Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 21-21 (más artículos en esta revista)

5-aminoimidazole-4-carboxamida-1-beta-4-ribofuranoside (AICAR) atenúa la expresión de LPS-y un péptido β-mediadores de la inflamación inducida en astroglia

BioMed Central
Kamesh R Ayasolla (ayasolkr@musc.edu) [1], Shailendra Giri (giris@musc.edu) [1], Avtar Singh K (Avtar.Singh @ med.va.gov) [4], Inderjit Singh (singhi @ Musc.edu) [1]
[1] Department of Pediatrics, Medical University of South Carolina, Charleston, South Carolina, 29425, USA
[2] Department of Pathology, Medical University of South Carolina, Charleston, South Carolina, 29425, USA
[3] Department of Obstetrics & Gynaecology, Medical University of South Carolina, Charleston, South Carolina, 29425, USA
[4] Department of Pathology, Ralph H. Johnson VA Medical Center, Charleston, South Carolina 29425, USA

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Resumen
Antecedentes

Enfermedad de Alzheimer (EA) muestra patología característica 'placas' rica en beta amiloide (A β) péptido depósitos. Procesos inflamatorios relacionados con las proteínas, como las citoquinas pro-inflamatorias que se han detectado en AD cerebro sugieren que una reacción inmune inflamatoria también desempeña un papel en la patogénesis de la EA. Células gliales en la cultura LPS responder a los estímulos y un β upregulating por la expresión de las citoquinas TNF-α, β IL-1 e IL-6, y también la expresión de los genes proinflamatorias iNOS y COX-2. Hemos informado anteriormente de que LPS / A β estimulación inducida por la ceramida y la generación de ROS conduce a la expresión iNOS y la producción de óxido nítrico en células gliales. El presente estudio fue realizado para investigar la función de neuroprotectores AICAR (un potente activador de la AMP-activated proteína quinasa) en el bloqueo de la pro-oxidant/proinflammatory respuestas inducidas en la enseñanza primaria gliales culturas tratados con LPS y un péptido β.

Métodos

Para probar la anti-inflammatory/anti-oxidant funciones de AICAR, probamos su inhibidor potencial en el bloqueo de la expresión de citoquinas pro-inflamatorias y iNOS, expresión de la COX-2, la generación de ROS, y después del tratamiento asociado de señalización de las células gliales con LPS y un péptido β. También investigó los efectos neuroprotectores de AICAR contra los efectos de las citocinas y mediadores de la inflamación (puesto en libertad por la neuroglia), en el bloqueo de la inhibición neurite resultado, y en el factor de crecimiento nervioso (NGF) inducida por extensión neurite PC-12 células.

Resultados

AICAR bloqueado LPS / A β-inducida por los procesos inflamatorios, mediante el bloqueo de la expresión de citocinas proinflamatorias, iNOS, COX-2 y MnSOD genes, y por la inhibición de la generación de ROS y el agotamiento de glutatión en las células astroglial. AICAR también inhibió altos de señalización para la regulación de los factores de transcripción, como NF κ B, y C / EBP que son fundamentales para la expresión de iNOS, COX-2, MnSOD y citoquinas (TNF-α y β IL-1 e IL-6) . AICAR promovido NGF neurite inducida por el crecimiento y la reducción de neurite resultado la inhibición de PC-12 en las células tratadas con astroglial medio condicionado.

Conclusión

La observó anti-inflammatory/anti-oxidant neuroprotectores y funciones de AICAR sugerir como un candidato viable para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes

Enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurológico del cerebro y la patología se caracteriza por la presencia de placas seniles rica en insoluble agregados de beta amiloide (1-40) y (1-42) péptidos, productos de degradación de los grandes precursores de proteína amiloide ( APP) [1, 2]. Todas las principales citoquinas pro-inflamatorias, con la excepción de IFN-γ (TNF-α, IL-1 e IL-6) se han detectado en AD cerebro sugieren que una reacción inmune inflamatoria también desempeña un papel en la patogénesis de la EA [3, 4]. La depositó un β péptidos también han sido implicados en el estrés oxidativo inducido por las respuestas, a través de la activación NADPH oxidasa y la generación de anión superóxido [5].

