Caracterización bioquímica de Cdk2-Speedy/Ringo A2

Eucarióticos la progresión del ciclo celular se encuentra bajo el control de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs). En las células eucariotas superiores, Cdc2, Cdk2, Cdk4 y Cdk6 de control de la progresión del ciclo celular. Sus actividades están reguladas a través de una variedad de mecanismos, incluida la asociación con subunidades reguladoras (ciclinas, inhibidores de los factores y de reunión), la localización subcelular, la regulación transcripcional, proteólisis selectiva y reversible de la fosforilación de proteínas (revisado en [1 - 7]].

Encuadernación de una a una ciclina CDK es un paso fundamental en su activación y la lleva a su fosforilación en varios sitios [5 - 8]. La activación de la fosforilación en el segmento de activación (también denominado T-loop) en un residuo conservado threonine (Thr-160 en Cdk2) se requiere para las actividades CDK in vitro e in vivo [9 - 16] y se lleva a cabo por la activación de Cdk - Quinasa (CAK), que se compone de Cdk7, ciclina H, y en la mayoría de Mat1 eucariotas. Inhibitoria phosphorylations ocurren en sitios equivalentes a Thr Tyr-14 y-15 en humanos Cdc2 o Cdk2 y se llevan a cabo por Wee1-como proteínas quinasas (Wee1 y Myt1), y retirado por los miembros de la familia fosfatasa Cdc25 (revisado en [6, 7]]. Además de la activación de CDKs, ciclinas también contribuir a sus especificidades de sustrato [17 - 20], y a sus localizaciones subcelulares [21]. Un consenso general en la secuencia más eficiente de la fosforilación por Cdc2 y es Cdk2 (K / R) (S / T) PX (K / R) [22 - 24], en el que una base de residuos en la posición +3 tres aminoácidos C-terminal A la fosforilados Ser o Thr es particularmente importante.

Además de su activación por ciclinas, CDKs puede ser activado por un nuevo regulador del ciclo celular llamado Speedy o Ringo (Rapid Rapid inductor inductor del G ₂ / M progresión en ovocitos ovocitos), a pesar de la falta de primaria de homología de secuencia entre las ciclinas y Speedy / Ringo proteínas [25 - 28]. Speedy / Ringo proteínas fueron inicialmente descrito en Xenopus basa en su capacidad para promover la transición a la M G2 durante la maduración de ovocitos [25, 26]. Xenopus Speedy / Ringo obligado a activar y Cdc2 y Cdk2 in vitro [26, 27]. Un humanos Speedy / Ringo homólogo (Spy1) es esencial para la entrada en la fase S-cultivadas en células somáticas en una forma dependiente de Cdk2-: sobreexpresión de humanos Spy1 acelerado la entrada en la fase S-y la proliferación de las células, y su inhibición por RNAi causado un retraso del ciclo celular En G1 / S [28]. Estas funciones biológicas de Speedy / Ringo dependen de las proteínas CDK actividad quinasa-inactiva desde formas de Cdc2 y Cdk2 abolió los efectos de Spy1 en las transiciones del ciclo celular [26, 28]. Curiosamente, a diferencia de los complejos CDK-ciclina cuya fosforilación en el sitio de la activación es esencial para la actividad, Speedy / Ringo proteínas puede activar Cdc2 y Cdk2 in vitro en ausencia de activación de la fosforilación de la CDK [27]. Así, Xenopus Speedy / Ringo podría activar tanto de tipo salvaje Cdk2 y Cdk2 ^T160A igualmente bien y preincubación de Cdk2 en ciernes con la levadura CAK (Cak1p) no tuvo ningún efecto sobre su actividad quinasa hacia sustratos como la histona H1 [27]. Cdk2-Speedy/Ringo complejos son también resistentes a los efectos inhibitorios de p21 ^Waf1/Cip1 y Wee1 [27]. Paradójicamente, si bien esta capacidad de los complejos de CDK-Speedy/Ringo de pasar por alto muchas formas de regulación impuestas a los complejos CDK-ciclina podría sugerir que CDK-Speedy/Ringo complejos sería muy activa, sólo muy baja actividad enzimática hacia sustratos convencionales se asocia con CDK -Speedy/Ringo Complejos a partir de células aisladas (datos no publicados).

La importancia de Speedy / Ringo proteínas para la progresión del ciclo celular en combinación con la baja actividad de la proteína quinasa CDK-Speedy/Ringo complejos convencionales hacia sustratos planteó la posibilidad de que puede haber grandes diferencias entre CDK-Speedy/Ringo bioquímicos complejos y los complejos CDK-ciclina . Estas diferencias podrían explicar cómo CDK-Speedy/Ringo complejos de reconocer sus sustratos y promover la progresión del ciclo celular. Las principales diferencias son que se espera desde la activación de la fosforilación que es prescindible para Cdk2-Speedy/Ringo actividad desempeña un papel fundamental en el reconocimiento de sustrato por los complejos ciclina Cdk2-[29, 30]. También aumenta la activación de la fosforilación de sustrato vinculantes por los complejos CDK-ciclina [30]. La estructura cristalina de ciclina Cdk2-A con una óptima péptido substratos mostraron que la activación de fosfato forma un vínculo con el hidrógeno en la cadena lateral de la lisina en la posición de la +3 sustrato [31], proporcionando la visión de cómo la activación de fosfato participa En el reconocimiento de sustrato. Aunque Cdk5 puede ser activado por p35/p25 (subunidad de ciclina Cdk5) sin necesidad de activar la fosforilación, un ácido glutámico en la cadena lateral en la activación de p35/p25 imita fosfato e interactúa con una base de residuos en el +3 posición del sustrato [32] . Será interesante saber cómo CDK-Speedy/Ringo sustratos complejos de reconocer de manera eficiente y cómo aparentemente bajo nivel de actividad CDK-Speedy/Ringo pueden tener profundos efectos en la progresión del ciclo celular. Una bioquímica de la comprensión detallada de la actividad CDK-Speedy/Ringo debería ayudarnos a comprender las funciones biológicas de Speedy / Ringo proteínas del ciclo celular durante las transiciones.

En este estudio, hemos explorado las propiedades bioquímicas de los humanos Cdk2-Speedy/Ringo A2. Hemos encontrado que ni el general ni su actividad catalítica sustrato reconocimiento requiere la activación de la fosforilación de Cdk2. De hecho, Cdk2-Speedy/Ringo A2 fue un mal sustrato para la fosforilación por CAK metazoos. Cdk2-Speedy/Ringo A2 tolerar casi cualquier residuo de aminoácido en la posición de sustratos +3, que es muy diferente de la rígida exigencia de Cdk2-ciclina A y Cdk2-ciclina E de residuos básicos (y, en particular, para un Lisina) en la posición +3. Aunque Cdk2-Speedy/Ringo A2 fosforilados canónica Cdk2-ciclina A sustratos como la histona H1 y una KSPRK péptido muy mal, que no fosforilados canónica CDK-ciclina sustratos, incluyendo la proteína Cdc25 fosfatasas, así como cerca de Cdk2-ciclina A. Estos Observaciones plantean la posibilidad de que Cdk2-Speedy/Ringo podría phosphorylate y regular un subconjunto de los no-canónico CDK sustratos, como la proteína Cdc25 fosfatasas.

