BMC Clinical Pathology, 2005; 5: 9-9 (más artículos en esta revista)

Convencionales de base líquida técnicas versus Cytyc Thinprep ® procesamiento de las muestras de orina: un enfoque cualitativo

BioMed Central
Eric Piaton (eric.piaton @ chu-lyon.fr) [1], Jacqueline Faÿnel (secretariat.cytologie @ chu-lyon.fr) [2], Karine Hutin (secretariat.cytologie @ chu-lyon.fr) [2] , Marie-Claude Ranchin (secretariat.cytologie @ chu-lyon.fr) [2], Michèle Cottier (Michele.Cottier @ univ-st-etienne.fr) [3]
[1] INSERM U.407/Université Claude Bernard Lyon 1, Faculté de Médecine Lyon Sud, 69495 Pierre Bénite Cedex, France
[2] Laboratoire de Cytopathologie, Hôpital Edouard Herriot, Place d'Arsonval, 69437 Lyon Cedex 03, Francia
[3] Laboratoire d'Histologie, CHRU de Saint-Etienne, Hôpital Nord, 42055 Saint-Etienne Cedex 2, France

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Resumen
Antecedentes

El objetivo de nuestro estudio fue comparar objetivamente Cytyc Thinprep ® y otros métodos de obtención de capa delgada citológico preparativos (cytocentrifugation, smearing directa y filtración Millipore ®) en la orina cytopathology.

Métodos

Thinprep diapositivas se compararon con frotis directa en 79 casos. Cytocentrifugation llevado a cabo con la Thermo Shandon Cytospin ® 4 se comparó con Thinprep en 106 casos, y la comparación con Millipore de filtración seguido de secante se obtuvo en 22 casos. Se evaluó la calidad de puntuación por celularidad, la fijación, los glóbulos rojos, leucocitos y anormalidades nucleares.

Resultados

Los datos muestran que 1) permite la buena smearing general para la obtención de resultados, 2) Cytocentrifugation con reutilizables TPX ® cámaras deben evitarse, 3) Cytocentrifugation usando cámaras desechables (Cytofunnels ® ® o Megafunnel cámaras) da excelentes resultados iguales o superando Thinprep y 4 ) Millipore de filtración debe evitarse, debido a su mala calidad global. A pesar de las diferencias en la calidad, las técnicas estudiadas no tienen ningún impacto en la precisión diagnóstica como evaluado por la tasa de anomalías.

Conclusión

Llegamos a la conclusión de que los métodos convencionales, como cytocentrifugation siguen siendo las más apropiadas para el tratamiento actual de las muestras de orina. Cytyc Thinprep de procesamiento, debido a su costo, puede ser utilizado esencialmente para la citología basada en estudios moleculares.

Antecedentes

Más de 50000 nuevos casos de carcinoma urotelial, lo que representa el 90% de los casos de cáncer de vejiga se diagnostican cada año en Europa y en América del Norte [1]. Aproximadamente el 70% de los carcinomas son urotelial vesical superficial (TNM etapa pTa-1) y pueden ser vistos, diagnosticados y tratados por cistoscopia ayuda de biopsias y resección transuretral [2].

A pesar de que es reconocida como la norma biológica para el diagnóstico y seguimiento de tumores de vejiga, citología urinaria tiene una sensibilidad media de alrededor del 50% y que se ve obstaculizada por una gran cantidad de muestras de diagnóstico no [3]. Aunque la citología urinaria detecta aproximadamente el 80% de agresivo, de alto grado (G3), tumores del urotelio, siendo algunos resultados falsamente negativos, en especial en aquellos pacientes que habían TUR o bacilo de Calmette-Guérin inmunoterapia. En la práctica urología, cistoscopia se combina con citología urinaria, en especial en la búsqueda de alta calidad siempre que sea su ubicación en el tracto urinario.

