Journal of Inflammation (London, England), 2005; 2: 10-10 (más artículos en esta revista)

Reglamento de I κ B α expresión implica tanto NF-κ B, y el MAP quinasa vías de señalización

BioMed Central
Zhang Ning (ning.zhang @ xenogen.com) [1], Muhammad H Ahsan (HaroonA@xenogen.com) [1], Lingyun Zhu (Leanne.Zhu @ xenogen.com) [1], Lidia C Sambucetti (lsambucetti @ Telik.com) [1], Anthony F Purchio (tony.purchio @ xenogen.com) [1], David B Oeste (david.west @ xenogen.com) [1]
[1] Xenogen Corporation, 860 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, USA

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Resumen

I κ B α es un inhibidor del factor de transcripción nuclear NF-κ B. Encuadernación de I κ B α a NF-κ B inactiva la actividad transcripcional de NF-κ B. Expresión de mi propio α κ B está regulada por NF-κ B, que dispone de auto-regulación de esta vía de señalización. Aquí presentamos un modelo de ratón para el seguimiento en vivo I κ B α expresión de la imagen I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones transgénicos para I κ B α promotor impulsado luciferase actividad. Hemos demostrado una inducción rápida y sistémica de I κ B α expresión en ratones transgénicos tras el tratamiento con LPS. La inducción fue alta en el hígado, el bazo, el pulmón y el intestino inferior y en el riñón, el corazón y el cerebro. El luciferase inducción en el hígado correlacionado con el aumento de I κ B α mRNA. Pre-tratamiento con el inhibidor de proteosoma bortezomib drásticamente reprimidas LPS-luciferase actividad inducida. Inhibidor de la quinasa p38 también mostró SB203580 moderada inhibición de la LPS-luciferase actividad inducida. Análisis de I κ B α mRNA en el tejido hepático mostró un sorprendente aumento de la I κ B α mRNA y SB203580 bortezomib después de los tratamientos, lo que podría deberse a un aumento de I κ B α mRNA estabilidad. Nuestros datos demuestran que la regulación de la I κ B α expresión implica tanto el NF-κ B, y las vías de señalización de p38. El I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones transgénicos son útiles para el análisis de I κ B α expresión y el NF-κ B transcripcional actividad in vivo.

Introducción

I κ B α es un inhibidor del factor de transcripción nuclear NF-κ B, que regula la expresión de genes citotóxicos y proinflamatorias [1]. En nonstimulated células NF-κ B, proteínas están presentes en el citoplasma, en asociación con inhibidores específicos I κ B α, β κ B, y yo κ B γ. Estimulación por extra-celular inductores resultados en la fosforilación y degradación de I κ B a través de una vía ubiquitin-proteosoma, lo que permite NF-κ B para trasladar en el núcleo para activar la transcripción de genes diana [2, 3]. El I κ B α contiene genes funcionales NF-κ B sitios de la región promotora. Activación transcripcional de I κ B α expresión de NF-κ B conduce a la rápida re-síntesis de I κ B α y bloqueo de la proteína NF-κ B translocación nuclear [4, 5]. Esta auto-regulador bucle es a la vez delicada y rápidamente a la influencia de NF-κ B, la activación de los estímulos [6]. Además, la fosforilación de I κ B cinasa y la activación de NF-κ B también incluyen la señalización de las vías de MAP quinasa [7].

En el presente trabajo se describen y caracterizan el I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratón transgénico que se utiliza para la vigilancia de I κ B α expresión a través de imágenes bioluminiscente. Pusimos a prueba el efecto de bortezomib y varios inhibidores de MAP quinasa inducida por LPS I κ B α expresión. Los resultados que siguen sugieren que, además de NF-κ B, la vía de señalización MAP quinasa participa en el control de I κ B α expresión.