Iniciamos nuestro trabajo por purificar y caracterizar la Cdk2, ciclina A, y Speedy / Ringo A2 proteínas que se utiliza en estos estudios. Unphosphorylated GST-Cdk2 ([unP] Cdk2) se expresó en E. Coli y purificada a través de su etiqueta GST. Para producir Thr160-fosforilados Cdk2 ([pT160] Cdk2), se utilizó una anteriormente descrita Cdk2-Cak1p co-expresión del sistema [31, 33] que pueden producir esencialmente plenamente fosforilados Cdk2 [31]. Como se ha informado anteriormente [29, 33], [pT160] Cdk2 de por sí muestra un bajo pero detectable histona H1 actividad quinasa (Fig. 1A-B]. Ciclina A estimulado la histona H1 de la actividad quinasa [pT160] Cdk2 (sólido círculo) alrededor de 50 veces. La activación de [pT160] Cdk2 por ciclina A plateaued cuando la proporción de ciclina Cdk2 a una era de aproximadamente 1:1. En contraste con [pT160] Cdk2, la histona H1 de la actividad quinasa [unP] Cdk2 (plazas abiertas) sigue siendo muy baja, incluso a altas concentraciones de ciclina A, lo que confirma la importancia de la activación de la fosforilación de Cdk2 en la Thr-160 (Fig. 1A ).

Seguidamente, se determinó la histona H1 quinasa actividades de Cdk2 [unP] y [pT160] Cdk2 después de la incubación con GST-Speedy/Ringo A2, que se expresó y purificada a partir de E. Coli. Hemos encontrado que el de informes anteriores de mamíferos Speedy / Ringo proteína, Spy1, se expresa como dos estrechamente relacionados con las proteínas resultantes de splicing alternativo [34]. Estas dos proteínas, que nos plazo Speedy / Ringo A1 y A2, sólo difieren en sus extremos C-terminales y parecen ser indistinguibles en todos los aspectos funcionales. Spy1 corresponde a Speedy / Ringo A1. Como se muestra en la Fig. 1B, GST-Speedy/Ringo A2 activado [unP] Cdk2 (plazas abiertas) y [pT160] Cdk2 (círculos sólidos) igual de bien, lo que indica que Speedy / Ringo A2 puede obligar a activar Cdk2 y sin tener en cuenta su La activación de la fosforilación. Cdk2 actividad plateaued en una GST-Speedy/Ringo A2 a GST-Cdk2 proporción de al menos 4:1. Sospechamos que un exceso de más de GST-Speedy/Ringo A2 GST-Cdk2 fue necesario porque gran parte de la GST-Speedy/Ringo A2 agregados de la proteína, como hemos observado por cromatografía de filtración en gel-(datos no presentados), lo que redujo la eficacia Concentración de activos Speedy / Ringo A2.

Como una forma alternativa de producir funcional Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos, también coexpression desarrollado un sistema en el que un C-terminal hexahistidine-etiquetados de forma rápida / A2 Ringo fue coexpressed con untagged Cdk2 en E. Coli. [UnP] Cdk2-Speedy/Ringo A2-su ₆ (K2A2 ^coexp) fue purificado en una columna de metal de afinidad y por cromatografía de filtración en gel. Las fracciones se resolvieron en un 10% SDS-PAGE y transferidos a una membrana de PVDF. Las proteínas totales fueron detectados por tinción con azul brillante Coomassie R-250 (Fig. 1C panel superior) y Cdk2 fue detectado por inmunoblotting con anticuerpos anti-Cdk2 (Fig. 1C panel inferior). Speedy / Ringo A2-su _6, que emigraron como una proteína de 42 kDa, el 10% SDS-PAGE, co-eluyen con Cdk2 gel filtración de la columna. La aparente MW para el pico de fracciones (fracciones 14-15) fue ~ 80 kDa, cerca de los pesos moleculares combinados de monomérico Cdk2 (33 kDa) y Speedy / Ringo A2-su ₆ (42 kDa). La apariencia difusa de Speedy / A2 Ringo se debe probablemente a la fosforilación de Speedy / A2 por Ringo Cdk2 (datos no presentados). La proporción de Cdk2 a Speedy / Ringo A2-su ₆ parece estar cerca de 1:1 en las fracciones 14 y 15, lo que sugiere que una molécula de Speedy / Ringo A2 se une una molécula de Cdk2. K2A2 ^coexp muestran muy similar a la actividad de la proteína kinasa in vitro-A2 montado Cdk2-Speedy/Ringo complejos (véase más adelante), lo que sugiere que ambos tipos de complejos puede ser completamente activo. Tenga en cuenta que debido a la coexpression de Cdk2 y Speedy / Ringo A2, y los pobres de fosforilación de Cdk2 obligado a Speedy / Ringo A2 por tanto metazoos CAK (Cdk7/cyclinH/Mat1) y levadura en ciernes Cak1p (véase más adelante), que sólo hemos podido producir Unphosphorylated la forma de K2A2 ^coexp. Este [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 heterodimer se utilizó como control a lo largo de estos estudios.

Se midió la actividad de la ATPasa Cdk2-ciclina A y Cdk2-Speedy/Ringo A2 para evaluar la relación de las fracciones orgánicas complejos. Estamos motivados ATPasa actividades que serán menos sujetas a la especificidad por el sustrato efectos conferidos por ciclina A, o Speedy / A2 Ringo que la proteína quinasa ensayos. La actividad de ATPasa monomérico [unP] Cdk2 es baja; tanto la activación de la fosforilación y la ciclina vinculante aumentar el volumen de negocios de la ATP por 20-25 veces [29, 30]. Por lo tanto, la actividad ATPasa será un buen indicador para la adopción de la conformación catalíticamente activa de Cdk2 en Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos. La detección de la ATPasa de actividades [pT160] Cdk2-ciclina A y K2A2 ^coexp. Una vez supuesto experimento (Fig. 1D] mostró que la tasa de hidrólisis de ATP sigue siendo lineal durante el ensayo. La relativa de las actividades de ATPasa [pT160] Cdk2-ciclina A y K2A2 ^coexp se calcula a partir de las pendientes en la Fig. 1D y se muestra en la Fig. 1E. La actividad de ATPasa K2A2 ^coexp fue ligeramente más alto que el de [pT160] ciclina Cdk2-A, que indica que Cdk2 en K2A2 ^coexp es tan activa como en el que [pT160]-ciclina Cdk2 A. Debemos hacer hincapié en que-reunidos in vitro [unP ] Cdk2-Speedy/Ringo A2 y K2A2 ^coexp muestran muy similares actividades y especificidades de sustrato (véase más adelante, y los datos no presentados). Así pues, parece ser que in vitro-A2 montado Cdk2-Speedy/Ringo complejos son plenamente activo y es razonable suponer que se mostrarán las características fisiológicas bioquímicas.