Citología de base líquida (LBC) ha sido desarrollado como un reemplazo a cytocentrifugation y / o smearing, debido a las capacidades de recuperación de las células y una mejor preservación de células. LBC Algunos métodos utilizan un proceso de filtración y un sistema asistido por computadora delgada capa de deposición de las células (Cytyc Thinprep ® suministrada por Cytyc Corp, Boxborough, MA), mientras que otras se basan en un proceso de sedimentación (AutoCyte PREP ® suministrada por TRiPath Imaging, Burlington, Carolina del Norte). En la orina, el uso de Cytyc Thinprep 2000 resultados en el aumento de celularidad y la marcada reducción de los desechos, los glóbulos rojos (RBC) y cristales [4 - 7].

Sin embargo, la optimización de la captura y fijación de células, así como la deposición de capa fina de las células que se puede lograr por otros métodos más LBC, en particular durante el uso de métodos modernos cytocentrifugation [7]. En nuestra experiencia sobre la base de 2500 ejemplares / año durante 15 años, y siempre se siguen los requisitos específicos, frotis directo y con la cytocentrifugation Shandon Cytospin ® 4 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA) producir especímenes citológicos altamente satisfactorio.

En consecuencia, el objetivo de nuestro estudio fue 1) a analizar objetivamente la calidad de las muestras de orina procesadas por un órgano convencional de los métodos de capa fina en comparación con Cytyc Thinprep LBC y 2) para verificar si se observó diferencias tienen un impacto en el diagnóstico de la enfermedad.

Métodos

La población del estudio estaba compuesta de 224 muestras de orina tomadas en los pacientes con síntomas que sugieran cáncer de la vejiga (hematuria macroscópica, trastornos de micción, infección urinaria crónica) en 89 casos (39,7%), seguida o después de la resección transuretral de carcinoma urotelial vesical en 135 casos (60,3 %).

Se tomaron muestras de orina después de la cistoscopia en 157 casos (63,8%), y después de la micción simple en los demás casos. Todas las muestras fueron fijadas inmediatamente con un 50% de etanol (V / V) o con un 20% Polyethyleneglycol 1500 (Merck, Darmstadt, Alemania) en 50% de solución de etanol (1 / 3 fijador y 2 / 3 de orina).

Se enviaron muestras de orina al laboratorio y separados en dos alícuotas después de homogeneización. Una de las alícuotas fue procesada de acuerdo con el Thinprep LBC recomendaciones, y la otra fue procesada de acuerdo a un método de difamación, por cytocentrifugation o por filtración.

Cytyc Thinprep procesamiento *

El Thinprep 2000 autómata permite delgada capa de células preparativos que debe facilitarse gracias a un proceso de filtración: después de la TransCyt ® filtro se ha sumido en la muestra, que gira a gran velocidad y facilita la dispersión de células y mucosidad. A continuación se aplica el vacío para el filtro, que recoge las células en un 5 μ m porosidad membrana. Un programa de software permite una deposición homogénea de las células hasta la saturación. El TransCyt filtro se invirtió y una presión positiva permite a las células a que se adhieran a un electronegative diapositiva. Después de la inserción de otro TransCyt filtro y de otra diapositiva, todo el procedimiento puede repetirse hasta que el conjunto de la muestra ha sido tratado.

Las muestras de orina estudiadas fueron procesadas de acuerdo a las instrucciones para no mucoide fluidos: las muestras se mezcla con una solución que contenga Cytolyt ® metanol, mucolítico y hemolítica agentes y luego se centrifugó a 600 G durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, el pellet de células se mezcla con una solución PreservCyt ® y tratado por el procesador Thinprep 2000. Thinprep diapositivas se utilizaron en todos los casos.

Smearing revestidos en diapositivas

Comparación de la LBC con frotis se realizó en 79 casos. Después de la centrifugación a 600 G durante 10 minutos y cuidado de eliminar el sobrenadante, el pellet de células de aspiración y se unta en una delgada capa de recubrimiento (glicerina / albúmina según Mallory, Bayer Diagnostics, Puteaux, Francia) depositados previamente en dos Superfrost ® Plus diapositivas (Menzel-Gläser, Braunschweig, Alemania). Las láminas fueron fijadas inmediatamente con un Cell-Fixx ® (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA) spray y se permite que dessicate a temperatura ambiente (RT) durante al menos 1 hora antes de la tinción de Papanicolaou.

