurales de la cromatina muy condensada en la cabeza utilizando esperma AFM. La información detallada de las imágenes 3D topográficas de espermatozoides adquiridos por AFM se espera que proporcione un mejor entendimiento de las diversas vías de reproducción que, a su vez, puede facilitar la mejora de la gestión de la infertilidad y / o el desarrollo de anticonceptivos.

Introducción

Morfología de los espermatozoides es considerado como un importante factor pronóstico para la fecundación y el embarazo [1]. Anormales de la morfología de los espermatozoides es uno de los factores más comunes de la infertilidad masculina. Cambios morfológicos también son considerados como un blanco potencial en el desarrollo de anticonceptivos. Existe, por lo tanto, una necesidad urgente para el análisis de las alteraciones morfológicas de los espermatozoides en su casi medio ambiente fisiológicas con mayor detalle.

Microscopía de fuerza atómica (AFM) ha abierto nuevas vías de estudio en biología reproductiva. AFM, inventado por Binnig, Quate y Gerber, en 1986, se ha convertido en una potente técnica de imagen para obtener nanómetro-resueltas datos topográficos imágenes. En resumen, la muestra de superficie es de trama escaneados por un cantilever flexible con una punta afilada en un extremo. Un rayo láser se centró en la parte posterior del cantilever es devuelto fuera y es detectado por un fotodiodo detector. La capacidad de esta técnica de imagen no conductor células vivas en el medio ambiente fisiológico (solución acuosa) en la gama 3D sin elaborar o de la preparación de la muestra a diferencia de la fijación de las muestras convencionales de microscopía electrónica (que exige que las células que se fije con aldehído y manchado) ha hecho AFM Un instrumento valioso para estudiar diversas biomoléculas [2 - 4], incluidas las células de esperma [5]. AFM de imágenes en el aire requieren células que se fije para evitar los cambios estructurales causados por las fuerzas de secado de la celda [6]. Sin embargo, esta fijación no requiere posteriores a la fijación como en microscopía electrónica. Convencionales de microscopía no sólo distorsiona la morfología de los espermatozoides, pero también es incapaz de proporcionar alta resolución de las imágenes en 3D, debido al pequeño tamaño de los espermatozoides. Microscopía óptica proporciona información valiosa sólo si las alteraciones son graves y de la orden de un micrón o fracción.

AFM proporciona la ventaja de observar espermatozoides directamente en su entorno lo que abre la posibilidad de analizar excitante sus aspectos estructurales y funcionales en el sub-nivel molecular. Este artículo ofrece una revisión de las imágenes morfológicas y topológica de las células de esperma utilizando AFM. Esas imágenes de alta resolución se espera que proporcione una mejor comprensión de la infertilidad masculina, mejorar la tasa de éxito de los procedimientos de ART y también dar una nueva orientación hacia el desarrollo de anticonceptivos.

Morfológicas y cambios patológicos de espermatozoides

La figura 1 muestra las imágenes 2D y 3D de la normal de espermatozoides humanos sin contacto utilizando el modo AFM; el gráfico se indica la longitud de la cabeza y los perfiles de la cabeza región. Defectos en la región acrosomal menudo puede conducir a la pérdida de la competencia funcional de los espermatozoides. La principal ventaja de AFM en los estudios patológicos de espermatozoides es que permite la evaluación de la posición y la forma del acrosoma. Microscopía electrónica de investigación revela la presencia de nano-surcos o "canales" en la parte superior de la flagelo de espermatozoides sanos [7] mientras que AFM proporciona información topográfica precisa. Esta técnica ha sido empleada con éxito para el estudio de esperma humano en su medio ambiente natural y reconstruido las imágenes 3D que mejora el contraste de resolver detalles tales como las mitocondrias que rodean el axoneme esperma en la pieza media [4]. Una estructura organizada en la región flagelar axoneme además de depresiones de la membrana que no puede ser observado con el microscopio convencional ha sido reportado. El contraste de imágenes en 3D mecanismo se ha utilizado para estudiar las estructuras de las células de esperma bovino [8]. Los resultados demuestran que los espermatozoides de imagen en condiciones fisiológicas proporciona más puntos de vista nativo de las células debido a la retención de estructuras citoplasmáticas, que son de otra manera fácilmente perturbadas por las fuerzas de secado.

