Metalotioneína media de leucocitos quimiotaxis

Inicio de una respuesta inmune se acompaña de cambios fisiológicos que pueden producir un ambiente estresante tanto para las células que participan en la respuesta inmune, y para el espectador células que son parte de los tejidos adyacentes, pero no involucradas. Estas presiones pueden aumentar aún más por la presencia de microorganismos infecciosos. Los cambios introducidos en el medio ambiente son el aumento de los reactivos de oxígeno y nitrógeno reactivo especies, productos de metabolismo celular, y los agentes que iniciar apoptosis o muerte celular necrótica.

Las células reaccionan a entornos estresantes con una amplia gama de respuestas diferentes homeostático. Estas respuestas pueden incluir la síntesis de una serie de proteínas de la respuesta de estrés, incluido el choque térmico proteínas, las citoquinas de fase aguda, y la metalotioneína. Metalotioneína es un nuevo miembro de este tipo de respuesta con una única bioquímica y una intrigante variedad de funciones fisiológicas. Metalotioneína es pequeño (unos 7 kDa), y tiol extremadamente ricos en [1]. El tioles participar en complejos con cationes divalentes de metal [2]. Cuando se une a la metalotioneína esencial divalente metales (por ejemplo, zinc y cobre) que pueden servir como reservorio de metal y zinc-apoenzymes dedo reguladores de la transcripción [3, 4]. Metalotioneína que es inducido por otros cationes divalentes de metales (por ejemplo, el mercurio, el cadmio,) protege esenciales funciones celulares [5] y aumenta la supervivencia de las células y organismos enteros que se ven expuestos a metales pesados tóxicos. El tiol-rica naturaleza de metalotioneína también le permite regular el potencial redox de las células, y por lo tanto, sirve como una forma indirecta de la regulación redox-sensibles a través de la transcripción NF-kB [6]. También hay informes que vinculan metalotioneína a una interacción mucho más directa con NF-kB [7, 8]. Metalotioneína también se ha encontrado para ser puesto en libertad a la extracelular medio ambiente en una serie de compartimentos diferentes, incluidos medios de cultivo de células, el suero, orina, broncoalveolar espacios, sinusoides hepáticos, y lesiones inflamatorias [9 - 12]. Extracelular metalotioneína ha demostrado tener importantes efectos inmunomoduladores tanto in vivo e in vitro [13 - 16] Sin embargo el mecanismo molecular (s) de este efecto aún no se han dilucidado.

Circulación de leucocitos es un componente esencial de la respuesta normal a las señales inflamatorias. Una variedad de agentes quimiotaxis puede ser producido por las células inmunitarias locales, las células dañadas espectador, y por la invasión de microorganismos. En conjunto, estas señales solubles determinar la infiltración y la salida de las células que participan en la inflamación, y sirven como componentes esenciales de regulación de la respuesta inmune. Respuestas de estrés alterar estos patrones de tráfico de leucocitos de diversas maneras. Por ejemplo, el estrés psicológico en los seres humanos se ha demostrado que el aumento tanto de la magnitud de la afluencia celular a un sitio inflamatorio y la quimiotaxis índice de células mononucleares de sangre periférica [17]. La moderación en hámsters estrés también ha aumentado el tráfico de leucocitos y la demora en las respuestas de hipersensibilidad de tipo [18]. Xenobióticos pueden alterar el tráfico de leucocitos en forma similar a disminuir inmune.

Hemos encontrado que ha metalotioneína quimiotaxis actividad importante para ambas líneas celulares de leucocitos y primaria. Para la mayoría de los trabajos descritos en este informe, hemos utilizado un nuevo ensayo de quimiotaxis celular circulación. El ECIS / taxis ensayo es suficientemente sensible para detectar la respuesta de una sola célula, y automatizado permite, en tiempo real cuantificación de las células circulación (21). Estos resultados sugieren que las células de circulación en los entornos estresantes puede verse influida por la presencia de metalotioneína, y que esta proteína podría ser una importante diana terapéutica para la manipulación de la inflamación in vivo.