Cytocentrifugation métodos

Comparación de la LBC con cytocentrifugation se hizo con el Thermo Shandon Cytospin ® 4 en 106 casos. Después de la centrifugación a 600 G durante 10 minutos, hipocelular muestras de orina (<20 μ l de células "pellets") se muestra cytocentrifuged con cámaras de hasta 0,5 ml. Por el contrario, las muestras de orina con un gran pellets fueron tratados con gran volumen de muestras cámaras.

El sistema utiliza Cytospin centrifugación y principios de absorción de líquidos y permite la deposición de una capa delgada de células redondas o rectangulares en las zonas. El proceso de deposición de las necesidades que la muestra se colocan cámaras y encerrados en acero inoxidable Cytoclip ® dispositivos de montaje. Con el fin de probar los diversos tipos y cualidades de la muestra se utilizó cámaras:

1) de tres años de edad ronda reutilizables, en autoclave cámaras diseñadas para muestras de hasta 0,5 ml (TPX ® cámaras con una zona de deposición de células, de 6 mm de diámetro, lo que permite a 28 mm 2, se exhibirá) en 44 casos,

2) ronda cámaras desechables diseñados para muestras de hasta 0,5 ml (solo Cytofunnel ® con una zona de deposición de células, de 6 mm de diámetro, lo que permite a 28 mm 2, se exhibirá) en 31 casos,

3) gran volumen de las cámaras desechables diseñados para muestras de hasta 6 ml (Megafunnel ® cámaras con una zona de deposición de células, de 21 × 24 mm, lo que permite 294 mm 2, se exhibirá a) en 31 casos.

Dos diapositivas de 28 mm 2 área de cribado (por 1 ml de orina), y una diapositiva de 294 mm 2 de cribado zona (de 6 ml de orina) se prepararon para cada ejemplar estudiado.

Especialmente marcados revestidos Cytoslides ® proporcionada por Thermo Shandon se utilizaron. Aunque no es necesario, diapositivas procesados con TPX muestra las cámaras tenían un tratamiento adicional con una gota de glicerina / albúmina depositados en el área de la muestra.

Métodos de filtración Millipore

LBC se comparó con Millipore de filtración seguido de secante de células en diversas diapositivas en 39 casos, a fin de probar la adhesividad a los diversos tipos de venta en el comercio con revestimiento diapositivas. La orina se filtra a través de Magna ® MCE filtros de membrana de nitrocelulosa, tamaño de poro 5 μ m, de 25 mm de diámetro colocado en un Swinnex ® dispositivo adjunto a un 60 ml Luer-Lock ® jeringa (Bioblock Científico, Illkirch, Francia).

Después de completar la filtración y la eliminación de los filtros de membrana, el secante Fue representada por primera vez en Polysine ® diapositivas (Menzel-Gläser, Braunschweig, Alemania) en 8 casos, pero la adhesividad obtenido fue demasiado afectada para posibilitar la continuación de los ensayos. A continuación, utiliza Cytyc Thinprep diapositivas en 9 casos, pero finalmente optamos Superfrost ® Plus diapositivas y Snowcoat X-tra ® diapositivas (Surgipath Europe Ltd, Peterborough, Inglaterra), igualmente para los 22 casos restantes.

El uso de estos procedimientos, la zona de deposición de células resultante es de 25 mm de diámetro, permitiendo que alrededor de 491 mm 2 a someterse a las pruebas.

Frotis se tiñeron con tinción de Papanicolaou hipocrómica [8] antes del análisis.

Análisis de los criterios morfológicos

Un solo patólogo (PE), en comparación convencionales LBC y diapositivas usando un microscopio Olympus BHS. Las láminas fueron colocados uno al lado del otro y se analizaron bajo × Plan 10, Plan 40 y Petróleo × PlanApo x63 objetivos. La calidad global de las diapositivas fue evaluada por la puntuación celularidad, la fijación de células, número de glóbulos rojos, glóbulos blancos y de los cambios degenerativos de las células del urotelio. La presencia de grupos de células y agrupaciones también se midió. Se prestó especial atención a las características potencialmente celular alterada que indica la transformación maligna - aumentó N / C ratio, hyperchromatism nuclear, la forma irregular nuclear, nucleolos prominentes y mitosis - que se describió anteriormente [9].

