Journal of Carcinogenesis, 2005; 4: 18-18 (más artículos en esta revista)

Telomerasa expresión es suficiente para la integridad cromosómicas en las células que carecen de p53 depende G 1 puesto de control de la función

BioMed Central
A Dennis Simpson (dennis@email.unc.edu) [1], Elizabeth Livanos (ELivanos@ils-inc.com) [1], Timothy P Heffernan (THEFFERNAN@PARTNERS.ORG) [1], William K Kaufmann (William_Kaufmann @ Pathology.med.unc.edu) [1]
[1] Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Lineberger Comprehensive Cancer Center, y en el Centro de Salud Ambiental y Susceptibilidad de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, CB 7295, Chapel Hill, NC 27599, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Secundaria culturas de los fibroblastos humanos de mostrar una vida finita que termina en la senectud. Pérdida de la función de p53 por mutación o viral oncogén expresión desvíos de senectud, lo que permite la división celular de continuar por un período adicional de 10 - 20 doublings. Durante este tiempo visto aberraciones cromosómicas en las células mitóticas aumento mientras que los daños del ADN y decatenation funciones en el puesto de control de las células disminución G 2.

Métodos

Para estudiar esta compleja interacción entre la inestabilidad cromosómica y el puesto de control de la disfunción, las líneas de fibroblastos humanos que se derivaron expresó HPV16E6 oncogénica o alelos dominantes negativos de p53 (A143V y H179Q) con o sin la subunidad catalítica de la telomerasa.

Resultados

Las células con p53 normal función visualizada 86 - 93% G 1 arresto después de la exposición a 1,5 Gy las radiaciones ionizantes (RI). Expresión de HPV16E6 o p53-H179Q severamente atenuada G 1 puesto de control de la función (3 - 20% de detención), mientras que p53-A143V expresión inducida por intermedio de atenuación (55 - 57% de detención), independientemente de telomerasa expresión. Todas las líneas celulares, independientemente de telomerasa o expresión de p53, exhibió una normal daño en el DNA G 2 puesto de control de la respuesta después de la exposición a 1,5 Gy IR antes de la senectud puesto de control. Como las células telomerasa-negativos dejado de lado a la senectud, las frecuencias de aberraciones cromosómicas aumentaron en general, congruentes con la atenuación de la función de control de G 2. Telomerasa expresión permitido células con p53 defectuoso función de crecer> 175 doublings sin aberraciones cromosómicas o atenuación de la función de control de G 2.

Conclusión

Así, la inestabilidad cromosómica en células con p53 defectuoso funcionamiento parece depender de la erosión no telómero pérdida de los daños del ADN inducidos G 1 puesto de control.

Antecedentes

Normal diploide fibroblastos proliferan en secundaria culturas para un número finito de la población doublings hasta un crecimiento de detención conocido como senescencia replicativa, o M1, que se alcance [1]. Esta limitación en la vida útil que se cree que es debido a la continua reducción de los telómeros con cada división celular [2]. La evidencia reciente sugiere que una alteración en la estructura de uno o más telómeros puede, de hecho, lo que activa las células para entrar en la senescencia replicativa, un permanente p53-dependiente G 1 arresto [3, 4]. Independientemente de la precisa disparador de la senectud, la inactivación de p53 permite que las células de pasar por alto la senectud y continúan dividiendo hasta una segunda restricción del crecimiento denomina crisis, o M2, se llega a [5]. Las células en crisis estructural y contienen numerosas anomalías cromosómicas numéricas que puede ser debido a los ciclos de la fusión de los cromosomas (cromosomas dicéntricos) y la posterior resolución de la fusión (cromosoma pausa) durante la mitosis [2]. Un estudio previo ha demostrado que durante la fase de la ampliación de bypass después de la proliferación de M1, en los telómeros-p53 defectuoso, la telomerasa-negativos células pueden erosionar hasta el punto de que poco o nada de repetir teloméricas de ADN pueden detectarse [6]. Cromosomas sin telómeros parece ser sustratos de las vías de reparación del ADN resultante de las asociaciones telómero y la formación de los cromosomas dicéntricos y anillos. La resolución de estas estructuras inestables se cree que el resultado en las otras alteraciones numéricas y estructurales en los cromosomas en las células observadas en crisis (es decir, las pausas, los intercambios, aneuploidía, poliploidía).