El astroglial población tiene un papel importante en los procesos de neuroinflammatory enfermedad, y se ha implicado en diversos trastornos neurológicos, incluidos AD [6]. Aunque todavía no sabemos qué ligandos endógenos pueden desencadenar una respuesta inflamatoria en AD, varios estudios han informado de que LPS / A β tratamiento de la neuroglia sirve como un buen modelo de cultivo celular para la imitación de la patología inflamatoria en AD [7 - 10]. Tratamiento in vitro de células gliales con LPS / A β péptidos induce citoquinas (TNF-α, IL-1 β), y también lleva a la liberación de NO por inducción de la iNOS, en función de la respuesta inmune innata (para una revisión detallada véase [ 6, 11]]. COX-2, una enzima en la cascada PLA-2, que participan en la vía metabólica del ácido araquidónico para la síntesis de prostaglandinas, es una enzima que se expresa junto con otros mediadores inflamatorios en estas células gliales [6]. Su expresión se ha observado que se coincidiendo con el inicio de la apoptosis neuronal expresión de marcadores de la muerte de la célula, debido a excitotoxic neurotoxicidad. La expresión de iNOS conduce a la producción de óxido nítrico y, en consecuencia, la generación de peroxinitrito (un producto de la reacción de anión superóxido y óxido nítrico), bajo condiciones de estrés oxidativo ha sido implicado en el daño neuronal extensa de varios trastornos neurológicos incluida AD [12, 13]. Por lo tanto los mecanismos de la citoquina pro-inflamatoria mediada por el estrés oxidativo (o viceversa) puede ser el posible objetivo (s) de AD terapéutica.

AMP-activated proteína quinasa [14] (AMPK) es un miembro de la familia de serina / threonine y quinasas celulares se activa por los aumentos en las concentraciones de AMP en las condiciones de nutrición / estrés metabólico [15].

Este es, pues, a menudo referida como el indicador de combustible de la célula, ya que protege a las células contra el agotamiento de ATP y aumenta la generación de energía vías [16, 17]. AMPK se activa por AMP dependiente de la fosforilación de una cinasa aguas arriba, es decir, la AMPK quinasa (AMPKK; recientemente reconocido como LKB1 [16, 17]. AICAR Se ha informado de activar AMPK en la celda siguiente al de su conversión a la ZMP (no degradable AMP Analógico) y, por tanto, imita la actividad de la AMP para la activación de la AMPK [18]. Recientemente, se informó de propiedades anti-inflamatorias de AICAR través de la activación de AMPK [19] en células gliales. AICAR se encontró para inhibir la expresión de citoquinas pro-inflamatorias y De la iNOS en células gliales y en los macrófagos en cultivo de células, así como en ratas tratadas con una dosis subletal de LPS [19] por atenuantes NF κ B, y C / EBP vías.

A β péptidos se sabe que altera redox celular, con lo que activa la cinasa cascadas de abajo conducen a la inflamación [12, 20]. De ahí que este estudio fue diseñado para evaluar la anti-oxidant/anti-inflammatory funciones en el bloqueo de AICAR LPS / A β-mediada altos de cascadas de señalización conducen a la activación y el factor de transcripción de liberación de citoquinas inflamatorias y iNOS y COX-2 de expresión. Este estudio describe AICAR mediada por la activación de la AMPK y downregulation de LPS / A β-inducida por la expresión de los mediadores de la inflamación en astrocyte enriquecido cultivos de células gliales, posiblemente a través de la reducción / regulación de redox celular.