Se utilizó un panel de CDK sistemática sustratos para investigar la especificidad por el sustrato de Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos. Estos sustratos contenía un pentapeptide de forma XSPXX (donde X indica cualquier aminoácido) fusionados a la C-terminal de GST [24]. Sustratos fueron purificados como GST-proteínas de fusión de E. Coli. El óptimo para sustratos [pT161] Cdc2-ciclina By [pT160] ciclina Cdk2-A ha sido identificado como (K / R) (S / T) PX (K / R). Las sustituciones de la base de residuos en la posición +3 (con respecto a la fosforilación sitio) tuvo el mayor efecto sobre la eficiencia de fosforilación, por tanto Cdc2 y por Cdk2 [24]. Así, KSPRK es considerado el "wild type" sustrato en estos estudios. Se determinó que era la posición más importante de la fosforilación por Cdk2-Speedy/Ringo A2 utilizando sustratos de sustitución de alanina en la que el acusado residuos en -1, +2, +3 y se sustituye por separado con alanina. Se comparó la capacidad de estos sustratos que se fosforilados por Cdk2-Speedy/Ringo A2 (montado in vitro), K2A2 ^coexp, [pT160] Cdk2-Speedy/Ringo A2, y [pT160] ciclina Cdk2-A (Fig. 2]. (Tenga en cuenta que estamos comparando con sustrato de las preferencias y no absoluta eficiencia de fosforilación, que varían mucho entre Cdk2 obligado a ciclina A y a Speedy / Ringo A2 (ver más abajo y Tabla 1).] Por todas estas enzimas, la sustitución de la lisina en La posición -1 (ASPRK) no tuvo ningún efecto sobre la eficiencia de fosforilación, la sustitución en la posición +2 (KSPAK) tuvo un efecto modesto, y la sustitución en la posición +3 (KSPRA) producido los efectos más graves (Fig. 2]. Ciclina Cdk2-A es mucho más sensible a la +2 y +3 sustituciones que cualquiera de las formas de Cdk2-Speedy/Ringo A2. Se observaron efectos similares utilizando K2A2 ^coexp y [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2, lo que sugiere que las diferentes formas en que estos complejos se había producido poco efecto sobre su sustrato resultante especificidades. Fosforilación de Cdk2 en Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos había prácticamente ningún efecto sobre la especificidad por el sustrato, que es sorprendente dado el papel de este fosfato en el reconocimiento de la posición +3 de sustrato por ciclina Cdk2-A [30, 31]. No obstante, la posición de +3 es la posición más importante para ambos [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 y [pT160] Cdk2-Speedy/Ringo A2, como también lo es para [pT160] Cdk2-ciclina A.

Seguidamente, evaluó la especificidad por el sustrato de Cdk2-Speedy/Ringo A2 en la posición +3 con más detalle utilizando un panel de GST-KSPRX sustratos [24]. En primer lugar, la comparación de la especificidad por el sustrato [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 con la de [unP] ciclina Cdk2-A, que nos permite comparar los efectos vinculantes de la pareja, separada de los efectos debidos a la Cdk2 estado de fosforilación. La relativa especificidad de [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 y [unP] Cdk2-ciclina A se determinaron en un sustrato concentración de 50 μ M, que está muy por debajo del valor de Cdk2-Speedy/Ringo KM A2 y [pT160] Cdk2 - Ciclina A (véase más abajo y [24]] para estos sustratos, y por lo tanto, dentro del rango lineal del ensayo. Asimismo, en comparación a la capacidad de estas quinasas a phosphorylate histona H1 (5 μ M). La fosforilación de la "wild type" sustrato (GST-KSPRK) se define como 100%. Aunque [unP] ciclina Cdk2-A fue menos activa que plenamente activado [pT160] ciclina Cdk2-A, [unP] ciclina Cdk2-A mantuvo en residuos de lisina y arginina en la posición +3 (Fig. 3A], de conformidad con una anterior Informe que indica que [unP] ciclina Cdk2-A fue sólo moderadamente defectuoso en el sustrato vinculante [29]. A diferencia de lo que [unP] ciclina Cdk2-A, [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 tolerado casi todas las sustituciones de aminoácidos en la posición +3 (Fig. 3A]. Los mejores sustratos para [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 figuran tirosina (Y), en 473 ± 82%, arginina (R) en 325 ± 74%, y el triptófano (W) a 293 ± 56%. Más de la mitad de las sustituciones de aminoácidos en la posición +3 mejores sustratos de la lisina. De hecho, 17 de los 20 fueron los sustratos fosforilados por lo menos el 50% de la forma más eficiente KSPRK; sólo alanina, asparagine, glutamina y arrojado pobres sustratos. En cambio, [pT160] ciclina Cdk2-A no pudo phosphorylate cualquier sustitución sustrato más del 5% de la manera más eficiente KSPRK, y la mayoría de las sustituciones producidas sustratos cuya fosforilación es indetectable (<0,01% de KSPRK).

Seguidamente comparó la sensibilidad in vitro de montar [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 y K2A2 ^coexp a sustituciones en la posición +3 para probar si la ruta de formación de estos complejos afectado su utilización de substratos. Como se muestra en la Fig. 3B, in vitro-ensamblados [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 y K2A2 ^coexp exhiben casi idénticos perfiles de la eficiencia de fosforilación de la prueba sustratos, incluyendo la histona H1. Con excepción de la KSPRK y KSPRT sustratos, K2A2 ^coexp todos los sustratos fosforilados ligeramente menos eficiente que montar in vitro [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2, posiblemente debido a su ligeramente mayor actividad enzimática hacia KSPRK (cuadro I], que se define como 100%. En general, las diferencias en la especificidad por el sustrato y la actividad enzimática in vitro entre los complejos de montar y K2A2 ^coexp fueron marginales. Ambos complejos puede aceptar cualquier aminoácido aspartato excepción de las cadenas laterales y de glutamato en la posición +3.

De ahí se determinó el efecto de la Thr-160 fosforilación en la especificidad de sustrato [pT160] Cdk2-Speedy/Ringo A2. El óptimo de los sustratos en la posición +3 fueron arginina (R) en 250 ± 19%, histidina (H) en 107 ± 6%, y de la lisina (K) en el 100%. Fosforilación de KSPRW y KSPRY se redujeron de los muy altos niveles exhibidos por [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 a los niveles más típico de otras sustituciones de aminoácidos. En general, Thr-160 fosforilación modulada de la especificidad por el sustrato Cdk2-Speedy/Ringo A2, pero no transformarlo en un modelo radicalmente diferente (Fig. 3B].