Prevención de la erosión por el telómero ectópico expresión de la subunidad catalítica de la telomerasa humana (hTERT) Se ha demostrado que prevenir crisis SV40 en células que expresan el antígeno T grande o HPV16E6 oncogénica [7 - 10]. Fibroblastos normales diploides humanas que expresan hTERT se ha informado de mantener un cariotipo normal y preservar la función de control del ciclo celular para al menos 200 habitantes doublings [11, 12], aunque otros han sugerido que de otro modo normal de telomerasa-expresando fibroblastos humanos do mostrar alteraciones en la expresión de Genes supresores de tumores, características de crecimiento, y transitorios inestabilidad genética [13 - 16] Estos estudios no han logrado abordar directamente la cuestión de si las células pueden mantener la estabilidad del genoma en la ausencia de un daño funcional del ADN inducidas G 1 puesto de control. Aquí mostramos que, en ausencia de telómero erosión de las células defectuosas para señalización de p53 puede mantener estable genomas de> 175 población doublings. Este estudio encontró que las células normales diploides expresando hTERT mantener un cariotipo normal de por lo menos 100 de la DP, pero en su momento se hizo numéricamente anormal. Nos informan también de que dos independientes-p53 defectuoso líneas que surgió de la crisis por la reactivación de la telomerasa muestran notablemente estable cariotipos.

Materiales y métodos
Plásmidos y virus

Todos clonación medidas se llevaron a cabo de acuerdo con los métodos estándar [17]. Plásmidos se mantuvieron en el DH5 α cepa de E. Coli. Replicación de los retrovirus defectuoso utilizado en este estudio y de ayuda para el envasado de plásmidos se muestran en la figura 8. La expresión de vectores retrovirales hTERT, pDSWK-8, fue creado por la clonación de hTERT cDNA pBABE / Hyg-hTERT (Dr. Robert A. Weinberg, del Instituto Whitehead para Investigación Biomédica) en el EcoRI y HpaI sitios de la pHIT-2 retrovirales columna vertebral (Dr. John Olsen, de la Universidad de Carolina del Norte). CDNA de codificar una sustitución de alanina a valina en el aminoácido histidina 143 o una sustitución de glutamina en el aminoácido 179 en p53 (p53 y p53-A143V-H179Q respectivamente) fueron proporcionados por los Dres. David Wynford-Thomas (Universidad de Aberdeen) y el doctor Howard Liber (Massachusetts General Hospital), respectivamente. Retrovirales vectores de expresión que contienen estas dominante-negativo formas de p53 se construyeron por la clonación con fines de cDNA en el sitio EcoRI del pLXIN (Clonetech) expresión de vectores retrovirales. El pLXSN-E6 retroviral vector de expresión que contiene el HPV16 E6 oncogénica de ADN fue un regalo del doctor Denise Galloway (Fred Hutchinson Cancer Center). Virus de la estomatitis vesicular glicoproteína G-pseudotyped, la replicación de los retrovirus defectuosos se produjeron a lo descrito previamente siguientes transfección transitoria de los vectores virales y de ayuda de los plásmidos en células HEK 293T [18 - 20]. Transfections de plásmidos para el virus de la producción se hace usando Superfect o Polyfect ™ ™ (Qiagen), según el protocolo del fabricante.

Cell Cultura

Un humano normal fibroblastos cepa fue designado NHF1 derivados de prepucio neonatal como ha sido descrito previamente [21]. Todo el cultivo de células, incluyendo la producción de retrovirales, se realizó en un humidificado, el agua envueltos incubadora a 37 ° C con el 5% de la atmósfera de CO 2. NHF1 todas las células y líneas celulares derivadas de la cultura de sus padres NHF1 secundario se mantuvieron en MEM (Invitrogen Corp Gibco) suplementado con 10% suero bovino fetal definidos (Hyclone), 2 mM L-glutamina (Gibco Invitrogen Corp), y 100 μ M No aminoácidos esenciales (Gibco Invitrogen Corp). HEK 293T células se mantuvieron en MEDM-H (Invitrogen Corp Gibco) suplementado con 10% suero bovino fetal definidos (Hyclone), 2 mM L-glutamina (Gibco Invitrogen Corp), 100 μ M no aminoácidos esenciales (Gibco Invitrogen Corp .), Y 20 mM HEPES pH 7.3 (Sigma Chemical Co). Transductions se llevaron a cabo de acuerdo con métodos estándar como se describe anteriormente [22]. Las células en los pasajes de 5 o 6 se transduced simultáneamente con la expresión de hTERT-virus, y uno de los virus de perturbar la función de p53 y / o vectores de vacío para extraer las líneas celulares que figuran en el cuadro 1. En el momento de transducción, la NHF1 células se calcula que han sufrido 15 - 20 población doublings in vitro. Transductants fueron seleccionados de 2 semanas de crecimiento en los medios de comunicación que contiene 300 ng / ml puromycin (Sigma Chemical Co), más de 200 μ g / ml de activos G418 (Gibco Invitrogen Corp) y, a raíz de esta primera selección, las líneas se mantuvieron sin antibióticos. Las células fueron sembradas cada paso en una densidad de 5300 - 5500 células por cm 2. El nivel de duplicación de población (PDL) de la cultura se define como la suma de la población doublings (PD) de cada paso. El PD de cada paso se determina mediante la siguiente ecuación:

Líneas celulares fueron controlados por micoplasma contaminación utilizando el kit de Gen-Probe (Gen Probe Inc San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Mediante este método de las líneas celulares se mantuvo libre de micoplasma para la duración del estudio.

Análisis de puesto de control del ciclo celular

Puesto de control de daños del ADN respuestas fueron evaluadas después de la exposición a 1,5 Gy de IR de una fuente de Cs 137 (GammaCell 40, MDS Nordion, Canadá) en una dosis de la tasa de 86 rads por minuto. G 1 puesto de control de la función se evaluó midiendo 5-bromo-2'-deoxi-uridine (BrdU, Sigma Chemical Co), la incorporación de seis a ocho horas después de la exposición a 1,5 Gy como ha sido descrito previamente [23 - 25]. Citometría de flujo y microscopía determinación de los índices mitótico, se mostró a resultados equivalentes, [26, 27]. Daño en el DNA G 2 puesto de control de la función se evaluó determinando el índice mitótico de las culturas dos horas siguientes a la irradiación. Índice mitótico se determinó a través de citometría de flujo para medir el número de células que expresan el fosfato histonas H3 mitótico epítopo o directamente por el recuento de Giemsa o DAPI-manchado figuras mitóticas como ha sido descrito previamente [28 - 30] Bobina puesto de control de daños se evaluó la función de la siembra de células En soporte de 100 ng / ml colcemid (Sigma Chemical Co) durante 24 o 48 horas. Las células fueron marcadas con BrdU durante las dos últimas horas de la incubación. Las células fueron analizadas por citometría de flujo, tal como se describe más arriba para determinar el porcentaje de células con> 4n ADN contenido.

Los análisis cromosómicos

Metafase se prepararon extiende desde las 8 líneas celulares que figuran en la Tabla 1 en el plazo más breve posible tras PDL selección y, a continuación, cada 10 - 20 PD hasta telomerasa-negativos células alcanzado crisis. Metafase Todos los preparativos se realizaron de acuerdo a métodos descritos anteriormente [6]. Cincuenta metafases de cada línea celular en cada PDL se analizaron y anotó para el número de cromosomas, y los números y tipos de anormalidades estructurales. G-bandeo fue realizado de acuerdo a protocolos estándar [31] y el representante cariotipos fueron reunidos después de análisis, de 20 a 25 metafases.

Western blot

Logarítmicamente creciente células fueron sembradas en el 5 × 10 5 por 100 mm de plato y se incubaron durante 48 hr. Culturas fueron irradiados como se ha descrito anteriormente y se incubaron durante 6 horas a 37 ° C. Las células fueron cosechadas por trypsinization, una vez lavadas en PBS, y resuspendido en buffer de lisis (100 mM tampón fosfato sódico, pH 7,2, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 1,5 M NaCl, 10% NP40, complementado con 10 mM 4 - (2 - Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoruro (AEBSF, Sigma Chemical Co), 10 mM β-glicerofosfato (Sigma Chemical Co), 10 mM orthovanadate de sodio (Sigma Chemical Co), y 10 ug / ml de leupeptina (Sigma Chemical Co) Y aprotinina Sigma Chemical Co). Se determinaron las concentraciones de la proteína usando el Bio-Rad Protein C D Assay (Bio-Rad Laboratories), según el protocolo del fabricante. Las muestras que contengan 100 μ g de proteína se mezcla con un volumen igual de 2 × muestra Laemmli buffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS 4%, el 20% de glicerol), que contiene 5% de β-mercaptoetanol (Sigma Chemical Co), cocidos, Y separados por SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y determinada con anticuerpos contra p21 Waf1 (Neomarkers) y detecta con cabra anti-conejo HRP utilizando el sustrato ECL (Amersham Pharmacia Biotech).