AFM se ha utilizado para el análisis morfológico y morfométrico de acrosoma intacto y acrosoma reaccionado esperma humano-cabezas [9]. Los cambios estructurales de los espermatozoides de hámster jefe de superficie asociados a la maduración, capacitación y reacción acrosomal También se ha estudiado el uso de esta técnica [10]. Los cambios en la membrana plasmática en la cabeza de mamíferos de la región después de los espermatozoides durante el desarrollo testicular, después de la eyaculación, y después de la exocitosis acrosomal vesicle se han comunicado [11]. Morfológicos y topológicos alteraciones en espermatozoides humanos inducida por un no hormonales anticonceptivos para hombres polyelectrolytic in vitro han sido examinados usando AFM, que sugería casi completa desintegración de la membrana plasmática, con la consiguiente ruptura de la membrana acrosómica conduce a la dispersión de acrosomal contenido [12]. Un estudio más reciente de Takano et al. (2004) proporciona los detalles de los cambios en la estructura de superficie del ratón espermatozoides del epidídimo asociado a la maduración [13]. Saeki et al. (2004) han proporcionado detalles acerca de los espermatozoides similares cabeza de acrosoma, segmento ecuatorial, puesto región acrosomal y cuello durante la reacción acrosomal inducida por lysophosphatidylcholine se dan [14]. Además, un análisis numérico realizado por el grupo de investigación indica que la zona del plano sagital medial de la parte anterior del acrosoma de espermatozoides reaccionó jefes es de aproximadamente 40% inferior a la de los jefes intacta.

Alteraciones morfológicas de los espermatozoides que conduzca a oligoasthenoteratozoospermia (OAT) y asthenozoospermia han sido analizados mediante el AFM [15]. Este estudio indica claramente alteración en el infectados espermatozoides y proporciona amplia información sobre los cambios morfológicos en la cabeza, cuello y flagelo. Estudios similares han mostrado cambios dimensionales en la cabeza y cuello y flagelo defectuoso en espermatozoides de los pacientes con varicocele de presentación de informes [16]. Los recientes trabajos en este campo supone la aplicación de la AFM al estudio morfológico y topográfico cambios causados por el VIH y los efectos de la terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA), el espermatozoide de los pacientes infectados por el VIH [17]. El estudio fue tan eficaz que, incluso detalles como la posición de las partículas virales encuentra en la membrana de los espermatozoides y su fusión en la superficie de los espermatozoides fueron detectados con alta precisión. A diferencia de la microscopía electrónica, y otros microscopios convencionales, una de las mayores ventajas de la AFM es que las imágenes viriones en su casi medio natural, que puede ser muy beneficiosa en la determinación de la interacción de los viriones con el anfitrión.

Topología detallada de las especies bovina y espermatozoides curvas de la fuerza frente a distancia se ha obtenido usando el modo de contacto AFM [18]. El acrosoma, midpiece, postacrosomal segmentos flagelo y se distingue claramente debido a la altura de las variaciones locales. Un modelo global de la respuesta mecánica de la célula que permite separar la respuesta mecánica de la superficie local se presenta interacciones. Este modelo difiere de los modelos tradicionales de Hertz en contacto, de uso común en el AFM, de forma explícita, teniendo en cuenta la mecánica de la biomembrane y citoesqueleto [19]. Con este modelo matemático es posible determinar el grado de deformación de la membrana debido a la neta de las fuerzas generadas por la AFM en la punta de espermatozoides. Modelado similar se reporta para el análisis de la deformación de los espermatozoides bovinos vivos [20]. Un modelo para medir la respuesta mecánica de las células durante el reconocimiento microscopía de fuerza (RFM), en donde ciertas moléculas que se adjunta a la AFM punta escanear la superficie de la célula, que, a su vez, proporciona información vital sobre la interacción intermolecular se ha propuesto.

Axonemal imágenes

Axoneme, un "9 + 2" disposición de los microtúbulos en el que nueve exterior doublet microtúbulos rodean un par de simples microtúbulos, desempeña un papel importante en el movimiento de los espermatozoides. La flexión de los cilios y flagelos se atribuye a dynein inducida por deslizamiento de microtúbulos, que es un paso clave en la generación de la fuerza. Una función transversal de los microtúbulos se prevé sobre la base de la circulación de 3D motores dynein es decir, un movimiento en una dirección en ángulo recto con el eje longitudinal de axonemes. Esto ha sido confirmado usando óptico de captura [21] y la microscopía electrónica [22], que proporcionó información valiosa sobre la biomecánica de sus movimientos. Recientemente Sakakibara et al. (2004) han logrado demostrar que estas usando AFM transversal de las mociones se producen en una forma oscilatoria cuando la axonemes de esperma de erizos marinos flagelos adherirse a sustratos de vidrio [23]. Se informó además de que Mg-ATP aumenta significativamente la alta frecuencia de las oscilaciones flagelo. Ambos, horizontal, así como un componente vertical de oscilación se observa cuando la AFM punta está en contacto con la axonemes. Un estudio similar sobre los detalles estructurales y de la densidad de carbono en el flagelo de espermatozoides de erizos de mar se ha llevado a cabo por Tomie et al. (1991) [24].