Para determinar la absoluta (y no relativa) de las actividades de Cdk2-ciclina A y Cdk2-Speedy/Ringo A2, se comparó la capacidad de [pT160] Cdk2-ciclina A y Cdk2-Speedy/Ringo A2 a phosphorylate varios sustratos, incluyendo la histona H1 , KSPRK, KSPRR, y KSPRY (cuadro I]. Por ciclina Cdk2-A, la histona H1 y KSPRK son los mejores sustratos, aunque KSPRR también encaja la secuencia de consenso sustrato, y KSPRY es un sustrato desfavorable [24]. Cdk2-Speedy/Ringo A2 fosforilados los cuatro sustratos con similar eficiencia (Tabla 1]. [UnP] Speedy / Ringo A2, [pT160] Cdk2-Speedy/Ringo A2, y K2A2 ^coexp fosforilados la óptima Cdk2-ciclina A sustratos histona H1 y KSPRK sólo el 0,1% de la forma más eficiente [pT160] ciclina Cdk2-A (Cuadro 1 ). De hecho, el Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos eran sólo alrededor de 6 veces más activa hacia la histona H1 que monomérico [pT160] Cdk2 (Fig. 1B]. Las diferencias entre Cdk2-ciclina A y Cdk2-Speedy/Ringo A2 disminuyó dramáticamente cuando se midió la actividad hacia sectores más pobres Cdk2-ciclina A sustratos. Por ejemplo, K2A2 ^coexp fosforilados KSPRR 6% de la forma más eficiente [pT160] ciclina Cdk2-A, y que fosforilados KSPRY 95% de la forma más eficiente [pT160] ciclina Cdk2-A (Tabla I]. Así, la relación de actividades a ciclina Cdk2 obligado a una o Speedy / Ringo A2 dependen fundamentalmente del sustrato utilizado.

Para entender por qué Cdk2-Speedy/Ringo A2 fue mucho menos activa que [pT160] ciclina Cdk2-A hacia determinados sustratos, hemos tratado de evaluar la K _M y la actividad catalítica (V _max) de Cdk2-Speedy/Ringo A2. Elegimos varios sustratos incluyendo KSPRK, KSPRR, KSPRY, y de la histona H1 para este análisis. Fosforilación de estos sustratos por [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 y [pT160] Cdk2-Speedy/Ringo A2 se llevó a cabo en una amplia gama de las concentraciones de sustrato. Las concentraciones máximas fueron 250 μ M de la histona H1 y 1000 μ M en la GST-péptido sustratos. La fosforilación de la histona H1, KSPRY, y por KSPRK [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 aumento lineal hasta la concentración máxima de cada sustrato (Fig. 4A]. Curiosamente, la fosforilación de la KSPRR sustrato plateaued a altas concentraciones de sustrato (abierto plazas en la Fig. 4A]. Se ha observado una eficacia similar fosforilación de concentración relación utilizando K2A2 ^coexp (datos no presentados), lo que sugiere que KSPRR es un buen sustrato para [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2. La fosforilación de KSPRY (círculos abiertos) siguió aumentando linealmente, incluso en las concentraciones de sustrato en el que la fosforilación de KSPRR había plateaued, lo que indica que [unP] Cdk2-Speedy/Ringo A2 podría tener una mayor afinidad por el péptido KSPRR pero que se puede realizar Las medidas de catálisis química de manera más eficiente en KSPRY. También se determinó la utilización de KSPRK, KSPRR, KSPRY, y por la histona H1 [pT160] Cdk2-Speedy/Ringo A2 en el mismo rango de concentraciones de sustrato. La fosforilación de estas cuatro sustratos aumento lineal en todo el rango de las concentraciones (fig. 4B]. Sorprendentemente, la fosforilación de KSPRR por [pT160] Cdk2-Speedy/Ringo A2 aumento lineal en todo el rango de concentración, lo que sugiere que la activación de la fosforilación de hecho una disminución de la afinidad Cdk2-Speedy/Ringo A2 para KSPRR. Estos resultados difieren significativamente de los obtenidos utilizando ciclina Cdk2-A, que tiene una K _M para fosforilación de la histona H1 de 0,8 μ M [29], y de la fosforilación de KSPRK de 150 μ M [24]. Así pues, parece que la debilidad de sustrato vinculante contribuido, al menos parcialmente, a la baja actividad enzimática de Cdk2-Speedy/Ringo A2 hacia estos sustratos.

Debido a los resultados obtenidos indican que Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos CDK phosphorylate sustratos con motivos canónicos (S / T) PX (K / R) en comparación con el mal ciclina Cdk2-A, pero que pueden phosphorylate no canónica CDK sustratos relativamente bien. Estos resultados sugirieron que podría Cdk2-Speedy/Ringo A2 eficiente phosphorylate algunos que contienen sustratos fisiológicos Cdk2 no canónica motivos. Estamos motivados Cdc25 proteínas que podrían ser tales sustratos. Autoamplification de Cdc2 actividad en el G2 / M transición se propuso hace más de una década [8]. En este modelo, la proteína Cdc25 fosfatasas activar Cdc2-B de los complejos ciclina inhibidora mediante la eliminación de los fosfatos de Cdc2. A su vez, activa Cdc2-ciclina B se activa y fosforila Cdc25, que se activa adicional Cdc2-B complejos ciclina. Así, un bajo nivel de actividad CDK puede ser amplificado a través de este circuito de retroalimentación positivo, que conduzcan a la activación de Cdc2 concertada y la entrada en mitosis. Para lograr una brusca de todo o ninguno activación de Cdc2 y en el momento adecuado, es importante que las proteínas Cdc25 no se activará en un nivel demasiado bajo de Cdc2 actividad. Desde este punto de vista, uno podría predecir que sería un Cdc25 pobres CDK sustrato. Un análisis similar se aplica a la activación de Cdc25 por Cdk2 complejos de las proteínas.

Las tres isoformas de mamíferos Cdc25 (A, B, yC) pueden ser fosforilados en múltiples sitios de los complejos CDK-ciclina (revisado en [35 - 37]]. Entre 32 posibles sitios de fosforilación CDK ((S / T) PXX) en humanos Cdc25A, B, y C (Fig. 5A], sólo el 2 sitios aptos CDK el consenso de fosforilación motivo, y aún estos son débiles encaja para fosforilación por Cdk2 (SPXR ) Ya que carecen de una lisina en la posición +3 [24]. Llegamos a la conclusión de que la mayoría de CDK Cdc25 fosforilación de las proteínas se produce en la no-canónico motivos. Nosotros, por lo tanto, examinó si las proteínas Cdc25 podría ser fosforilados por Cdk2-Speedy/Ringo A2. Como se muestra en la Fig. 5B, tanto Cdk2-ciclina A y K2A2 ^coexp fosforilados GST-Cdc25A, B, y C. Para comparar los datos de las actividades de la ciclina Cdk2-A y Cdk2-Speedy/Ringo A2 hacia Cdc25, que varía la cantidad de [ PT160] Cdk2-ciclina A y K2A2 ^coexp utilizado para phosphorylate constantes cantidades de GST-Cdc25A, B, y C. Se estima que la actividad enzimática de [pT160] ciclina Cdk2-A hacia la Cdc25 proteínas es 7-14 veces mayor que la K2A2 de ^coexp. En cambio, [pT160] Cdk2-ciclina A fosforilados histonas H1> 1000 veces más eficiente que Cdk2-Speedy/Ringo A2 (Fig. 5C].