Cysteines presente en la secuencia de aminoácidos primaria de metalotioneína están dispuestos en cys, cys-cys, cys-X-cys, y cys-X _3-cys motivos. Estos motivos también se encuentran en las moléculas de quimioquinas, y sirven para diferenciar las familias de quimioquinas el uno del otro. Una comparación de las secuencias de metalotioneína y las quimioquinas Ccl17 se muestra en la Figura 1A. Además de tener motivos similares cisteína, Ccl17 también se encuentra cerca de la MT en los dos genes de ratones y seres humanos (Figura 1B]. Combinado con nuestro publicados anteriormente observaciones de los efectos extracelular metalotioneína tiene en el desarrollo de T-dependiente de la inmunidad humoral [15] sugiere que la información podría mostrar metalotioneína quimiotaxis actividad.

Naïve esplenocitos y thioglycollate-suscitó leucocitos chemotactically responder a Boyden metalotioneína en la cámara de ensayo en un nivel similar al observado cuando las células se exponen a suero de cobaya utilizada como una fuente de complemento activado (Figura 2A]. Con el fin de evitar la heterogeneidad de las poblaciones de células primarias, la quimiotaxis de dosis respuesta de las células a la metalotioneína se caracterizó utilizando células T Jurkat. Estudios anteriores han demostrado que estas células T expresan CXCR4 (los derivados del estroma factor α-1 (SDF-1 α) del receptor), y la exposición a un SDF-1 α gradiente ha sido demostrado que la quimiotaxis inducir una respuesta [19]. Boyden Uso de la sala de ensayo, encontramos que estas células también responder a metalotioneína (Figura 2B] en una forma dependiente de la dosis. La curva dosis-respuesta muestra un pico de respuesta en el 14,3 μ M, y la forma de la curva es consistente con la de otras quimiocinas [20].

Además de la cámara de ensayo de Boyden, quimiotaxis se evaluó a través de un elaborado recientemente tecnología llamada ECIS / taxis. Este ensayo emplea en virtud de una miniatura de agarosa quimiotaxis cámara en la que la llegada de células en una superficie microelectrode se mide por los cambios en el flujo de la corriente eléctrica a través del electrodo [21]. A diferencia de la cámara de Boyden ensayo, en virtud de la configuración de agarosa permite el establecimiento de la estabilidad y someras quimiotaxis gradientes más que reflejar con precisión los sutiles gradientes encontrados in vivo de la cámara de Boyden ensayo. En ECIS / taxis mediciones, el total de la resistencia a normalizarse el flujo de la corriente es proporcional al número de celdas que ocupan la superficie de un electrodo de la meta. Si no se añade chemoattractant, algunas células de salir del pozo y los que lo hacen nunca alcanzar el objetivo de electrodos y que no ha habido cambios en la resistencia es registrada (Figura 3]. En presencia de un gradiente de metalotioneína, la primera llegada de un pequeño número de células en la meta electrodo está indicado por la aparición de pequeñas, rápidas fluctuaciones de la resistencia. Con el tiempo a medida que más células se acumulan en el electrodo, un gradual aumento de la resistencia se observa. La concentración de metalotioneína añadido a la chemoattractant así que suscitó el mayor aumento de resistencia (Figura 3] y el movimiento más rápido de la respuesta de células T Jurkat (datos no presentados) fue de 14,3 μ M. Esta dosis óptima es similar a la medida con la cámara de Boyden ensayo. La velocidad media de los de más rápido células Jurkat T, 1,56 ± 0,12 μ m / min, se calcula a partir de la hora de llegada de las primeras células en la meta de electrodos. Esta velocidad es comparable a la velocidad de la respuesta de células T Jurkat a un gradiente de la SDF-1 α (1,43 ± 0,1 μ m / min, Figura 3]. Asimismo, la prueba del efecto sobre la metalotioneína WBC 264-9C células. Estas células se ha demostrado que exhiben quimiotaxis movimiento hacia una fuente de complemento activado [22]. En el ECIS / taxis ensayo, WBC 264-9C quimiotaxis hacia las células se activan ambos se complementan y metalotioneína (Figura 4]. La metalotioneína respuesta fue dependiente de la dosis, y la dosis óptima es similar a la que se encuentra con células Jurkat T (datos no presentados). La velocidad media de 264-WBC 9C células en respuesta a un gradiente de conejillo de indias suero utilizado como fuente de complemento activado fue del 1,32 ± 0,2 μ m / min, frente a 0,75 ± 0,03 μ m / min para las células en respuesta a metalotioneína. Sin embargo, la respuesta de la población fue, sin embargo, desde el robusto resistencia total (indicando el número absoluto de células de la respuesta) en última instancia, llegó a un nivel que se aproxima a la producida por las células en respuesta a complementar activado.