Todas las características celulares fueron codificados de 0 a xxx en función de su grado de anormalidad.

Urotelial células fueron reconocidos como malignos, de alto grado, cuando se mostró el aumento de N / C ratio, hyperchromatism nuclear y marcadamente irregular nuclear fronteras o nucleolos prominentes. Ellos fueron reconocidos como neoplásicas, de bajo grado, cuando formaban frondas papilares que demuestra el aumento de N / C, y el índice ligeramente nuclear de forma irregular, o cuando numerosas células alargadas con ligeras anomalías nucleares puede demostrarse, tal y como se describe en la literatura [9, 10] .

Citológico resultados se clasificaron como positivos o negativos para urotelial células tumorales, cualquiera que sea su grado. Normal, inflamatorias, degenerativas y las condiciones de reacción de las células del urotelio fueron consideradas como negativas, así como urotelial atypias de significado.

Datos numéricos fueron analizados utilizando pares de la serie de pruebas de Chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher, cuando proceda, y un nivel de probabilidad de 0,05 fue considerado como significativo.

Resultados

Utilizando el sistema de puntuación, tal como se describe en la sección Materiales y Métodos, y considerando una escala de 0-3, promedio y las desviaciones estándar, así como la significación estadística de cada parámetro se muestran en la Figura 1, 2, 3, 4, 5.

Las diferencias de calidad observó preocupación mundial (celularidad y fijación combinado), por una parte, el número de glóbulos rojos y glóbulos blancos por el otro. Sorprendentemente, encontramos que permitió la obtención de un frotis de calidad mundial superponibles a los de Cytyc Thinprep diapositivas (Figura 6]. Más precisamente, la celularidad puntuaciones obtenidas por frotis y LBC fueron 1,97 ± 0,86 frente a 1,96 ± 0,68, respectivamente (p = ns), mientras que los valores de fijación fueron 2,58 ± 0,48 frente a 2,50 ± 0,59 (p = ns).

Cytocentrifugation con 3 años de edad reutilizables muestra las cámaras de ellos hubo una importante disminución de la celularidad y la fijación tanto de calidad, mientras que cytocentrifugation con cámaras desechables de muestra (cualquiera que sea el tipo de cámara utilizada) permite obtener los mejores resultados (Figura 7].

Millipore de filtración dado lugar a alteración de las células, incluso después de secante preservación de las células de revestimiento de diapositivas y una cuidadosa fijación.

La concentración de RBC se redujo significativamente después de LBC tratamiento de las muestras en todas las circunstancias, salvo en el uso de filtración Millipore * 5 μ m porosidad membranas. Comentarios similares pueden hacerse respecto de los leucocitos.

Cualquiera que sea la técnica de estudio, la búsqueda de grupos de células y atypias dio resultados idénticos que los de LBC excepción de los frotis, que mostró un porcentaje ligeramente mayor (p = 0,01). Sin embargo, los valores obtenidos no fueron sorprendentemente diferentes.

Discusión

Ya en los finales de los años setenta, los autores han tratado de comparar cytocentrifugation con otros métodos, tales como la filtración [11, 12]. En los estudios preliminares, se encontró filtración Millipore para dar una mejor recuperación de células y mejores detalles morfológicos que cytocentrifugation. Sin embargo los métodos utilizados (reutilizables muestra de las cámaras) fue subóptima: una importante pérdida de células puede atribuirse a la rugosidad de la cámara muestra paredes secundaria a las repetidas limpieza [13].

Esperando el "noventa era necesario para la obtención de las comparaciones entre la Cytyc Thinprep LBC y otros métodos, con algunos resultados contradictorios. Muchos de los estudios, publicados como resúmenes de las 40 ª y 41 ª Sesiones Científicas Anuales de la Academia Internacional de Citología, no se transformó en toda la longitud de artículos [4, 5, 14, 15].

Salvo en un estudio que puso de manifiesto el tiempo de procesamiento y los costos varias veces mayores para Cytyc Thinprep LBC que para policarbonato filtración por membrana [15], la mayoría de serie reconocer ventajas en el uso de LBC. En un reciente estudio que comparaba cytocentrifugation a Cytyc Thinprep, Cytospin preparativos se encontraron superior a la LBC, en términos de detalles citomorfológico y la preservación de los patrones de arquitectura [16]. Sin embargo, la ventaja relativa de LBC limpia de antecedentes se señaló.