Para determinar si Cdk2-Speedy/Ringo A2 y ciclina Cdk2-A phosphorylate Cdc25 proteínas en el mismo o en diferentes sitios, en comparación tríptico phosphopeptide mapas de las proteínas Cdc25 fosforilados por [pT160] ciclina Cdk2-A (Fig. 6A], con las que por fosforilados K2A2 ^coexp (Fig. 6B]. Cada proteína Cdc25 fosforilados se acerca a la misma medida por cada Cdk2 complejo. Dado que existen múltiples posibilidades CDK sitios en la fosforilación de proteínas Cdc25 (Fig. 5A], no es sorprendente que varios sitios eran en realidad fosforilados. Como se muestra en la Fig. 6, la fosforilación de la proteína Cdc25 por cada Cdk2-Speedy/Ringo A2 y por ciclina Cdk2-A producido phosphopeptide distintos patrones. Estos phosphopeptides podrían agruparse en dos categorías. En primer lugar, muchos fueron phosphopeptides única, ya sea para Cdk2-ciclina A Cdk2-Speedy/Ringo o A2, que indica una muy fuerte influencia de Cdk2 socio en la fosforilación especificidad. Por ejemplo, los puntos A1, A2, B1, B2 y B3 son únicos para ciclina Cdk2-A, mientras que los puntos a1, a2, b1, b2, c4 y se asocia exclusivamente con Cdk2-Speedy/Ringo A2. Phosphopeptides en el segundo grupo fueron fosforilados por ambas quinasas, pero en distinta medida. Por ejemplo, en el phosphopeptide mapas de Cdc25A, manchas A3, A4, A5 y A6 generados por ciclina Cdk2-A (Fig. 6A] parecen ser idénticos a los puntos a3, a4, a5, a6 y generada por Cdk2-Speedy / Ringo A2 (Fig. 6B], respectivamente. Aunque Cdk2-ciclina A fosforilados sitio A3 más enérgicamente que los sitios A4, A5 y A6, Cdk2-Speedy/Ringo A2 tenido el sitio de preferencia. En el phosphopeptide mapas de Cdc25C, ciclina Cdk2-A fosforilados péptido C2 mucho más eficaz que el péptido C1 mientras Cdk2-Speedy/Ringo A2 fosforilados C1 mucho más eficaz que el C2. Por lo tanto, Cdk2-Speedy/Ringo A2 y ciclina Cdk2-A han distintos pero que se superponen parcialmente sustrato preferencias sobre sustratos naturales.

Se utilizó la accesibilidad a quinasas y fosfatasas sonda a la conformación de la activación Cdk2 bucle en Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos. El bucle de activación desempeña un papel importante en el reconocimiento de sustrato por ciclina Cdk2-A como la Thr-160 fosfato hace contacto directo con el +3 posición de los sustratos. El sustrato sorprendentemente diferentes preferencias de Cdk2-ciclina A y Cdk2-Speedy/Ringo A2 planteó la posibilidad de que la activación de bucle en Cdk2-Speedy/Ringo A2 podría adoptar una conformación diferente de la que exhiben los Cdk2-ciclina A. Además, como Cdk2 -Speedy/Ringo A2, monomérico [pT160] Cdk2 muestran baja actividad enzimática hacia la histona H1 ([29, 33] y Fig. 1B] y defectuoso sustrato vinculante [29]. Estructurales, los estudios indican que la activación de bucle en monomérico [pT160] Cdk2 es muy desorganizado, y que sólo una parte muy pequeña de la población [pT160] Cdk2 es activa en la conformación en cualquier momento [33]. Esta comparación plantea la posibilidad de que la activación de bucle en Cdk2-Speedy/Ringo A2 también podrían ser desordenada.

Primero probaron el T-loop conformación en Cdk2-Speedy/Ringo A2 utilizando levadura Cak1p ciernes. Cak1p fosforila monomérico Cdk2 de manera eficiente, pero esta fosforilación se inhibe más del 95% en la presencia de ciclina A [38], presumiblemente debido a que el fijo conformación de la activación de bucle en ciclina Cdk2-A forma un sustrato para Cak1p pobres. A-quinasa forma inactiva de Cdk2 (GST-Cdk2 ^D145N) fue utilizada en este ensayo para eliminar la alta concentración de fosforilación de Speedy / Ringo A2 de tipo salvaje Cdk2. GST-Cdk2 ^D145N obligado traducido in vitro ^[35 S] -Speedy/Ringo A2, así como de tipo salvaje Cdk2 (datos no presentados). GST-Cdk2 se preincubated con cantidades cada vez mayores de GST-Speedy/Ringo A2 o GST sola antes de la fosforilación por Cak1p. Como se muestra en la Fig. 7A, la fosforilación de Cdk2 por Cak1p se redujo en presencia de altas concentraciones de Speedy / Ringo A2, que indica que la unión de Speedy / A2 Ringo Cdk2 cambiado a la conformación de la activación de bucle.

Hemos investigado el próximo T-loop conformación de Cdk2-Speedy/Ringo A2 utilizando mamíferos CAK (Cdk7/cyclin H/Mat1). Monómeras CDKs son pobres substratos para mamíferos CAK mientras que la unión de la ciclina estimula la activación de la fosforilación por CAK más de siete veces [38]. Una vez más, utilizó una quinasa de forma inactiva de Cdk2-GST (GST-Cdk2 ^D145N) para reducir la fosforilación de antecedentes GST-Speedy/Ringo A2 de tipo salvaje Cdk2. GST-Cdk2 ^D145N solo fue ligeramente fosforilados por CAK (Fig. 7B, carril 1). La fosforilación de GST-Cdk2 ^D145N fue mucho mayor en la presencia de ciclina A (Fig. 7B, carril 4). En cambio, GST-Speedy/Ringo A2 no tuvo ningún efecto sobre la fosforilación GST-Cdk2 ^D145N por CAK (Fig. 7B, carril 5). La fosforilación de Cdk2-Speedy/Ringo defectuoso A2 por mamíferos CAK es improbable que se debe a un fracaso de Speedy / Ringo A2 y GST-Cdk2 ^D145N para formar un complejo. Tomando en conjunto estos resultados, se concluye que la unión de Speedy / Ringo A2 altera la activación de bucle conformación de Cdk2 (Fig. 7A], pero de una manera distinta de cómo lo hace ciclina A (Fig. 7B]. Además, parece que Cdk2-Speedy/Ringo A2 es un mal sustrato para mamíferos CAK.

Por último, hemos examinado el T-loop en la conformación Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejas utilizando serina / threonine proteína fosfatasa tipo 2C (PP2C) [39]. Mamíferos PP2C α y β puede eliminar la activación de fosfato de monomérico CDKs como Cdk2 y Cdk6 [40]. La unión de ciclina Cdk2 impide a un dephosphorylation por PP2C [40], presumiblemente debido a la activación de bucle cerrado se convierte en una conformación inaccesibles para PP2C [41]. Hemos probado si Speedy / Ringo A2, como la ciclina A, puede prevenir dephosphorylation por PP2C α. GST-Cdk2 ^D145N fue etiquetada con [γ ^-32 P]-ATP utilizando Cak1p y purificada por la filtración de geles. ³² P-etiquetados Cdk2 se preincubated con Speedy / Ringo A2, ciclina A, o de amortiguamiento ante Además de PP2C α. Como se describe anteriormente [40], ciclina A totalmente bloqueado el dephosphorylation de Cdk2 (Fig. 7C, comparar los carriles 3 y 4). La unión de Speedy / Ringo A2 parcialmente bloqueado la dephosphorylation de Cdk2 por PP2C α (Fig. 7C, carril 8). Sobre la base de este resultado intermedio llegamos a la conclusión, al igual que con la Cak1p CAK y resultados superiores, que se unen al Speedy / Ringo A2 altera la conformación de la activación de bucle, pero que esta conformación difiere de la observada después de unión de la ciclina A.