A la luz de la posibilidad de que los contaminantes (por ejemplo, pequeños péptidos hígado que co-purificar con el MT) en la venta en el comercio metalotioneína preparativos, nos purifica-metalotioneína afinidad de los preparados comerciales utilizando un anti-metalotioneína anticuerpo monoclonal (UC1MT) junto a CNBr-activated Sepharosa. La metalotioneína purificado también estimula las células Jurkat T quimiotaxis (Figura 5A]. Además, la quimiotaxis respuesta a la original metalotioneína (datos no presentados) o de la afinidad-purificado metalotioneína (Figura 5A] puede ser bloqueado por los pre-incubación de la metalotioneína purificada, ya sea con o UC1MT monoclonal anti-E9 metalotioneína anticuerpos. Ninguno de los dos anticuerpos anti-metalotioneína ni el isotipo IgG _{acompañado-1} (MOPC 21) estimuló el movimiento de células de la meta de electrodos en su propia (datos no presentados).

Activación de la proteína G se ha demostrado que desempeñan un papel en la respuesta y la quimiotaxis esta vía puede ser inhibida por la toxina del cólera (CTX) [23] o la toxina pertussis (PTX) [24, 25]. Células Jurkat T (10 ⁶ células / ml) fueron pre-incubadas con 0,133 μ g / ml CTX o 200 ng / ml de la toxina pertussis y luego colocado en un gradiente metalotioneína. La quimiotaxis efecto de metalotioneína en las células Jurkat T podría ser bloqueado por CTX (figura 5B], y por PTX (figura 5C]. PTX también fue capaz de bloquear la quimiotaxis de las células Jurkat a SDF-1 α.

Una evaluación más directa de quimiotaxis se hizo utilizando time-lapse video microscopio de las células en movimiento en presencia de un metalotioneína o SDF-1 α gradiente. Cuando las células T Jurkat fueron expuestos a un gradiente similar a la presente en el ECIS / taxis ensayo, que podrían ser tomadas en cuenta para salir de la celda y así continuar hasta el gradiente hacia el chemoattractant así. Vías de las líneas generales de estas células muestran la persistencia de movimiento direccional (Figura 6D, E]. En ausencia de un gradiente pocas células así salir de la celda (datos no presentados), y las que se muestran poco movimiento direccional (Figura 6A-C]. La velocidad, la persistencia y la quimiotaxis de los índices individuales de células movimientos sean compatibles con la velocidad calculada utilizando el ECIS / taxis mediciones de los movimientos de la población (Tabla 1]. Con el fin de evaluar el papel de chemokinesis en este proceso, las células se superpone con un pre-formado agarosa hoja que contiene una concentración uniforme de metalotioneína, SDF-1 α o medio solo. El MT-células expuestas movido más rápidamente que las células de control, pero el movimiento carecía de dirección y persistencia fue mucho más lento que el movimiento en un gradiente espacial (Tabla 1 y Figura 6A-C]. Similares resultados fueron obtenidos en un jaquelado análisis de la célula en el movimiento de cámara Boyden formato (Tabla 2]. Metalotioneína añadido a la misma orilla del filtro de las células, o bien a ambos lados de la igualdad de filtro en la concentración dio lugar a un menor número de células llegar a la superficie inferior del filtro que en los pozos donde la metalotioneína se añadió al lado opuesto de la de filtro De las celdas. Estos datos apoyan la conclusión de que ambos metalotioneína induce quimiotaxis y chemokinesis en células Jurkat T.

Otra característica de las respuestas celulares a quimiocinas es un cambio en la cantidad y la distribución de actina polimerizados. Transducción de señales a través de receptores acoplados a proteínas G causas reorganización del citoesqueleto de actina, que conduzca a la formación de los nuevos F-actina lamellipods ricos que se extienden en la dirección del movimiento. Esta reorganización puede ser evaluada por mediciones in vitro de células de actina polimerizados extractos de las células estimuladas con phalloidin [26]. Metalotioneína estimulado un aumento de 19% en el total de F-actina dentro de los 30 segundos y un aumento del 79% por 2 minutos (Figura 7]. El alcance y el momento de esta respuesta es coherente con activación de los receptores en otros tipos de células [27, 28].