Resultados
Validación de líneas celulares

En este estudio se utilizaron ocho líneas de células diferentes isogénicas sólo en la expresión de la telomerasa y la función de p53 como se indica en la Tabla 1. Tras la selección de las células transduced con DSWK-8 (F1-hTERT líneas) se analizaron expresión de la telomerasa por TRAP ensayo [32 - 34]. Como se muestra en la Figura 1, todas las líneas celulares transduced con DSWK-8 se telomerasa-positivos. Transduced líneas celulares con el vector vacío telomerasa (HIT) se telomerasa-negativos (datos no presentados). Western inmunoblot análisis confirmaron que había importantes sobreexpresión de p53 en las líneas de expresión de la p53 y p53-V143A-H179Q alelos, y no detectables de p53 en líneas expresando HPV16E6 (no se muestra).

La capacidad de las células para retrasar la entrada en fase S después de la exposición a 1,5 Gy de las radiaciones ionizantes (RI) se evaluó como un índice cuantitativo de p53-dependiente G 1 puesto de control de la función (Figura 2]. El F1-HIT LXIN + y F1 + hTERT-LXIN líneas celulares que tienen un p53 intacto vía de señalización muestran un eficaz G 1 puesto de control de la respuesta al daño del ADN. En esta línea el porcentaje de células en la primera mitad de la fase S 6 - 8 h después de la irradiación se redujo en más de 75% debido a la detención G 1. Transduced células con p53 y HPV16E6-H179Q expuestos severamente atenuada G 1 puesto de control de la función. Menos de 15% de las células que expresan HPV16E6-se demoraron en G 1 mientras que las células que expresan p53-H179Q había <25% detenido en G 1 después de la irradiación. Líneas celulares que expresan el p53-A143V dominante-negativo forma de p53 mantenerse aproximadamente la mitad de la normal G 1 puesto de control de la respuesta de aproximadamente el 50% de las células irradiadas retraso en G 1. Expresión de telomerasa no tuvo ningún efecto sobre el inducido por radiación G 1 detención.

El análisis por inmunotransferencia expresión de p21 Waf1 confirmó el análisis biológico de la G1 puesto de control (Figura 3]. Transduced líneas celulares con el vector vacío LXIN expresó p21 Waf1 simulacro tratados en los controles y de expresión es inducida después del tratamiento con IR. Líneas de expresión de p53 y HPV16E6-H179Q, que muestran graves atenuación de G 1 puesto de control de la función, no expresó p21 Waf1 simulado en tratados ni los controles después de la irradiación. Líneas de expresión de p53-A143V no se ha mostrado pleno de la ablación o la inducción de la expresión p21 Waf1 como se pone de manifiesto por el bajo nivel de expresión en el simulacro-y algunos tratados de control de inducción de la proteína después de la irradiación. Como en el caso de la radiación inducida G 1 arresto, la expresión de la telomerasa no afecta a la expresión o la inducción de p21 Waf1. Expresión de HPV16E6 y p53-H179Q ablated expresión de p21 Waf1 y una severa inducida atenuación de G 1 puesto de control de la función, mientras que la expresión de p53-A143V atenuada expresión de p21 Waf1 tiempo que se reduce G 1 puesto de control de la función en un 50%. Así, el p53-A143V líneas mostradas sólo una pérdida parcial de la función de p53.