El recientemente descubierto Speedy / Ringo proteínas representan una nueva clase de los no-ciclina CDK activadores que juegan un papel importante en la progresión del ciclo celular. Xenopus Speedy / Ringo es necesario para G2 / M progresión durante la maduración y el ovocito humano Speedy / Ringo proteína (Spy1) Regula la entrada en la fase S-en cultivos celulares [25 - 28]. Aunque al parecer no estaban presentes en la levadura, plantas, y los insectos, Speedy / Ringo homólogos se pueden encontrar en las más primitivas ramificación clado de cordados (Ciona intestinalis) [34], a partir de la cual todos los vertebrados evolucionado. Es concebible que Speedy / Ringo proteínas regulan la progresión del ciclo celular en todos los vertebrados. Aunque no existe una evidente similitud entre la secuencia primaria de las ciclinas y Speedy / Ringo proteínas, Speedy / Ringo se unen a las proteínas y puede activar directamente CDKs [27, 34]. En este estudio, se realizó un estudio de caracterización bioquímica Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos. Verificamos que Speedy humanos / Ringo A2 puede formar un complejo 1:1 con Cdk2 y que puede activar Cdk2 in vitro, incluso en ausencia de fosforilación de Cdk2 en la Thr-160.

Sin embargo, Speedy / A2 Ringo no es una simple sustitución de determinados ciclinas; hay muchas diferencias importantes entre las ciclinas bioquímicos y Speedy / Ringo proteínas. En primer lugar, Cdk2-Speedy/Ringo A2 muestra una gran especificidad por el sustrato, que es muy diferente desde el punto de consenso CDK motivo de fosforilación. Estudios anteriores mostraron que Cdk2-ciclina A fosforilados (K / R) (S / T) PX (K / R) de las secuencias, con una fuerte preferencia por una terminal de la lisina en la posición. Se encontró, utilizando un péptido sistemática sustrato panel, que el +3 posición es también la más importante de residuos de Cdk2-Speedy/Ringo A2 reconocimiento. Al +3 posición, la mejor de los sustratos ciclina Cdk2-A son KSPRK y KSPRR (~ 5% de KSPRK), que contienen residuos de base en la posición +3 [24]. En contraste, los mejores sustratos para Cdk2-Speedy/Ringo A2 figuran tirosina (Y), arginina (R), y el triptófano (W) en la posición +3, todos los cuales llevan cadenas laterales voluminosas. Además, Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos puede tolerar casi cualquier residuo de aminoácido en la posición +3 y fosforilados 17 de los 20 +3 sustratos al menos el 50%, así como KSPRK. Más de la mitad de la +3 sustituciones que se han producido sustratos fosforilados más eficientemente que KSPRK. Sólo alanina, aspartato, glutamato y formado sustratos pobres, cuyo relativo fosforilación por Cdk2-Speedy/Ringo A2 fue aún más alta que la relativa fosforilación de todos, pero algunos de los sustratos +3 por Cdk2-ciclina A.

La segunda diferencia entre las ciclinas y Speedy / Ringo A2 es que Cdk2-Speedy/Ringo A2 posee baja actividad enzimática hacia CDK sustratos convencionales, lo que indica que Speedy / Ringo A2 es improbable que sea capaz de reemplazar las ciclinas y promover toda la gama de Cdk2 sustrato de fosforilación . Por ejemplo, la actividad de Cdk2-Speedy/Ringo A2 hacia la histona H1 ~ era sólo el 0,1% de la actividad [pT160] Cdk2-ciclina A en el estándar de la histona H1 quinasa ensayo. Por lo tanto, es poco probable que CDK-Speedy/Ringo pueden promover la progresión del ciclo celular por sí misma. El amplio margen de tolerancia de Cdk2-Speedy/Ringo A2 para sustituciones en la posición 3 de sustratos y su baja actividad hacia convencionales Cdk2 sustratos pueden ir de la mano. La insensibilidad de Cdk2-Speedy/Ringo A2 a la fosforilación de Thr-160 en Cdk2 pueden también contribuir a su baja actividad hacia los sustratos convencionales, ya que el fosfato juega un papel directo en el reconocimiento de sustrato a través de la interacción con los residuos básicos 3. De hecho, la activación de bucle conformación aprobada por Cdk2 vinculante a Speedy / Ringo A2 parece diferir significativamente de la que se aprobó a ciclina A vinculante. Cdk2-Speedy/Ringo A2 también apareció de obligar a los sustratos, a excepción de KSPRR, mal, lo que puede contribuir a su baja actividad enzimática.

A pesar de que muestra una baja actividad enzimática hacia convencionales CDK sustratos como la histona H1, Cdk2-Speedy/Ringo A2 fosforilados en realidad no canónica CDK casi sustratos, así como Cdk2-ciclina A. Ampliamos este modelo de observación que se hizo utilizando sustratos a los sustratos fisiológicos CDK , La doble especificidad Cdc25 fosfatasas. Encontramos que Cdk2-Speedy/Ringo A2 podría phosphorylate humanos de las tres proteínas Cdc25 bastante eficiente, unas 1000 veces más eficiente que cabría esperar sobre la base de la histona H1 de la actividad quinasa Cdk2-Speedy/Ringo A2, y sólo alrededor de un orden de magnitud menos Así que Cdk2-ciclina A. Además, phosphopeptide cartografía de las proteínas Cdc25 confirmó que la especificidad por el sustrato de Cdk2-Speedy/Ringo A2 sino que se superpone con distinta de la de Cdk2-ciclina A. Asimismo, cabe señalar que, además de Inherente a la especificidad por el sustrato, algunas CDKs están dirigidas a algunos de sus sustratos. Por ejemplo, la fase S ciclinas, como la ciclina A y Clb5, poseen un 'hidrofóbicas parche' que puede interactuar con el «RXL» o «Cy 'motivo presente en algunos sustratos para llevar a cabo funciones específicas durante la replicación del ADN [18, 31, 42 - 46]. En cambio, phosphorylations de la histona H1 y GST-péptido sustratos son independientes de cualquier sitio de acoplamiento. Así, por Cdk2-Speedy/Ringo A2, la existencia de un sitio de atraque en Speedy / Ringo A2, aumentarían enormemente la fosforilación de seleccionar los sustratos por Cdk2-Speedy/Ringo A2.