Las células del sistema inmunitario operan en un complejo microambiente en el que se presentan con una serie de diferentes y, a menudo señales conflictivas [29, 30]. Las formas en que las células integrar y responder a estas señales puede en última instancia, rigen la forma en que el sistema inmunológico responda a la exposición del antígeno. En algunos casos, el resultado es una respuesta inmune activada que se ha diseñado para eliminar la fuente de antígeno. En otros casos, las células se anérgicos o someterse a la apoptosis y, por tanto, dejar de iniciar o participar en una respuesta inmune a ese antígeno. Uno de los primeros aspectos de la respuesta inmune muchos es el movimiento direccional de las células hacia un sitio de la infección u otras lesiones. Este movimiento direccional es una respuesta a la quimiotaxis factores producidos por algunos organismos infecciosos, a quimioquinas producidas por las células ya en el lugar de la inflamación, o de otros agentes. Las células que expresan receptores de estas señales pueden detectar el gradiente (s) de divulgación de las chemoattractants, y avanzar hacia la fuente del agente. Este quimiotaxis respuesta es un aspecto esencial de la trata de linfocitos.

En este informe se muestra que metalotioneína puede dirigir la quimiotaxis de primaria y transformado leucocitos. Metalotioneína Si bien históricamente se ha pensado como una proteína intracelular, hay numerosos informes que describen su presencia en el suero, orina [31], broncoconstricción alveolar espacios [10], sinusoides hepáticos [32], y de otros lugares extracelular. Si bien el mecanismo (s) de la metalotioneína, que se libera de las células todavía no se ha determinado, las proteínas de choque térmico 70 [33], β-1, [34] y el factor de crecimiento fibroblástico [35] se encuentran entre una serie de proteínas que la falta de señales y secuencias No obstante, son liberadas de las células por un no tradicional mecanismo secretor. Estos resultados indican que la respuesta de las proteínas de estrés pueda tener acceso al medio extracelular a través de mecanismos distintos de la lisis celular, y sugieren que una comprensión profunda de los papeles que desempeñan los inmunomoduladores metalotioneína debe incluir el espacio extracelular.

Metalotioneína se sintetiza en respuesta a la fase aguda de citoquinas (por ejemplo, IL-1, IL-6 y TNF-a) que son secretados en los sitios de la inflamación [36 - 38] en una variedad de contextos en los que las actividades están cambiando inmune. Metalotioneína también es sintetizado en las células expuestas a los glucocorticoides, una señal de que se asocia a menudo con los entornos estresantes [39]. Además, metalotioneína puede ser inducida por especies reactivas del oxígeno, por endotoxina [40], y, en células expuestas a los cationes divalentes de metales [1]. Con todas estas diferentes iniciadores, no es de extrañar que los niveles elevados de metalotioneína se detectan en el contexto de las enfermedades neoplásicas [41, 42], enfermedad autoinmune [43], la inflamación crónica [44], y la infección [45]. Trabajos anteriores de nuestro laboratorio y otros han demostrado que pueden tener importantes metalotioneína inmunomoduladoras. Por ejemplo, es capaz de disminuir metalotioneína T dependientes respuestas humorales y puede alterar la capacidad proliferativa de los linfocitos [16], disminuir la función de células T citotóxicas [46], y puede alterar la función efectoras de los macrófagos [47]. La insuficiencia de expresión de metalotioneína en el contexto de la enfermedad inflamatoria pueden acortar drásticamente de vida [43], y exógenos metalotioneína puede disminuir la severidad de la artritis inducida por colágeno [48].

Hay multitud de estudios que demuestran que las diferentes formas de estrés procedentes de fuentes externas pueden alterar la función inmunológica normal [49]. Psicológica, física y de los agentes químicos que inducen estrés cada afectan al sistema inmunitario. En algunos casos, estos estresores reprimir el funcionamiento inmune eficaz, que haga que el individuo susceptible a los agentes patógenos infecciosos. En otros casos, el resultado inmune modificaciones indeseables en el aumento en el reconocimiento inmune de los antígenos libre, en última instancia, resulta en enfermedad autoinmune. Estos estresores que se sabe que inducen la síntesis de metalotioneína y pueden alterar funciones inmunitarias, en parte, a través de su efecto sobre la metalotioneína.