Estudios de la cromatina espermática

ADN, presente en un estado altamente condensado de mamíferos en células de esperma, se visualiza con éxito por primera vez en ambos, el aire y los líquidos por Allen et al. (1993) [25]. El estado de cromatina muy compacto en el esperma jefes de pulpo E. Cirrhosa ha sido estudiada con gran detalle [26]. Un simple, eficaz aire de secado técnica para la preparación de muestras AFM demembranated Xenopus esperma de los cromosomas ha sugerido [27]. Sin artefacto, de alta resolución nuclear reensamblaje imágenes se obtuvieron mediante esta técnica. Bandeo cromosómico patrón de altura usando AFM similar a la de G-convencionales de bandas por microscopía óptica se informa por De Grooth et al. (1992) [28]. La capacidad potencial de AFM en la localización de las sondas de ADN en los cromosomas hibridizada in situ utilizando el patrón de altura se ha estudiado. Synaptonemal complejo de rata espermatocitos proporcionar detalles estructurales de la proteína se ha observado también por este grupo.

Protamines, pequeñas proteínas ricas en arginina, son las principales proteínas que unen el ADN en el núcleo de los espermatozoides de la mayoría de los vertebrados y el paquete de ADN en un volumen inferior al 5% de un núcleo de células somáticas. La unión de protamina a la cromatina espermática genera un gran complejo hidrofóbicas densa que la estructura de la cromatina espermática difícil para examen microscópico. AFM imágenes de la propagación bien aislados núcleos de esperma antes de someterse a tratamiento hipotónico mostraron grandes estructuras nodular y una menor nucleosome como partículas cerca de la periferia del núcleo presente en la cromatina [29]. Del mismo modo, una unidad de embalaje en forma toroidal de la cromatina espermática de mamíferos también se ha observado [30]. Un método novedoso para la reconstitución de la cromatina de esperma para investigar la condensación del ADN por protamina 1 se propone [31]. Aquí las estructuras formadas de que se depende en gran medida de diversas condiciones de preparación de la muestra utilizada para la reconstitución. Un estudio anterior de Allen et al. (1992) demostraron que la cinta como imágenes obtenidas de la cromatina con protamina son complejos debido a la convolutions de la punta de imágenes y la morfología de la muestra [32]. Un estudio similar sobre la organización estructural de la cromatina de los espermatozoides subunidades de dos especies de marsupiales, Smithopsis crassicaudata y Trichosurus vulpecula se ha llevado a cabo utilizando AFM [33]. Los resultados indican que la región nucleohistone consta de las agrupaciones más grandes de nódulos en comparación con nucleoprotamine básicos región. Un muy interesante estudio sobre AFM cromatina espermática y sintéticas de ADN protamina complejos se informa por Balhorn et al. (2000) [34]. El complejo imita el aumento de la resistencia y la semejanza estructural de la cromatina espermática nativos.

AFM se ha utilizado para realizar las mediciones de volumen de la esperma humano núcleos por Lee et al. (1997) [35]. Sus resultados indican que los espermatozoides normales y las siete de las nueve clases de cabeza de forma han estudiado las anomalías nucleares volúmenes idénticos, aunque las proyecciones de las áreas y formas de los núcleos puede variar ampliamente. Es interesante mencionar aquí que los resultados mostraron 25-40% de los espermatozoides de morfología encontró la cabeza no son causados por factores que inciden en el volumen de la cromatina de los espermatozoides, como el contenido de ADN de los espermatozoides núcleo, las diferencias en la organización de la cromatina, o la Grado de compactación del ADN. Estudios similares en los cambios de volumen en el ratón y el esperma de toro núcleo se han llevado a cabo utilizando microscopio de fuerza por Allen et al. (1996) [36]. Sus resultados dieron detalles de la medida de la hidratación de la cromatina de los espermatozoides en su estado nativo. Por lo tanto, el volumen de esperma nativa hidratado núcleos pueden ser fácilmente determinado.