Cytocentrifugation LBC y no son los únicos métodos disponibles para mejorar la precisión diagnóstica: potencialmente interesantes resultados fueron previamente demostrada por Albright y Frost [17]. Utilizando un simple gradiente de densidad para separar las células atípicas de las células normales después de la fijación con el método Saccomanno, los autores fueron capaces de enriquecer hasta 20 veces el cáncer de células atípicas y fracción. A nuestro entender no obstante, estos resultados no se han reanudado en una fecha posterior.

Un estudio más reciente se evaluó la calidad y el coste de AutoCyte PREP versus cytocentrifugation de muestras de orina en un laboratorio general [18]. Se demostró que el método Cytospin, a pesar de más largo tiempo de preparación, había 1) cribado más corto tiempo, 2) mayor número de células de diagnóstico, 3) la fijación y la tinción mejor calidad que la AutoCyte PREP. Además, el método Cytospin se encontró 7 veces menos costoso que el método AutoCyte * PREP.

En cuanto a los métodos convencionales, los valores obtenidos en nuestra serie muestran que a pesar de las diferencias en la calidad, las técnicas estudiadas no tienen ningún impacto en la precisión diagnóstica como evaluado por la tasa de anormalidades (nuclear características de células y grupos). Acerca de cada técnica estudiada, las siguientes observaciones se puede hacer:

1. Smearing permite la obtención de buenos resultados globales de los precios más bajos. Sin embargo, el cribado ya hace tiempo el método subóptima. Además la glicerina / albúmina recubrimiento utilizado hace inútil para inmunocitoquímica diapositivas o de otros estudios moleculares,

2. Cytocentrifugation reutilizables con cámaras deben evitarse renovación anual si no se puede garantizar,

3. Millipore de filtración seguido de secante de las células de revestimiento de diapositivas debe evitarse, debido a la mala calidad global y de alto costo,

4. Cytocentrifugation usando cámaras desechables (Cytofunnels o Megafunnel cámaras) da excelentes resultados iguales o superando LBC si se considera celularidad, la fijación y la comodidad para el cribado.

En relación coste-eficacia de las comparaciones, se ha demostrado que el costo mensual de los dos métodos más eficaces (Cytocentrifugation con cámaras desechables y Cytyc Thinprep LBC) es totalmente diferente: hay un 92,8% a 154,5% de aumento del costo versus LBC cytocentrifugation con desechables Megafunnels y Cytofunnels, respectivamente [19].

Sin embargo, en nuestra opinión, se debe tener en cuenta no sólo el rendimiento diagnóstico y el costo, sino también el objetivo último de las mejoras técnicas previstas por LBC. LBC apunta principalmente a proporcionar reproducible y bien conservado material para técnicas adicionales como la inmunocitoquímica, hibridación in situ por fluorescencia (FISH) y otros tipos de análisis moleculares. Se ha demostrado que Thinprep-procesados permitido recuperación eficiente de ADN, ARN y proteínas relacionadas con el gen supresor tumoral p53 [20].

Conclusión

Llegamos a la conclusión de que Cytyc Thinprep LBC, a pesar de su coste, aún puede ser considerado como un progreso técnico para la citología basada en estudios moleculares. A un punto de vista económico, y teniendo en cuenta el valor de una meticulosa técnica, cytocentrifugation con cámaras desechables sigue siendo la norma técnica para el tratamiento actual de las muestras de orina.

Lista de abreviaturas

LBC: citología de base líquida técnica

RBC: glóbulos rojos

RT: temperatura ambiente

TUR: resección transuretral

Conflicto de intereses

El autor (s) declaran que no tienen interés en competencia.

Contribuciones de los autores

PE previsto el estudio y preparó el manuscrito.

JF, y KH MCR realizado la base líquida técnicas (cytocentrifugations y Thinprep procesamiento), así como frotis y Millipore filtraciones.

PE y MC cytopathologic las evaluaciones realizadas y el análisis estadístico Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Historia previa a la publicación

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