Materiales y métodos
Construcción de pI κ B α-luc de vectores y la generación de I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones transgénicos

Un ratón clon BAC que contiene el ratón I κ B α gen fue aislado de un CT7 ratón de biblioteca BAC (Invitrogen, Carlsbad, CA). Un 11,0 kb promotor fragmento que contiene secuencias de 5 'a la primera ATG para el ratón me κ B gen α se obtuvo por el método de clonación RED [8] y clonado aguas arriba de la firefly luciferase genes en el pGL3-básico de vectores (Promega, Madison, WI). Un 0,8 kb β-globina humana intrón 2 se colocó entre la I κ B α promotor y el luciferase genes para optimizar el luciferase expresión en ratones transgénicos. El cassette transgén se separó de la columna vertebral de vectores y secuencias utilizadas para la inyección pronuclear en ratones Balb / C cepa embriones de ratón. Estos pasos dado los transgénicos modelo de ahora en adelante designados Balb / C-Tg (I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc) Xen y abreviado en el texto como he κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc.

Reactivos

Hemos comprado bacteriana lipopolisacárido (LPS, de Salmonella abortus equi), PD098580 de Sigma-Aldrich Chemical Co (St. Louis, MO), Bortezomib (VALCADE, PS-341) de Millennium Pharmaceuticals, Inc (Cambridge, MA), SB203580 de EMD Biosciences, Inc (La Jolla, CA) y AG SP600125 de la Ciencia, Inc (San Diego, CA).

Imágenes in vivo de la actividad luciferase

Imágenes in vivo se realizó utilizando un sistema de imágenes IVIS ® Serie de 100 (Xenogen Corporation, Alameda, CA). I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones transgénicos fueron anestesiados con isoflurano y se inyecta por vía intraperitoneal con 150 mg / kg de luciferin (Biosynth, AG, Suiza). Diez minutos después de la inyección luciferin, ratones fueron imágenes de 1-10 segundos. Fotones emitidos por regiones específicas fueron cuantificados usando Vida Image ® software (Xenogen Corp). Luciferase actividad in vivo se expresa como fotones / segundo / cm 2.

Estudio in vivo de I κ B α regulación génica utilizando I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones transgénicos

I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones transgénicos de los 3-6 meses de edad fueron inyectados con LPS (1 mg / kg, ip.). Control de animales fueron inoculados con solución salina. En determinados puntos de tiempo, los ratones fueron luciferase imagen de la señal. Para probar el efecto de diferentes compuestos, los ratones fueron pre-tratados con bortezomib (1 mg / kg, iv.), PD098059 (10 mg / kg, iv), SP600125 (20 mg / kg, iv), o SB203580 (5 mg / Kg, iv) 1 hora antes de la inyección de LPS.

Tejido luciferase actividad

Selección de los órganos fueron removidos y homogeneizada en 3 volúmenes de PBS que contiene un cóctel de inhibidores de la proteasa (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN) y lisadas con buffer de lisis pasiva (Promega). Después de la centrifugación a 14.000 rpm durante 10 min a 4 ° C, el sobrenadante se recogió. Luciferase actividad fue ensayada mediante el sistema de ensayo Luciferase (Promega) y un Turner de diseño, TD 20/20, Luminometer (Sunnyvale, CA). Concentración de proteínas se estimó con reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich).

Del Norte blot

Total RNA se aisló de tejido de ratón utilizando RNAwiz (Ambion, Austin, TX) y nuevamente purificada RNAeasy utilizando el kit (Qiagen Inc, Valencia, CA). Un total de 2 μ g de RNA de muestras se analizó por Northern blot utilizando un sistema NorthernMax (Ambion). A 482 nt I κ B α fragmento de cDNA se amplificó (avance ejemplo: 5'-GCTCTAGAGCAATCATCCACGAAGAGAAGC-3 '; invertir ejemplo: 5'-CGGAATTCGCCCCACATTTCAACAAGAGC-3') y clonado en el vector pBlueScript SK (Stratagene, La Jolla, CA) que se linealizadas con XbaI y EcoRI. Antisentido único capítulo I κ B α ARN sonda fue preparado por la transcripción de la polimerasa T7 utilizando un kit EZ-Strip (Ambion). Después de la hibridación, la señal se detectó utilizando un kit BrightStar BioDetect (Ambion)

Estadísticas

Pruebas no paramétricas de significación se utilizaron para probar si los cambios en luciferase señal desde el valor basal fue significativamente mayor que cero dentro de los grupos (señal de prueba) y si los cambios de línea de base fueron significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento (prueba de Mann-Whitney). Los valores son presentados como medias ± un error estándar de los gráficos y el texto a menos que se indique otra cosa. Para algunas pruebas estadísticas géneros se han combinado para aumentar el número de muestra en cada grupo. Todos los niveles de significación son de doble cara.