En contraste con la diversidad de sus respuestas en el ADN daños G 1 puesto de control de la no telomerized F1-HIT-p53 + A143V línea se comportaron como la no telomerized F1-HIT HPV16E6 + y F1 + p53-HIT-H179Q líneas y dejado de lado a la senescencia replicativa Puesto de control durante el envejecimiento in vitro. Cell población expansión se vigila continuamente y todos los de la telomerasa-negativos líneas mostradas inicialmente equivalente crecimiento in vitro (Figura 4A]. Células que expresan el HPV16E6 o alelos dominantes negativos de p53 siguió creciendo durante 15 - 20 población doublings más allá de los 60 en la que PDL F1-HIT + LXIN senesced y detenido el crecimiento (Figura 4A]. Después de la muerte de las células PDL 78 excedido en el nacimiento de células telomerasa-negativas, E6-expresando la cultura, y la cultura por lo que se murió clásicamente conocido como telómero crisis [35]. Aunque doublings población no aumentó más allá de PDL 80 - 85 en el p53 y p53-A143V-H179Q líneas por un período de aproximadamente 18 semanas y las células parecen estar en crisis, de células viables, sin embargo, se mantuvo en los platos. Después de 36 semanas de la cultura, el crecimiento demográfico se reanuda inmortal y dos líneas fueron recuperados. El comportamiento de las líneas celulares es similar a la detallada anteriormente [25] con p53-efectiva, la telomerasa-negativos en fibroblastos después de 60 senescencia replicativa doublings población, y de la p53 defectuoso, la telomerasa-negativos senectud sin pasar por las líneas y luego sometidos a telómero crisis.

Población de la ampliación en las líneas transduced directamente con hTERT fue continua y equivalente a la observada en telomerasa-negativos en líneas PDL 40 - 60 y en la espontánea inmortalizada en líneas PDL 90 - 110 (Figura 4B]. Las líneas de expresión de hTERT-se llevaron a PDL> 175 sin reducción de la tasa de crecimiento. P53-G 1 puesto de control dependientes de la función se vigila durante las diferentes fases del envejecimiento celular in vitro y que no varían sustancialmente (Tabla 2]. Además espontáneamente la línea inmortalizada de células que expresaban el p53 y p53 negativos A143V alelo dominante todavía era capaz de inducir una pequeña cantidad de p21 Waf1 después de la exposición a 1,5 Gy (Figura 5]

Un informe anterior indicó que algunos dominante-negativo alelos de p53 inducida por una ganancia de función [36]. Esta ganancia de la función fue identificado mediante un "husillo daño" ensayo que mide la capacidad de las células para convertirse en poliploides microtúbulos cuando se incubaron con venenos tales como colcemid. Este fenómeno se examinó en el período de cuatro telomerized líneas celulares derivadas de este estudio. Después de 24 o 48 horas de incubación en 100 ng / ml colcemid, las células fueron etiquetados durante dos horas con BrdU y luego analizadas por citometría de flujo para determinar la tasa de síntesis de ADN en el núcleo diploide y tetraploide. Como se muestra en la Figura 6, todas las líneas de células con p53 deficiente señalización sufrió endorreduplicación y se muestra el aumento de la frecuencia de la fase S-tetraploide células cuando se incubaron en colcemid. El isogénicas hTERT-F1 + LXIN línea con efectivo p53-dependiente G 1 puesto de control de la función no se ha mostrado esta endorreduplicación cuando se incubaron con colcemid. Así, la inactivación de p53 con HPV16E6 oncogénica expresión inducida por la misma susceptibilidad a la endorreduplicación durante el periodo de incubación en colcemid como se vio el uso dominante-negativo alelos mutantes de p53 a p53 perturbar la señalización.

La inestabilidad cromosómica

Una evaluación de la integridad cromosómica se hizo en los ocho líneas de células dentro de los cinco población doublings de transducción de genes para evaluar el nivel de fondo de las alteraciones numéricas y estructurales en la población y luego en el PDL 60 (normal senescencia replicativa punto), y PDL 75 - 85 ( Crisis). El cuadro 3 muestra que no existen diferencias entre las diversas líneas de células PDL en el primer examen. Como se ha observado previamente a la transducción de telomerasa-negativas con fibroblastos HPV16E6 [6], poco después de la inactivación de p53 con los alelos dominantes negativos, el número y la estructura cromosómica parecía normal. Sin embargo, como las líneas de edad y se acercó a la normal senescencia replicativa punto 60 de doublings población, el número de metafases que exhiben alteraciones estructurales y numéricas aumentado de manera espectacular en la telomerasa-negativos líneas de células con p53 defectuoso función. En PDL 76 - 77, la mayoría de metafases derivados de la telomerasa-negativos HPV16E6-, p53-A143V-, y p53-H179Q-expresando células expuestas hypodiploidy y / o cromosomas dicéntricos. La p53 defectuoso de las líneas que se transduced con hTERT para expresar telomerasa no mostrar estos envejecimiento relacionados con inestabilidades en el cromosoma número y estructura.