Las perspectivas para el futuro

Constante de la fuerza aplicada sobre el suave muestras biológicas pueden dañar las células y, por tanto, cambiar su morfología. Teniendo en cuenta esto, distintos modos de imagen se han desarrollado, tales como el modo de aprovechar la base de resonancia, ascensor modo, la modulación de imágenes de la fuerza, nanoindenting, pinchazo y microscopía de fuerza lateral. El desarrollo de las pequeñas micro-mecanizado basculantes y de fibra óptica consejos reducir el ruido térmico, proporcionando un mejor ratio de cantilever rigidez y la frecuencia de resonancia y la mejora de la imagen de ancho de banda. Un acontecimiento importante será la construcción de anticuerpos modificados consejos que podrían ser de utilidad en la localización de los antígenos (por vertical o lateral de la fuerza de detección) en la membrana plasmática. Esto puede ser útil en el estudio de interacciones moleculares en mayor detalle.

AFM, en sí mismo, ha demostrado ser un poderoso instrumento en nanoscopic análisis de las muestras biológicas. Sin embargo, la información con más detalles se puede lograr si se combina con otras técnicas como el microscopio óptico [37] y pinzas ópticas [38] ya que estas técnicas permiten la manipulación directa de las células individuales. Los avances en Cryo-AFM son muy prometedores para obtener imágenes de espermatozoides preservados en nitrógeno líquido [39, 40]. Esta técnica, en combinación con la congelación de grabado y técnicas de congelación-fractura, pueden ser utilizados para obtener imágenes de alta resolución de conservas de espermatozoides.

Lapso de tiempo de imágenes de AFM se ha utilizado para observar los cambios conformacionales de supercoiled DNA [41] y en el complejo acompañante (GroEl-GroEs) el análisis [42]. Pequeños cantilevers con altas frecuencias de resonancia han sido desarrollados por Walters et al. (1996) [43]. Además, los pequeños y constantes de la primavera de los dispositivos electrónicos de gran ancho de banda han sido incluidas en el AFM para obtener un potente modo de película útil para la digitalización de biomoléculas, sucesivamente, en solución acuosa [44]. Este modo de imágenes sofisticado puede aplicarse para una mejor comprensión de la interacción ovocito esperma.

Cerca de campo de escaneo óptico Microscopio (SNOM) es una nueva técnica y es todavía en la infancia con respecto a la imagen de las células biológicas. Esta técnica utiliza el campo cercano, la no propagación de los componentes de la luz para escanear las muestras con consejos óptico, que se puede aplicar en el modo de tocar o de contacto. Una resolución de algunas decenas de nanómetros es alcanzable por SNOM. Topográficos de alta resolución y óptica de imágenes de erizo de mar esperma flagelo se han obtenido utilizando como sonda fluorescente de luz [45]. Microscopía de Fuerza electrostática (EFM), la Fuerza de mediciones magneticas (MFM) y Microscopía de barrido térmico (SThM) son relativamente nuevas técnicas y puede desempeñar un papel importante en la determinación de la dinámica de fluidos y la biomecánica de las células de esperma en su micro-entorno natural. AFM, en combinación con la superficie potencial de la espectroscopía, se ha aplicado para medir la superficie de cargos p. Falciparum merozoites [46]. Esta metodología puede aplicarse también al estudio de distribución de la carga negativa sobre la cabeza de los espermatozoides, que se sabe que juega un papel vital en la fertilización.

Los acontecimientos recientes en el AFM han hecho una poderosa herramienta para el análisis de biomoléculas. En la última década, AFM ha surgido como una técnica valiosa con amplias aplicaciones en el campo de la biología de los espermatozoides. AFM se espera que proporcione un mejor entendimiento de las diversas interacciones biológicas y de las vías de interacción que se abren nuevas posibilidades en la medicina reproductiva.

Contribuciones de los autores

SK ha contribuido a la adquisición de una parte de los datos mediante la realización de estudios experimentales sobre AFM espermatozoides tratados con los anticonceptivos, RISUG. PS también ha prestado asistencia en la adquisición y análisis de datos. Además, ha realizado una amplia encuesta de la literatura y recogidos los datos y documentos de investigación. KC ha concebido el estudio y contribuyó a la elaboración, análisis, la coordinación y la interpretación de los datos. SKG, el inventor de RISUG, también ha participado en el diseño, el manuscrito revisado críticamente importante para el contenido intelectual y ha dado la aprobación final de la versión que se publicará. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India para proporcionar apoyo financiero necesario para el estudio.