Resultados
Inducción de la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B expresión por LPS

Hemos generado κ B α I I I κ B α α κ B I κ B α-luc y ratones transgénicos para analizar sus respuesta a LPS de tratamiento de imágenes a través de bioluminiscente de luciferase actividad. Ratones transgénicos de todas las líneas mostraron fundador luciferase expresión inducible después de LPS tratamiento. Una línea transgénica fue seleccionado para este estudio. En I no tratada κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones, luciferase basal se detectó señal en todo el cuerpo. Ratones machos y hembras mostraron niveles similares de la señal basal luciferase. Después de LPS tratamiento, una inducción de la señal luciferase se observó a las 2 horas después del tratamiento. La señal sigue siendo muy inducido a las 4 horas y empezó a disminuir en 7 horas. En 24 horas, la señal se redujo a cerca de los niveles basales (Figura 1A]. Anatómicamente, la inducción fue mayor en hepática e intestinal regiones del abdomen más que en otras partes del cuerpo.

Luciferase señales procedentes de la región abdominal de los ratones tratados con LPS se cuantificaron utilizando la Vida Image ® software para producir los datos que se muestra en la Figura 1B. En la cima de la inducción de 2 a 4 horas después de la inyección, la luciferase señales se incrementaron de 6 a 10 veces por LPS, en comparación con el basal luciferase señal a los T = 0 hora. A las 24 horas, la señal luciferase todavía era 2 a 3 veces mayor que los niveles basales.

I κ B α expresión es inducida en varios tejidos después de LPS tratamiento

El cuadro 1 muestra la actividad luciferase en determinados órganos en I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones. En los ratones no tratados, ex vivo luciferase actividad se detectó en todos los órganos disecados de ambos sexos. El patrón de expresión de la luciferase masculino tejidos era similar a la de la hembra tejidos. El luciferase actividad fue la más alta en el hígado, el bazo y el pulmón, el más bajo en el corazón, y en cambio en el intestino, los riñones y el cerebro. LPS en los animales tratados, todos los órganos examinados mostraron un significativo luciferase inducción de la actividad. Hígado, bazo, pulmón e intestino mostró dramáticamente superior luciferase expresión más que en riñón, corazón y cerebro. Como se calcula a partir de la media de los ratones control, tratamiento LPS causó 19 a 23 veces luciferase inducción en el hígado, 19 - a 28 veces en el bazo, 8 veces en el pulmón, 19 - a 52 veces en el Intestino, de 6 a 11 veces en el riñón, 54 - a 63 veces en el corazón, 5 - 7 veces en el cerebro.

Asimismo, trató de establecer una correlación entre la actividad y me luciferase κ B α mRNA expresión. En el tejido hepático de un tratado con ratones, I κ B α mRNA expresión es detectable. Tras el tratamiento LPS, una inducción de la I κ B α mRNA expresión se observó (Figura 1C], que correlacionó con el aumento de luciferase actividad en el hígado.

Bortezomib inhibe LPS-I inducida κ B α expresión

Uso de la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc modelo, probamos el efecto de bortezomib en LPS-I inducida κ B α expresión in vivo. Como se muestra en la Figura 2A, el pre-tratamiento de la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones con bortezomib, inhibió LPS inducida luciferase expresión en todo el cuerpo, especialmente en el hígado y el intestino, donde la señal fue muy luciferase inducida. Cuantificación de la señal luciferase mostraron que la inhibición de la actividad de luciferase bortezomib fue significativo en todos los puntos en el tiempo, tanto hombres como mujeres ratones (Figura 2B, C]. En la cima de la inducción en 2-4 horas, bortezomib inhibe 70-80% de LPS-luciferase actividad inducida en la región abdominal.

Bortezomib inhibe LPS-I inducida κ B α κ B α I I I κ B α α κ B expresión en todos los órganos, excepto el cerebro

Se examinó el efecto de bortezomib en LPS-I inducida κ B α expresión en determinados órganos (Figura 3 A, B]. En comparación con los ratones tratados con LPS, la validez de los ratones tratados con bortezomib mostraron una inhibición significativa de luciferase inducción en todos los órganos examinados, excepto el cerebro. La inhibición oscila entre el 50% y el 80% con exclusión de los tejidos examinados en el cerebro.