Atenuación de los daños del ADN G 2 puesto de control de la función

Estudios anteriores de este laboratorio han demostrado que el daño del ADN G 2 puesto de control de la función se convierte en atenuadas en congruencia con inestabilidad cromosómica [6, 25, 29]. Figura 7 representa daño en el DNA G 2 en el puesto de control de la función en las distintas líneas celulares in vitro PDL. El F1-HIT LXIN + y F1 + hTERT-LXIN líneas muestran una típica G 2 puesto de control eficaz de respuesta con un promedio de> 95% de G 2 células que se retrasó en su entrada a la mitosis después del tratamiento con 1,5 Gy. Expresión de la dominante-negativo y HPV16E6 alelos de p53 inducida por la atenuación de un modesto puesto de control de la función G 2 medido a PDL 30 - 40 con 7 - 24% de p53 defectuoso de las células inducida por la radiación evadir G 2 demora. La telomerasa-negativos líneas expresando p53-A143V y HPV16E6 mostradas más graves de atenuación de G 2 puesto de control de la función con el envejecimiento in vitro. Por estas células en el PDL 70 - 80, el índice mitótico en células irradiadas fue alrededor de la mitad de la observada en los tratados de control simulado. La telomerasa-negativas, p53-H179Q muestras de una línea más modesta G 2 decremento de la función de control durante el envejecimiento en la mayoría con el 17% de las células evadir G 2 demora. Esto representa el primer ejemplo de un total de siete análisis independientes de p53 defectuoso de los fibroblastos humanos [6, 25, 37] en la que G 2 puesto de control de la función no parece ser severamente atenuada en células en crisis. Curiosamente, el G 2 puesto de control de la respuesta de las dos líneas espontáneamente derivados inmortal (F1-HIT-p53 + A143V Inmortal y F1 + p53-HIT-H179Q Inmortal) fue muy similar a los más jóvenes (precrisis) líneas parentales (Figura 7].

En contraste con el envejecimiento asociada a la atenuación de G 2 puesto de control en función de la telomerasa-negativas, p53 defectuoso de las líneas, no se asocia el envejecimiento de la atenuación de G 2 puesto de control en función de la telomerasa-que expresa, p53 defectuoso de las líneas. Células en> 150 PDL muestran una respuesta a la IR de que era casi equivalente a la observada en el PDL 30 - 40. Así, el envejecimiento de la atenuación de G 2 en el puesto de control de la función de p53 defectuoso líneas fue impedido del todo por la expresión de la telomerasa.

Citogenética de las líneas inmortales

Espontáneamente surgió de las células inmortalizado después de tres meses de crisis en la cultura (F1-HIT-p53 + A143V Inmortal y F1 + p53-HIT-H179Q Inmortal líneas celulares). Estas dos líneas de células había daño en el DNA G 1 y G 2 puesto de control de las respuestas que fueron similares a las observadas en el paso bajo sus padres (Cuadro 2 y Gráfico 7, respectivamente). G-banda cariotipo análisis de estas líneas celulares inmortales reveló que ambos estaban cerca de diploide (45 - 46 cromosomas, en el cuadro 4]. La F1 + p53-HIT-H179Q inmortal línea exhiben algunas anomalías (12% + 18q, 18q-8%) con el 92% de metafases siendo 45 XY o 46 XY. El F1-HIT-p53 + A143V inmortal línea exhibió una cierta pérdida en el número de metafases diploide (72%) y un aumento del número de metafases poliploides (20%), así como una pequeña supresión en 4p16 en más del 50% de metafases. Las líneas que se transduced con hTERT cuando a baja PDL se mantuvieron en la cultura de una mayor población doublings que 175. Hasta este punto, la telomerasa positiva, p53 defectuoso de las líneas mostradas cariotipo normal diploide sin marcador aberraciones cromosómicas (Tabla 4]. Sin embargo, el hTERT-F1 + LXIN línea control mostraron una trisomía para el cromosoma 8 en el 92% de metafases. Curiosamente, el hTERT-F1 + LXIN línea celular tiene un cariotipo normal (25 de 25 metafases), a un intermedio de 96 PDL.