Métodos
Reactivos

MEDM y suero fetal bovino se obtuvieron de la vida Technologies Inc, Gaithersburg MD, EE.UU., y LPS (Escherichia coli) de Calbiochem. Los anticuerpos contra la iNOS y MnSOD se obtuvieron de Transduction Labs, y de anticuerpos a la COX-2 se Caimán de los productos químicos, Ann Arbor, MI. Β-Actina y péptido β-amiloide (25-35) fragmento así como el péptido inversa (35-25), β-α myloid péptidos (1-40) y (1-42) fueron de Sigma. Anticuerpos para p65, p50; IB quinasa (KKK); CCAAT / potenciador de proteínas que unen (C / EBP) - α, - β, y - δ, y oligonucleótidos para NF-κ B, y C / EBP eran de Santa Cruz. Recombinante, el factor de necrosis tumoral (TNF-α) y la interleucina (IL) -1, y de baterías de ELISA para TNF-α, IL-1, IL-6, y de IFN-γ fueron de R & D Systems. Trizol y reactivos de transfección (Lipofectamine-2000, Lipofectamine-Plus, y Oligofectamine) eran de Invitrogen. Cloranfenicol acetiltransferasa ELISA,-galactosidasa (-gal), 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT), y lactato deshidrogenasa (LDH) se obtuvieron a partir de kits de Roche. El aumento de la detección de quimioluminiscencia se compraron reactivos de Amersham Biosciences. El sistema de ensayo se luciferase de Promega. Los anticuerpos contra phosphospecific así como nonphospho-p42/44, y de AMPK eran de Señalización Celular Tecnología. NF-κ B-luciferase fue proporcionada por el Dr Hanfang Zhang (Colegio Médico de Georgia, Augusta, GA).

Cultivo de células y el tratamiento de las ratas primaria gliales culturas y astrocitos

Astroglial células fueron aisladas de tejido cerebral de rata, tal como se describe por McCarthy y DeVellis [21]. Astrocitos fueron aislados y mantenidos tal como se describe anteriormente [12]. Las células se mantuvieron en MEDM con 10% de suero fetal bovino. Células gliales eran estimuladas con LPS o bien (125 μ g / ml), citoquinas, o con sphingomyelinase (SMase) con o sin β-péptido amiloide en suero libre de MEDM y fueron cosechadas después de 18 h menos que se indique lo contrario. AICAR (1 mM), NAC (15 mM), Vitamina E (20 μ M), o de otras sustancias se añadieron 4 Horas antes de la estimulación con LPS / citoquinas y de nuevo se añade en el momento de la adición de estímulos de estrés.

Preparación de un β de edad (1-40), (1-42) y (25-35) y la inducción de las células con β-péptido amiloide

A los péptidos β (25-35), (1-40), (1-42) y el reverso un péptido β (40-1) fueron todos adquiridos de Sigma. Ellos fueron solubilizados de búfer en fosfato salino (PBS) a una concentración de 1 mM, se incubaron en un tope vial a 37 ° C durante 4 días [22], y almacenarse en el congelador a -20 ° C hasta su uso. Que se utilizaron a una concentración final de 7,5 μ M o en cantidades superiores, como se indica.

Determinación de la síntesis de NO

La síntesis de NO se determinó analizaron cultura sobrenadantes de nitrito, un producto estable de reacción de NO con oxígeno molecular [19]. En resumen, 400 μ l de la cultura sobrenadante se le permitió reaccionar con 200 μ l de reactivo de Griess y incubados a temperatura ambiente durante 15 min. La densidad óptica de las muestras de ensayo se midió espectrofotométricamente a 570 nm. Fresh medios de cultivo sirvió de blanco en todos los experimentos. Nitrito concentraciones se calcula a partir de una curva estándar derivados de la reacción de NaNO 2 en el ensayo.

Mediciones de fluorescencia utilizando para la producción de superóxido hydroethidine

Hydroethidine (HE) o dihdroethidium (DHE), una sonda redox sensibles, han sido ampliamente utilizados para la detección de anión superóxido intracelular. La oxidación de la Excma en un sistema de generación de superóxido fue realizada por spectrofluorimetry, esencialmente de acuerdo con el método descrito por Zhao, et al [23] con ligeras modificaciones. En pocas palabras, después del tratamiento de las células con LPS, con o sin β A ± AICAR (1 mM), de 6 h, los cultivos fueron lavadas en PBS y el medio fue reemplazado con un nuevo soporte de 50 μ M HE (5 mM solución madre en dimetil sulfóxido ) En MEDM / altos de glucosa que contienen medio. Tras una incubación de 60 min a 37 ° C, las células fueron lavadas dos veces en buffer fosfato-salina (PBS) para eliminar cualquier tinte sin encuadernar y, a continuación, lisadas en una solución tampón que contiene 0,1 N NaOH en el 50% y MetOH vortex por 20 min en un agitador. Generación de ROS se midió por un lector de placas de fluorescencia, en una longitud de onda de excitación de 510 nm, y de las emisiones a 595 nm (ganancia de 10). El blanco consistió valores de los pozos que contienen células pero no cargan con idéntica procesados y el Excmo. La igualdad de los volúmenes de PBS o NaOH-MetOH se agregaron para la lisis celular, antes de la medición de fluorescencia.