Una tercera diferencia entre las ciclinas y Speedy / Ringo A2 es que Speedy / Ringo A2 puede activar Cdk2 independiente de la activación de la fosforilación de Thr-160 de Cdk2. Estudios anteriores han demostrado que Xenopus Speedy / Ringo puede activar Cdc2 y Cdk2 in vitro en ausencia de activación de la fosforilación y que puede hacer que Cdk2 menos sensibles a través de la inhibición de la fosforilación inhibitoria y encuadernación de CKIs como p21 [27]. Hemos examinado si la activación de la fosforilación, aunque no es necesario para la fosforilación de la histona H1, sin embargo, podría afectar a la especificidad por el sustrato de Cdk2-Speedy/Ringo A2. Ni el general de actividad catalítica de Cdk2-Speedy/Ringo A2 ni su sustrato reconocimiento requiere la activación de la fosforilación de Cdk2. De hecho, Thr-160 redujo la actividad de fosforilación de Cdk2-Speedy/Ringo A2 hacia la mayoría de los sustratos probados y no promover la actividad hacia cualquier sustrato. Asimismo, se encontró que Cdk2-Speedy/Ringo A2 es un mal sustrato para metazoos CAK (Cdk7/Cyclin H/Mat1). Estos resultados indican que la activación de Cdk2 por Speedy / A2 Ringo no requiere de la activación de la fosforilación por CAK y que puede proceder de la ausencia de esta fosforilación.

Hemos identificado las diferencias fundamentales entre bioquímicos Cdk2-ciclina A y Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos. Estos resultados plantean la posibilidad de que Speedy / Ringo A2 podría desempeñar un papel significativo en la fosforilación de sustratos que contienen CDK no canónica sitios de fosforilación y sugieren que las proteínas Cdc25 podría ser fisiológicos objetivos para Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos. Esta es una intrigante posibilidad dada la respuesta positiva que existe entre, por ejemplo, la activación de Cdc2 por Cdc25 y de Cdc25 por Cdc2. CDK-Speedy/Ringo complejos - que no requieren la activación de la fosforilación por CAK y son menos sensibles a los inhibidores CDK inhibidores de la fosforilación y, como p21 - estaría en una posición fuerte para saltar de salida a un circuito de retroalimentación positiva o inversa a la inhibición de Cdc25 Causados por destaca como la causada por el daño en el DNA.

[Γ ^-32 P]-ATP (3000 Ci / mmol) fue de Dupont-NEN (Boston, MA). E. Codon-coli BL21 y BL21 más ^RIL (DE3)-Codon más ^RIL células eran de Stratagene (La Jolla, CA). Ternero timo histona H1 (Cat. # 1004875) fue de Roche Diagnostics Inc (Indianapolis, IN). Todos los demás productos químicos eran de Sigma (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario. 1 × mezcla inhibidor de la proteasa (IP) figura 1 mM PMSF y 10 μ g / ml cada una de leupeptina, chymostatin, y pepstatin. EB de amortiguamiento es de 80 mM β-glicerofosfato, pH 7,3, 20 mM EGTA, 15 mM MgCl _2, 10 mM DTT, 1 mg / ml ovoalbúmina, y 1 × PI. Un Buffer es de 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl _2, 1 mM DTT, 1 mg / ml ovoalbúmina, el 0,1% de Tween 20, 1 × inhibidores de la proteasa. 1 × TBS buffer es de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM de TDT. Conejo anticuerpos anti-Cdk2 se Biotech desde Santa Cruz (Santa Cruz, CA). HRP-conjugado secundaria y anticuerpos reactivos ECL SuperSignal ™ fueron de Pierce (Rockford, IL).

GST-Speedy/Ringo A2 [39], GST-Cdk2 [31], α PP2C humanos [40], GST-Cdk2 mutantes [38, 47], GST-Cak1p [14], Cdk7/cyclin H [38], y GST Fusión sustratos [24] se han descrito anteriormente. El GST-Cdk2/GST-Cak1p bicistron expresión plásmido fue construido por Neil Hanlon (Universidad de Oxford, Reino Unido) y facilitada por Louise Johnson (Universidad de Oxford, Reino Unido). GST-[pT160] Cdk2 se expresó como se describe [31]. Un plásmido que expresan el C-terminal _{6-etiquetados} su versión de la parte de las especies bovina ciclina A3 correspondiente a los residuos 171-432 de la ciclina A fue proporcionada por John Lew (Universidad de California, Santa Barbara, CA) y purificado como se describe [48 ]. Para simplificar, nos referimos a esta proteína ciclina A. Expresión como vectores de GST-Cdc25A, B, C, y fueron proporcionados por Anindya Dutta (Universidad de Virginia) [49].

Para coexpress Cdk2-Speedy/Ringo A2-Su ₆ en bacterias (K2A2 ^coexp), el ratón Speedy / A2 Ringo fue amplificado por la reacción de polimerasa en cadena utilizando una cartilla N-terminal de incorporar una HindIII HindIII sitio y un sitio de unión ribosome antes del inicio Codón, y un C-terminal de ejemplo para eliminar el codón de parada y añadir un XhoI XhoI sitio. Las secuencias de ADN de la PCR primers son las siguientes (la clonación sitios están subrayados): 5'-CCCCAAGCTTAAGGAGGGATAGCCATGGGACGGCATAATCAGATGTATTG CCCCAAGCTTAAGGAGGGATAGCCATGGGACGGCATAATCAGATGTATTG CCCCAAGCTTAAGGAGGGATAGCCATGGGACGGCATAATCAGATGTATTG-3 'y 5'-CCCCCTCGAGTTCTTCACTCTCTGCAAACC CCCCCTCGAGTTCTTCACTCTCTGCAAACC CCCCCTCGAGTTCTTCACTCTCTGCAAACC-3'. El ADN resultante fue digerido con las enzimas de restricción y se indica clonado en pET21d (Novagen) en la HindIII HindIII y XhoI XhoI sitios, situándolo en el marco de un C-terminal polyhistidine (el ₆₎ en la etiqueta de vectores. Por último, HA-etiquetados Cdk2 fue extirpada de un vector de expresión [12] utilizando NcoI NcoI y BamHI BamHI y clonado en el pET21d en los sitios correspondientes. El resultado K2A2 ^coexp coexpression vector se transformó en BL21 ^(DE3)-RIL Codon más células. K2A2 ^coexp fue inducida utilizando IPTG, parcialmente purificada en una columna de afinidad de metal, tal como se describe [39], y cargados en una columna Superdex-200 pre-equilibrio con 1 × TBS buffer con un caudal de 0,5 ml / min. Las fracciones que contiene Cdk2 se combinaron y se concentra a alrededor de 2 mg / ml. La concentración de Cdk2 fue determinada por inmunotransferencia utilizando GST-Cdk2 como norma. Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos producidos por las bacterias en coexpression son designados K2A2 ^coexp y siempre figura en Cdk2 unphosphorylated Thr-160.

Cdk2-Speedy/Ringo A2 complejos cuando también se in vitro mediante la mezcla purificada GST-Cdk2 con un triple molar superior a GST-Speedy/Ringo A2 en 1 × EB a temperatura ambiente durante 20 min. Para algunos experimentos, el primero fue Cdk2 fosforilados en la Thr-160 por coexpression con Cak1p en bacterias (véase más arriba). Cdk2-A los complejos ciclina se formaron in vitro mediante la mezcla purificada GST-[unP] Cdk2 o GST-[pT160] Cdk2 molar, de igual cantidad de ciclina A en 1 × EB a temperatura ambiente durante 20 min.