Discusión

Inducida por la expresión de telomerasa en el momento de la inactivación o atenuación de la función de p53 totalmente bloqueado la desestabilización cromosómicas que se asocia con defectos de p53 en células humanas. Así aneuploidization, polyploidization, y formación de aberraciones cromosómicas, incluyendo anillos, dicentrics, las pausas y los intercambios, todos los cuales se desarrollan en células humanas con heredado o transduced alelos mutantes de p53 [38, 39] o después de la transducción viral oncoproteins que inactivar p53 [40 -- 42] parecen ser secundarias telómero consecuencias de la erosión. Telomerasa-expresando fibroblastos con poca o ninguna p53-dependiente G 1 puesto de control de la función expuesto no detectables numérica o alteraciones cromosómicas estructurales después de ser llevado a través de> 170 población doublings. Este hallazgo tiene implicaciones para los mecanismos de inestabilidad genética en el cáncer y sus precursores.

En este estudio de ocho isogénicas se obtuvieron líneas celulares que difieren unos de otros por uno o dos alelos. Todas las líneas celulares que expresan dominante-negativo formas de p53 o la HPV16E6 oncogénica de interferir en la señalización p53 dejado de lado a la senectud puesto de control. Sin embargo, la expresión de p53-A143V alelo causado sólo un 50% de atenuación de los daños del ADN G 1 puesto de control de la función, independientemente de telomerasa expresión. La expresión parcial de este puesto de control de la respuesta parcial se asoció con la inducción de la proteína p21 Waf1 después de 6 horas de exposición a 1,5 Gy IR (Figura 3 y Figura 5]. Esta observación es consistente con el informe que el V143A alelo de p53 se une a p53 y transactivates respuesta a los promotores [43]. Cuando transduced por la transfección A143V alelo de p53 se ha informado a anular la senectud y el puesto de control de inducir graves cromosómicas desestabilización como se ha visto aquí [44].

La continua erosión de los telómeros en las células sin pasar por el puesto de control de la senescencia replicativa resultados en un ciclo de formación de los cromosomas dicéntricos conduce a la no-disyunción errores y roto los cromosomas que, cuando se reparen, puede resultar en translocaciones, supresión, o más dicentrics. La telomerasa de las células que expresan p53 defectuoso utilizado en este estudio acumulado no anomalías estructurales o numéricas cuando se crece en la cultura de más de 170 habitantes doublings. En contraste con otros informes, la telomerasa-positivos de control de línea celular (F1-hTERT + LXIN) no demostraron evidencia de la desestabilización cromosómicas o cambios morfológicos a través de aproximadamente 100 de la DP [14, 45]. Sin embargo, durante los próximos 75 la población doublings esta línea celular hizo adquirir una trisomía para el cromosoma 8. La trisomía para el cromosoma 8 visto en la F1-hTERT + LXIN en células PDL 175 también se ha observado en este laboratorio en otro telomerized línea de fibroblastos humanos en torno a PDL 200 [46]. Trisomía para el cromosoma 8 se encuentran en muchos hyperproliferative trastornos y se cree que proporcionan una ventaja de crecimiento a las células que adquirirla [47 - 50] Ese crecimiento podría tener ventaja seleccionados para la celda o celdas que sufrió nondisjunction y adquirido el cromosoma extra , A pesar de la expansión de la población F1-hTERT + LXIN línea no aumentó después de PDL 100 (Figura 4B]. Estudios recientes demuestran que la expresión de telomerasa forzoso en fibroblastos de piel y otros tipos de células aumenta la proliferación de las células [9]. Estos efectos de la telomerasa no parecen alterar respuestas celulares a la IR inducida por daño en el DNA, como se muestra aquí o inducidos por los rayos UV daño en el DNA como en el informe anterior [51].