Hemos demostrado metalotioneína inducida quimiotaxis celular movimiento en la cámara de ensayo tradicionales Boyden, por análisis computarizado de imágenes time-lapse movimiento de las células, y el uso de la ECIS / taxis ensayo. Hemos demostrado que la respuesta de las células T Jurkat a un gradiente de metalotioneína se corresponde bien con las respuestas quimiotaxis de los leucocitos a otros agentes. T células Jurkat y WBC 264-9C migran en respuesta a un gradiente de metalotioneína a velocidades que son similares a las encontradas en otros sistemas [50, 51]. Además, la pauta de dosis-respuesta a la metalotioneína es una curva en forma de campana similar a la de otros clásicos quimiocinas [20]. Una consideración importante es si la respuesta a la quimiotaxis metalotioneína se produce a concentraciones fisiológicamente relevantes. Chemoattractants puede actuar a través de una muy amplia gama de concentración (por ejemplo, registros de 4) [52, 53], porque el sentido de las células locales chemoattractant espacial diferencial en la concentración. Nuestro trabajo muestra que el 1 º y el 10 μ M metalotioneína puede estimular la quimiotaxis de las células en ambos Boyden y de los menores de ensayos de agarosa. Mayores concentraciones de metalotioneína utilizados en la ECIS / taxis ensayo se refieren a las concentraciones añadido a la micro-volumen chemoattractant pozos, que luego se diluyen en el proceso de difusión fuera de la fuente. La metalotioneína importes utilizados en estos experimentos representan concentraciones biológicamente razonable, habida cuenta de que metalotioneína se ha medido en concentraciones de 1 μ M en el suero (lo cual sería sustancialmente diluida de la fuente de tejidos de concentración) en los pacientes normales, y en personas que están sometidas a algún tipo de estrés ( Inflamación, el cáncer, la exposición tóxica, etc) [54].

La quimiotaxis respuesta a la metalotioneína puede ser bloqueado por los anticuerpos monoclonales a la metalotioneína mientras isotipo de concordancia de anticuerpos no tiene efecto. Este bloqueo de la respuesta es un importante control, desde comerciales metalotioneína preparados contienen péptidos contaminando el tejido hepático a partir de la fuente (D. Lawrence, comunicación personal). Dado que tanto la toxina del cólera y toxina pertussis bloque de la metalotioneína iniciados quimiotaxis, es probable que la señalización mediada por la proteína G está involucrada en la respuesta. Otro aspecto común de la quimiotaxis de señalización es una activación de los mecanismos de la polimerización de actina en respuesta a un fuerte aumento de la concentración chemoattractant [26, 55]. Metalotioneína provoca un aumento tanto en el total de F-actina en el contenido y periféricos F-actina. Será de gran interés para determinar el receptor de metalotioneína y de la vía de transducción de señales que conduce a la polimerización de la actina.

Es intrigante especular que una vez fuera de la célula, metalotioneína sirve como una de las muchas señales diseñado para extraer células inmunocompetentes a los sitios de estrés celular. Nuestra observación (s) que metalotioneína y anti-metalotioneína inyecciones modificar inmune actividad in vivo sugieren que hay una variedad apropiada de metalotioneína extracelular en la que normalmente los leucocitos función [14, 15]. Un par de informes recientes sugieren que citosólica de los mandantes en apoptosis se liberan al espacio extracelular y el apoyo de la progresión del proceso inflamatorio [56, 57]. En estos informes se sugiere también que la liberación de componentes citosólica de estas células mueren podría representar una de las señales a la central "Peligro Hipótesis", propuesto por Matzinger et al. [58, 59]. Esta hipótesis sostiene que la participación activa de la respuesta inmune no puede ser montado sin una señal que indica que se ha producido el daño en las células. Mientras que otros informes han sugerido que las proteínas de choque térmico puede cumplir ese papel [60], metalotioneína es otro posible candidato a la señal de peligro.

Células Jurkat T, (TIB-152, American Type Culture Collection (ATCC), Bethesda, MD) se mantuvieron en completo RPMI 1640 los medios de comunicación con L-glutamina que contiene el 10% de SFB inactivado por calor (Mediatech, Herndon, VA), el 1% de sodio Bicarbonato, 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, el 1% de sacarosa, y 1 mM piruvato de sodio a lo recomendado por la ATCC. WBC 264-9C líneas celulares (HB-8902, ATCC) se mantuvieron en la mínima Essential Medium (Eagle) con Earle equilibrado de solución de sal (BSS), que contiene el 10% del calor de suero bovino fetal inactivado. Todas las células se cultivaron en un incubador humidificado con 5% de CO ₂ en el aire a 37 ° C. El WBC 264-9C es una macrófagos-como línea celular que es quimiotaxis a N-formylmethionyl-leucyl-fenilalanina [61]. Los medios de comunicación se repusieron cada tres días.