Para medir la tasa de hidrólisis de ATP [pT160] Cdk2-ciclina A y K2A2 ^coexp, M, de 16,7 μ [pT160] ciclina Cdk2-A, o K2A2 ^coexp en 10 μ l de ATPasa buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 15 mM MgCl _2, 150 mM NaCl, 1 mg / ml ovoalbúmina, 10 mM TDT, el 0,5% de Tween-20, y 1 × inhibidores de la proteasa) fue mezclado con un volumen igual de mezcla que contiene ATP 1 mM ATP y 0,5 μ Ci / μ l [γ ^{-- 32} P] ATP ATPasa en el buffer. En cada punto del tiempo, 1 μ l del ensayo fue mezclado con 4 μ l de Stop de amortiguación (buffer ATPasa que contiene 20 mM EDTA en lugar de los 15 mM MgCl _2). 1 μ l de la reacción fue avistada por terminada en una placa polyethyleneimine celulosa (Selecto Científico, Norcross, GA), y chromatographed durante 2 h en 50 mM HCl. Las placas fueron secos y rechromatographed antes de PhosphorImager análisis.

Cdk2-Speedy/Ringo A2 mezclas se prepararon como se describe más arriba. El Cdk2 concentración en la mezcla de enzimas, se ajustó a 0,1 μ g / μ l de GST-Cdk2 en GST-Cdk2-Speedy/Ringo A2 y complejos a 0,055 μ g / μ l de Cdk2 en K2A2 ^coexp. Para determinar la especificidad por el sustrato y la actividad enzimática de Cdk2-Speedy/Ringo A2 (Figs. 2, 3], la quinasa ensayos fueron llevados a cabo por incubando 5 μ l de enzimas (8,6 pmol de Cdk2) con 5 μ l de sustratos (13 μ g GST sustratos O 1,3 μ g histona H1), en presencia de 0,25 μ Ci / μ l [γ ^-32 P]-ATP, y el 0,4 mM ATP en 1 × EB a 25 ° C. Reacciones procedió durante 10 minutos y se dieron por terminadas por adición de 5 μ l de 3 × SDS-PAGE muestra buffer. Las muestras fueron resueltas en un 10% SDS-PAGE y se analizaron por autorradiografía y phosphorimaging. Sustrato de las bandas también fueron extirpados y cuantificados por líquido scintillation contar. Para determinar la eficiencia de fosforilación de la concentración parcela (Fig. 4], 5 μ l de enzimas (8,6 pmol) se incubaron con 5 μ l de sustratos en la presencia de 0,25 μ Ci / μ l [γ ^-32 P]-ATP, y 1 mM ATP En 1 × EB durante 10 minutos a 25 ° C. La reacción se dio por terminada con la adición de 5 μ l de 3 × SDS-PAGE muestra buffer. Las muestras que contengan más de 10 μ g de GST o sustratos 1 μ g de la histona H1 se diluyeron en 1 × buffer de muestras antes de SDS-PAGE. Las muestras fueron resueltas en un 10% SDS-PAGE y se analizaron por autorradiografía y phosphorimaging. Individual sustrato bandas fueron extirpados y cuantificados por líquido scintillation contar. Los datos se analizaron mediante el programa MS-Excel.

Para el análisis comparativo de Cdc25 y fosforilación de la histona H1 y Cdk2-Speedy/Ringo A2 [pT160] ciclina Cdk2-A (Fig. 5], 5 μ l de sustrato (5 μ g de GST-Cdc25 o 5 μ M de la histona H1 en EB ) Se mezcla con 5 μ l de la enzima que contiene la combinación de las cantidades indicadas coexpressed Cdk2-Speedy/Ringo A2 o de [pT160] Cdk2-ciclina A en la presencia de 0,25 μ Ci / μ l [γ ^-32 P]-ATP, 0,4 mM ATP En 1 × EB. Las reacciones procedió durante 10 minutos a temperatura ambiente y se suprimieron por adición de 5 μ l de 3 × SDS-PAGE muestra buffer. Las muestras fueron resueltas en un 10% SDS-PAGE y se analizaron por autorradiografía y phosphorimaging.

GST-Cdc25A, B, y C (5 μ g) fueron fosforilados en presencia de [γ ^-32 P]-ATP por coexpressed Cdk2-Speedy/Ringo A2 o [pT160] ciclina Cdk2-A, tal como se describe más arriba. ^[32 P]-Cdc25 fue sometido a péptido tríptico cartografía tal y como se describe [50]. Brevemente, las muestras fueron resueltas en un 10% SDS-PAGE, extirpados de geles, y obtuvieron en 50 mM de bicarbonato de amonio, 10% β-mercaptoetanol, y el 0,2% SDS. Cdc25 se precipitaron con ácido tricloroacético frío (20%), en presencia de 20 μ g de albúmina sérica bovina como porteador. El precipitado "pellets" se lavaron dos veces con acetona helada. Cdc25 proteínas fueron digeridos con 20 μ g de secuenciación grado tripsina (Promega, Cat # V5111) a 37 ° C durante la noche. El tríptico péptidos fueron separados de capa fina en placas de celulosa (EM productos químicos) por electroforesis horizontal en el 1000 V por 25 min en 1,9 buffer de pH (2,5% [vol / vol] ácido fórmico y el 7,8% [vol / vol] ácido acético) seguido Ascendente por cromatografía en capa fina en el 32,5% [vol / vol] n-butanol, el 25% [vol / vol] piridina, el 7,5% [vol / vol] ácido acético. Tras cromatografía, la placa se seca y autoradiographed.

1 μ g de GST-Cdk2 ^D145N se preincubated con 4 μ g de GST-Speedy/Ringo A2 en 10 μ l de 1 × EB a temperatura ambiente durante 20 min. Fosforilación de Cdk2 en el sitio de la activación de la fosforilación de levadura y de mamíferos Cak1p CAK se llevó a cabo tal y como se describe [38]. La reacción se dio por terminada con la adición de 3 × SDS-PAGE muestra buffer. Las muestras fueron resueltas en el 10% SDS-PAGE y se analizaron por autorradiografía.

^{P-32-etiquetados} GST Cdk2 ^D145N fue preparado y purificado como se describe anteriormente [39]. El dephosphorylation de ³² P-Cdk2 por PP2C se llevaron a cabo como se describe [39, 40]. En resumen, ~ 80 ng de ³² P-Cdk2 se incubaron con un exceso de ciclina A (0,5 μ g), GST-Speedy/Ringo A2 (1 μ g), o de un buffer a temperatura ambiente durante 20 min. Las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente durante 10 min después de la adición de 100 ng de PP2C α recombinante humana [40]. Las muestras fueron analizadas en un 10% SDS-PAGE, tal como se describe más arriba.

CAK, Cdk-Activar Kinase; CDK, que dependen de la proteína ciclina quinasa; Spy1, Speedy; GST, glutation S-transferasa; PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida.

SG llevado a cabo los experimentos descritos en la Figura 3A y realizó versiones preliminares de la mayoría de los experimentos se muestra en las figuras 2 y 3. PK llevado a cabo el experimento descrito en la Figura 7B. AC llevado a cabo todos los demás experimentos. AC redactado el manuscrito y preparó las cifras. MS concebido el proyecto, participaron en su diseño y ejecución, y revisó el manuscrito. Todos los autores participaron en la revisión del manuscrito y han leído y aprobado el manuscrito final.