Cromosómicas asociadas con la desestabilización telómero crisis también se ha correlacionado con la atenuación y la inactivación de daño en el DNA G 2 puesto de control de la función [6, 25, 29]. Debido a que este puesto de control de los bloques mitosis de las células dañadas con las cromátidas, es la hipótesis de que chromosomally inestable células con defectos en el puesto de control de G 2 tendría una ventaja de crecimiento y se acumulan en las culturas a causa de la selección. Una explicación alternativa es la grave inestabilidad de los cromosomas en crisis impidió la progresión a través de mitosis, de manera que la radiación a las células dañadas completa mitosis en una tasa más lenta que lo normal. Yang et al. Describió una rad9 dependen de los productos básicos en el puesto de control de S. Cerevisiae, que responde a la presencia de un cromosoma dicéntricos para retrasar la progresión a través de mitosis [52]. Si fibroblastos humanos con cromosomas dicéntricos también se retrasó en su progresión a través de mitosis, este fenómeno podría explicar la atenuación de G 2 considerarse como puesto de control de la función de p53 defectuoso de las células entrar en crisis. Como la eficacia de la función de control de G 2 es cuantificado por el grado de vaciamiento de la mitótico compartimiento 2 h después de la irradiación, un tipo reducido de progresión a través de mitosis G 1 tendrá el efecto de mantener un alto índice mitótico en el control y células irradiadas. Esta explicación podría ver la atenuación de G 2 telómero puesto de control de la función durante la crisis como otra manifestación de la inestabilidad cromosómica. La corrección del G 2 en el puesto de control de la función inmortal líneas que surgieron de la crisis con la estabilidad de los cromosomas también apoya esta explicación. Hay otras maneras de atenuar los daños del ADN G 2 puesto de control de la función, como la inactivación de la ATM [53], BRCA1 y 14-3-3 ε [54] o sobreexpresión de ciclina B1/Cdk1 quinasa [55]. La atenuación de los daños del ADN G 2 puesto de control de la función en el cáncer de pulmón de células pequeñas, pero no carcinoma de células escamosas [54] implica que esta vía de daño en el DNA respuesta protege contra la carcinogénesis en determinados objetivos.

Fibroblastos humanos con mutaciones heredadas en p53 o ectópico HPV16E6 espontánea expresión de inmortalizar a su baja frecuencia [6, 38]. Durante las crisis, antes de immortalization, estas líneas celulares muestran numérica y anomalías cromosómicas estructurales. La pérdida de cromosomas (Cuadro 3] visto en estas líneas puede ser debido a la no-disyunción errores o artefactos asociados a la tramitación de la metafase preparativos. No es posible distinguir entre estas posibilidades. Sin embargo, dado que esto no se observó en el telomerized líneas celulares o en la falta de líneas de células telomerized antes de la crisis, este fenómeno es probable que sea una función de la inestabilidad cromosómica subyacente. Las líneas celulares, que son el resultado de immortalization espontánea, por lo general han activado telomerasa expresión aunque en algunos casos los telómeros parece ser estabilizado por un mecanismo alternativo (ALT) [56]. Estas líneas son a menudo inmortal aneuploide [38]. En este estudio, la F1-HIT-p53 + A143V y F1 + p53-HIT-H179Q líneas dado inmortal derivados. Estas líneas son a la vez inmortal diploide (45 - 46 cromosomas). El p53-A143V línea mostrada un marcador de aberraciones cromosómicas (4p-) en más de la mitad de las metafases. Supresiones en esta región están asociadas con el síndrome de Wolf-Hirschhorn [57]. El p53-H179Q inmortal figura en primer línea de aberraciones en el cromosoma 18 (tanto las pérdidas y ganancias). 18 aberraciones cromosómicas se han asociado con diversos tumores malignos en seres humanos [58, 59]. Estos resultados demuestran sólo sutiles cambios en el cariotipo immortalization siguientes son compatibles con la observación anterior, que la aneuploidía no es un resultado inevitable de immortalization in vitro [60]. En conjunto, estos resultados pueden reflejar el hecho de que todo lo que se requiere para el crecimiento continuo in vitro de fibroblastos humanos es hTERT expresión. Cambios genéticos que no son detectables cytogenetically aparentemente son capaces de derepress hTERT expresión y de inducir la inmortalidad.

Contribuciones de los autores

DAS construido líneas celulares, llevaron a cabo análisis de control, participaron en el cariotipo estudios, el diseño del estudio, redactado y manuscrito. EL llevado a cabo el Grupo de anillamiento de los cromosomas y multa cariotípica análisis. TPH llevó a cabo el Western blot de la inducción de p53 y p21. WKK fue instrumental en el diseño del estudio y la preparación manuscrito.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr Marila Corderio-Stone para útiles comentarios. Esta labor fue apoyada por PHS CA81343 conceder subvenciones y centro CA16086-P30 y P30-ES10126. DAS con el apoyo de becas de formación ES12345 y ES45678. TPH con el apoyo de la formación de subvención ES07017.