SDF-1 α (Synthetic Humanos SDF-1 α) se adquirió de BD Biosciences (Bedford, MA). BSA (DNasa, RNasa, y libre de la proteasa) y hema-3 mancha se compraron kit conjunto de la Ciencia Inc Fisher (Pittsburgh, PA). Una mezcla de Cd, Zn-metalotioneína Iy II purificada de hígado de conejo, ratón IgG _1, kappa (MOPC21) inmunoglobulina purificada, y la toxina pertussis, fueron adquiridos de Sigma Chemical Co (St Louis, MO). SeaKem GTG ^{® ®} Agarosa se obtuvo de BioWhittaker Molecular Aplicaciones (Rockland, ME). Metalotioneína anticuerpos monoclonales UC1MT (IgG _1, kappa) [14, 15], disponible a partir de StressGen, Inc, Victoria, BC y E-9 (IgG _1, kappa), adquiridos a Zymed Laboratories Inc (San Francisco, CA) Utilizado en algunos experimentos. La toxina del cólera fue adquirido de la Lista Biológica Laboratories, Inc (a través de Cedarlane, Ltd, Hornby, ONT Canadá). Conejillo de suero fue comprado a la compañía Suero Colorado (Denver, CO).

UC1MT fue purificado en ProteinG-Sepharosa (Sigma), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo purificado fue luego junto a CNBr-activated Sepharosa (Sigma), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Metalotioneína I y II, preparado en PBS, se mezcla con el inmovilizado UC1MT y permitió a encuadernar. Después no se habían consolidado las proteínas fueron arrastrados por las aguas de la matriz de afinidad, específicamente la proteína fue capturado eluye con glicina 0,1 M HCl, pH 2,8, ajustada a pH 7,4 y dializados contra PBS.

El micro-Boyden ensayo fue realizado utilizando una cámara de 48 así aparato (NeuroProbe, Cabin John, MD). Polyvinylpyrrolidone (PVP) libre de las membranas de los filtros de policarbonato con 5 μ m poros se obtuvieron de la misma fuente. La disminución de las cámaras de los aparatos fueron cargados con 30 μ l de chemoattractant diluido en los medios de comunicación, PBS vehículo en los medios de comunicación, o los medios de comunicación por sí solo y luego se cubre con la membrana y la Cámara alta. Cincuenta microlitros de la suspensión celular (2 × 10 ⁶ células / ml) fue añadido a la Cámara alta. Después de incubar durante 2 horas humidificado en una incubadora a 37 ° C en 5% de CO _2, los filtros han sido recogidos, las células que se mantuvo en la superficie superior del filtro y se eliminaron los filtros fueron procesados de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El número de células migraron fueron contados bajo magnificación × 400. Para cada uno de los seis pozos de repetir, el número de células en al menos seis campos y se determinó la media y desviación estándar se calculó.

Este ensayo se realizó según lo descrito anteriormente, con modificaciones menores [21]. Lineal electrodo ECIS cámaras (Biofísica Aplicada, Inc Troy, NY) fueron utilizados en los análisis descritos aquí. Objetivo electrodos fueron 0,02 × 2 mm, y se utilizaron en una orientación en la que el eje largo de la meta de electrodos se orientó perpendicularmente a la dirección de migración celular. Todas las cámaras que contienen electrodos son pre-tratados con 10 mM de cisteína de 15 minutos a temperatura ambiente para estabilizar el rendimiento eléctrico de los electrodos de oro, lavados tres veces con agua destilada estéril, y se seca en un estándar de seguridad de la biotecnología campana de flujo laminar. Luego de 250 μ l fundido 0,5% en gel de agar (disuelto en RPMI 1640 con 10% de SFB) se añadió a cada cámara y permitir que se enfríe. Dos pozos fueron cortados con una cánula calibre 14 afilado igualmente distantes a ambos lados del electrodo y separados combinada intrawell distancia de aproximadamente 1,9 a 2 mm. Luego de 7 μ l de la suspensión celular (15 × 10 ⁶ células / ml para las células T Jurkat y 10 × 10 ⁶ células / ml para WBC 264-9C células) se colocó así en la célula y un volumen igual de chemoattractant o de control del vehículo se dispensan En la opuesta. A 1 voltios de corriente alterna en corriente de los 4000 Hz es pasado a través del electrodo, y la resistencia del circuito se calculó. Célula de circulación fue evaluada por mediciones de los cambios en la resistencia causada por la llegada de las células en la meta de electrodos. Los datos son reportados como el cambio en la resistencia a la meta electrodo normalizado a la resistencia inicial del sistema. Además del aumento general de la resistencia causada por células que cubre el electrodo, la rápida fluctuaciones de la resistencia son indicativas de los cambios en la forma y superficie de la adhesión de las células, y de la continuación de la viabilidad celular y la circulación.