Además, examinaron el efecto de bortezomib en la I κ B α mRNA inducción por LPS. En ambos ratones machos y hembras, el pre-tratamiento con bortezomib aumento de LPS inducido I κ B α mRNA nivel, en el tejido hepático (Figura 3C].

Efecto de los inhibidores de la MAP quinasa en la I κ B α inducción por LPS

Se examinó el efecto de los inhibidores de MAP quinasa SB203580, PD098059 y SP600125 sobre LPS-I inducida κ B α expresión. El bioluminiscente imágenes y la cuantificación se presentan en la Figura 4A y 4B, respectivamente. Pre-tratamiento de la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones con SB203580 moderadamente inhibido LPS inducida luciferase expresión. PD098059 la validez de los ratones tratados también había luciferase menor actividad en comparación con los tratados con LPS control positivo ratones. Sin embargo, la diferencia fue significativa a las 7 horas (Figura 4B]. SP600125 no afectar LPS inducida luciferase expresión.

Asimismo, se analizó la actividad luciferase en determinados órganos cosecha de las SB203580-previamente tratados ratones a las 3 horas después de la inyección de LPS. Como se muestra en la Figura 5A, SB203580, inhibió LPS-luciferase actividad inducida en el hígado, el pulmón, y el intestino, pero no en el bazo, cerebro, riñón o corazón.

El efecto de SB203580 κ B en la I α mRNA inducción por LPS se muestra en la Figura 5B. Pre-tratamiento con SB203580 aumento de LPS inducido I κ B α mRNA nivel en el hígado de tejido de la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones.

Discusión

El ratón I κ B α promotor contiene 6 putativo NF-κ B sitios de unión en la mediación de la NF-κ B regulación [9]. Inducción de la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc expresión en la fase temprana de la LPS respuesta es coherente con una apretada auto-regulación de la NF-κ B por vía de señalización I α κ B [6]. Reflejando NF-κ B actividad transcripcional, la luciferase señal en el I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratón ofrece un enfoque de la supervisión en vivo de NF-κ B activación.

Se ha demostrado previamente que el tratamiento LPS causas de la degradación de I κ B α proteína dentro de 40 minutos, seguida por la inducción de la I κ B α mRNA que se traduce en una rápida recuperación de la I κ B α proteína por 3 horas. Como resultado de ello, el máximo NF-κ B activación ocurrido 1 hora después LPS tratamiento, pero comenzó a disminuir en 3-6 horas después del tratamiento [10]. En el acuerdo, nuestros datos de imágenes in vivo demostró un luciferase inducción de la actividad a las 2 a 4 horas después del tratamiento de la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones con LPS, seguida de la disminución de la luciferase actividad a las 7 y 24 horas. Además, se observó también una ligera diferencia de género de la cinética de NF-κ B activación siguientes LPS tratamiento. Hombre ratones mostraron un pico de inducción a las 4 horas, seguido de una drástica disminución en 7 horas. Mujeres ratones mostraron un pico de inducción a las 2 horas, seguida de una disminución secuencial a las 7 y 24 horas. Esto indica que la inflamación inducida por LPS proceso puede ser sostenido más largo en las mujeres que en los ratones ratones machos.

Ex vivo análisis de una selección de tejidos de I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones mostraron luciferase expresión basal en el hígado, el bazo y el pulmón, con menor expresión en el intestino, riñón, corazón y cerebro. Luciferase significativa la inducción de la expresión se observó en todos estos órganos, de los hombres y mujeres LPS ratones después de tratamiento, con mayor luciferase actividad observada en el hígado, el bazo y el intestino, en comparación con otros tejidos (cuadro 1]. Esto es coherente con el análisis de imágenes bioluminiscente de luciferase actividad en la que viven los ratones muestra mayores señales luciferase estuvieron presentes en las dos regiones intestinal y hepática que otras partes del cuerpo (Figura 1A]. Alto grado de luciferase inducción en el hígado, bazo, pulmón y el intestino por LPS es coherente con mi κ B α degradación y activación de NF κ B en estos órganos en respuesta a la endotoxemia [11 - 13]. Cuando los ratones machos y hembras se comparan, en el intestino luciferase señal fue significativamente mayor en los tratados con LPS ratones machos, en comparación con los ratones hembra. La diferencia podría ser debido a la diferencia de la cinética de inducción luciferase entre ratones machos y hembras o simplemente debido a un número relativamente pequeño de la muestra utilizada para este estudio.