El análisis por inmunotransferencia

Estos se realizaron en esencia, tal como se describe anteriormente [12, 19]. En pocas palabras, las células gliales (2 × 10 6 / ml), después de incubación en la presencia o ausencia de diferentes estímulos, lisados de células se preparó en 0,5 ml de solución tampón que contiene 20 mM HEPES, pH 7,4, 2 mM EDTA, 250 mM NaCl, 0,1 Nonidet%, P-40, 0,1% Tritón-X (100), 2 μ g / ml leupeptina, 2 μ g / ml aprotinina, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro, 0,5 μ g / ml benzamidine, y 1 mM dithiothreitol. El lisado se centrifugó brevemente a 500 rpm durante 10 min, y el sobrenadante se recogió. Extracto de células de la proteína (50 μ g) fue resuelto en 4-10% SDS-PAGE, electrotransferred sobre una membrana de nitrocelulosa, indicó borró con anticuerpos, y entonces detectado por quimioluminiscencia (ECL, Amersham Pharmacia Biotech).

Preparación de extractos nucleares y movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA)

Nuclear extractos de los tratados o sin tratar células (1 × 10 7) se prepararon utilizando el método de Dignam et al, [24] y con una ligera modificación. Las células fueron cosechadas, lavadas dos veces con helado de PBS, y lisadas en 400 μ l de un buffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,5 mM dithiothreitol; 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro; 5 μ g / ml aprotinina ; 5 μ g / ml pepstatin A, y 5 μ g / ml leupeptina) que contiene 0,1% Nonidet P-40 durante 15 min en hielo, vortex vigorosamente durante 15 s, y se centrifuga a 14000 rpm durante 30 s. El pildoradas núcleos se resuspendió en 40 μ l de buffer B (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (v / v) de glicerol; NaCl 0,42 M; 1,5 mM MgCl 2; 0,2 mM EDTA; 0,5 mM dithiothreitol; 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro; 5 μ g / ml aprotinina; 5 μ g / ml pepstatin A, y 5 μ g / ml leupeptina). Después de 30 minutos sobre el hielo, los lisados se centrifuga a 14000 rpm durante 10 min. Sobrenadantes que contienen las proteínas nucleares se diluye con 20 μ l de buffer modificado C (20 mM HEPES, pH 7,9, 20% (v / v) de glicerol, KCl 0,05 M; 0,2 mM EDTA; 0,5 mM dithiothreitol, y 0,5 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro) y Almacenados a -70 ° C hasta nuevo uso. Nuclear extractos fueron utilizados para la movilidad electroforética cambio de ensayo utilizando el NF-κ B ADN sistema de detección de la proteína de unión kit (Life Technologies, Inc), según el protocolo del fabricante. En pocas palabras, la proteína vinculante de las secuencias de ADN (anteriormente etiquetados con 32 P), de C / EBP, NF κ B, AP-1 y CREB fueron incubadas con extractos nucleares preparados después de varios tratamientos de células gliales. La unión a proteínas de ADN reacciones fueron realizadas a temperatura ambiente durante 20 min en 10 mM Trizma base pH 7,9, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, y 1 mM dithiothreitol más 1 μ g de poli (de-dC), 5% (v / v) de glicerol, y ~ 0,3 pmol de 32 P identificada como C / EBP, NF κ B, AP-1 o CREB (todos de Santa Cruz de Biotecnología). Proteínas ADN se resolvieron los complejos de proteínas libres de ADN en geles de poliacrilamida al 5% a temperatura ambiente en 50 mM Tris, pH 8,3, 2 mM EDTA y se detectaron por autorradiografía. Por Supershift análisis, 1 μ g de los respectivos anticuerpos (donde se indica) fue incluido en el ADN en proteínas vinculantes reacción.