Para algunos experimentos de quimiotaxis, 3,5 ml de 0,5% de agarosa (disuelto en el medio con 10% de SFB y 20 mM HEPES) fue cargado en una cápsula de Petri de 35 mm. Después de la agarosa solidificado, 2 pozos separados por unos 2 mm se cortaron en la agarosa. Uno así fue cargada con 7 μ l chemoattractant o de los medios de comunicación y la oposición así se cargó con 7 μ l de la suspensión celular. La cápsula de Petri se selló con Parafilm para retener la humedad y se incubaron en el microscopio de fase a 37 ° C. La temperatura se mantuvo por la que remite el microscopio en una caja de espuma de poliestireno en la que una temperatura constante de aire fue proporcionada por un Aire Térm comentarios regulado calentador (WPI, Inc, Sarasota FL). Chemokinesis en el medio ambiente en virtud de agarosa fue investigado por la siembra de las células a la superficie de la cápsula de Petri en medios líquidos. Después de que las células se habían asentado, superpuestos a los medios de comunicación fue removido y las células fueron recubiertas con un pre-gelled capa de agarosa que contiene una concentración uniforme de los diferentes estímulos o medio solo. Imágenes de las células se tomaron a intervalos regulares utilizando un CCD-72 cámara de vídeo analógica (Dage, Michigan City, IN) y Scion frame grabber controlada por Scion Image (Scion, Inc, Frederick, Maryland) software. Las imágenes fueron recopiladas en películas de dominio público utilizando el software Image J [62]. Las trayectorias de las células fueron analizadas de estas películas utilizando dinámico sistema de análisis de imagen (DIAS) software (Solltech, Inc, Oakdale, IA). Trayectorias de un número de células de cada una de las condiciones (véase el n en el cuadro 1] fueron localizadas y analizada a través de las películas. Cada celda se supervisan para el mismo intervalo de tiempo total y los datos se presentan como la media de todas las células analizadas.

Mediciones polimerización de la actina: Las células se hilar a 200 × g durante 5 minutos y resuspendido en RPMI 1640 con 10% FBC en una densidad de 2 × 10 ⁶ células / ml. Las células fueron estimuladas con cualquiera de las dos SDF-1 α (datos no presentados) o 2 uM metalotioneína a 37 ° C y luego fija con 3,7% formaldehído durante 15 minutos en Buffer F en un rotador a temperatura ambiente (5 mM KCl, 138 mM NaCl, 4 MM NaHCO _3, 0,4 mM KH ₂ PO4, 1,1 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM de MgCl _{2, 2} mM EGTA, 5 mM TUBERIAS, pH 7.2). Las células fueron centrifugadas fijo y resuspendido en 1 ml de 0,5% Tritón X-100 en Buffer F por 20 minutos y teñidas en 1 uM TRITC Phalloidin en Buffer-F en un rotador durante 1 hora a temperatura ambiente. Se les pildoradas, lavar con 5 ml Buffer F dos veces, y re-suspendido en 850 μ l de Buffer F. La TRITC-Phalloidin fluorescencia en la suspensión celular fue utilizado un Spectramax M2 fluorimeter (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 544 Nm de excitación y 580 nm de emisión. En cada pozo, la fluorescencia de crudo, de 9 puntos, se midieron y se utilizan para calcular el promedio y fluorescencia.

XY diseñado y llevado a cabo todos los experimentos redactado el manuscrito. DAK y LMA concebido del estudio, y participaron en su diseño y la coordinación y la ayudó a los autores originales. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.