Bortezomib inhibe LPS-luciferase actividad inducida por 70-80% en el I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones, que se ve confirmado por un amplio luciferase supresión de la actividad en todos los tejidos analizados, excepto el cerebro. Bortezomib es un inhibidor de la actividad del proteasoma que se requiere para que κ B, la degradación y posterior translocación nuclear de NF-κ B [14]. Además, el bortezomib puede también inhibir otras vías de señalización celular, como mitogen-activated proteína quinasa crecimiento de señalización, provocando la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis de las células [15, 16]. Análisis de la I κ B α mRNA mostraron que el bortezomib tratamiento previo causado un aumento adicional de LPS inducido I κ B α mRNA en el hígado. Dado que la actividad transcripcional de la I κ B α promotor fue suprimida bortezomib, sospechamos que el aumento de I κ B α mRNA después de bortezomib tratamiento debe ser debido a un aumento de la I κ B α mRNA estabilidad. Estos datos sugieren que la inhibición de NF-κ B, la inflamación mediada por el bortezomib puede deberse a una amplia gama de efectos, como las que afectan a los procesos de I κ B degradación de las proteínas y yo κ B α mRNA estabilidad.

Varios MAP kinasa inhibidores fueron probados por sus efectos inducidos sobre LPS-NF-κ B activación. Se demostró que el tratamiento previo con inhibidor de p38 MAP quinasa SB203580 a una dosis de 5 mg / kg inhibe parcialmente la inducida por LPS luciferase expresión en la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones en el hígado, el pulmón y el intestino. Se ha informado de que SB203580 inhibe la producción de citoquinas inflamatorias in vivo tanto en ratones y ratas con IC50 valor de 15 a 25 mg / kg [17]. En otro informe, se demostró que SB203580 a los 5, 10 y 20 mg / kg de peso produjo una inhibición dosis dependiente en la producción de TNF-alfa in vivo [18]. Por lo tanto, es probable que la SB203580 dosis utilizada en nuestro estudio tuvo un efecto inhibitorio sobre la activación de p38 MAP quinasa. También demostró que el inhibidor de ERK MAP quinasa PD098059 a 10 mg / kg de LPS inhibe parcialmente la expresión inducida por luciferase en 7 horas. En esta dosis, PD098059 pudo reprimir ERK1 / 2 fosforilación in vivo [19]. Además, puso de manifiesto que JNK inhibidor de quinasa SP600125 a 20 mg / kg no tuvo ningún efecto sobre LPS inducida luciferase expresión. En esta dosis, SAPK / MAP kinasa JNK fosforilación puede ser inhibido totalmente en el tejido hepático [20].

En resumen, hemos producido un ratón transgénico en el que luciferase expresión es impulsada por el I κ B α promotor. Observamos un ubicuo y de la inducción de la expresión I α κ B en la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones transgénicos por LPS. Hemos demostrado la participación tanto de la NF-κ B, y el p38 MAP quinasa vías de señalización en la inducción de I κ B α expresión por LPS.

Clínicamente, el NF-κ B activación está involucrado en muchas enfermedades crónicas, como la artritis reumatoide, atheroscleorosis, el asma y el desarrollo de tumores [21, 22]. El luciferase actividad en la I κ B α κ B α I I I κ B α α κ B-luc ratones podría ser utilizado como un sensor de control de la NF-κ B, la activación y para una mejor comprensión de cómo NF-κ B activación contribuye a la iniciación y progresión de la enfermedad de estas condiciones. Además, yo me κ B α α κ B I κ B I α α κ B-luc ratones podrían también ser utilizados para la realización de pruebas de cribado o incluso la novela de NF-κ B, inhibidores de potencial terapéutico.

Agradecimientos

Damos las gracias a Paul T. Williams para la consulta sobre el análisis estadístico de los datos.