PCR en tiempo real

PCR en tiempo real se realizó como se describió anteriormente [25, 26]. En resumen, el total de ARN de las células se aisló con Trizol (Gibco), según el protocolo del fabricante. PCR en tiempo real se realiza por medio de un Bio-Rad iCycler (iCycler iQ Multi-Color Real-Time PCR sistema de detección; Bio-Rad, Hercules, CA). Única varados cDNA fue sintetizado de ARN aislado de falta de tratamiento, LPS / β-amiloide en células tratadas con la presencia o ausencia de AICAR Superíndice utilizando el sistema de preamplificación de primera línea para la síntesis de ADNc (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Total RNA (5 μ g) fue tratado con 2 U DNasa I (páncreas bovino; Sigma) durante 15 minutos a temperatura ambiente en 18 μ l de volumen que contiene 1 × PCR buffer y 2 mM de MgCl 2. Fue entonces inactivada por incubación de 2 μ l de 25 mM EDTA a 65 ° C durante 15 min. Random primers se añadieron (2 μ l) y recocidos a la RNA de acuerdo a las instrucciones del fabricante. CDNA se prepara usando poli-dT como primer y el virus de la leucemia murina Moloney la transcriptasa inversa (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El primer conjuntos utilizados se han diseñado y sintetizado por las tecnologías integradas de ADN (IDT, Coralville, IA). El primer tipo de secuencias son: para glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), con interés 5'-CCTACCCCCAATGTATCCGTTGTG-3 'y revertir 5'-GGAGGAATGGGAGTTGCTGTTGAA-3'; IL-1 β, adelante 5'-GAGAGACAAGCAACGACAAAATCC-3 'y revertir 5' - TTCCCATCTTCTTCTTTGGGTATTG-3 '; TNF α, adelante 5'-CTTCTGTCTACTGAACTTCGGGGT-3' y revertir 5'-TGGAACTGATGAGAGGGAGCC-3 ', y iNOS, adelante 5'-GGAAGAGGAACAACTACTGCTGGT-3' y revertir 5'-GAACTGAGGGTACATGCTGGAGC-3 '. IQTM SYBR Green Supermix se adquirió de Bio-Rad. Ciclos térmicos condiciones fueron las siguientes: iTaq activación de la DNA polimerasa a 95 ° C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de amplificación a 95 ° C durante 30 segundos y 55-57.5 º C por 30 seg. Los niveles se expresaron como unidades arbitrarias normalizado a la expresión de genes de la meta relativa a GAPDH.

Citoquinas ensayo

Los niveles de TNF-α, β IL-1, IL-6 y se midieron en la cultura sobrenadante por ELISA utilizando protocolos suministrados por el fabricante (R & D Systems).

Transcripcional ensayos

Primaria astrocitos fueron transfectadas transitoriamente con NF-κ B-, o la C / EBP-luciferase reportero de genes con β-galactosidasa por Lipofectamine-2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PcDNA3 se utilizó para normalizar todos los grupos de iguales cantidades de ADN. Luciferase actividad se determinó utilizando un kit luciferase (Promega).

Viabilidad celular

Efectos citotóxicos de los distintos tratamientos se determinaron mediante la medición de la actividad metabólica de las células con MTT y LDH liberación de ensayo (Roche).

Estudios sobre phaeochromocytoma (PC-12) de células neurite extensión

Rat phaeochromocytoma (PC-12) son las células de plata de 60 mm en cajas de Petri precubiertos con 10 mg / ml de poli-D-lisina y cultivadas en Kaighn modificada medio que contiene 20% de suero de caballo y el 2% de SFB, 100 U / ml penicilina, y 100 mg / ml estreptomicina (Todos de-GIBCO BRL) para ~ 12 h. Las células fueron incubadas en suero de los medios de comunicación de baja (2% de suero de caballo y el 1% de suero bovino ternero) que contiene NGF (50 ng / ml) durante 48 h antes de desafiarlos, de nuevo con NGF (50 ng / ml) ni en la presencia o Ausencia de astroglial LPS-medio condicionado y / o AICAR. Las células fueron evaluados después de 4 días de la estimulación por microscopía de contraste de fases (Olympus). Las imágenes obtenidas se ajustaron a establecer un color de fondo para la claridad utilizando el software Adobe Photoshop (versión 7). La puntuación para neurite derivación de células PC-12 se realizó como se describió anteriormente por Dikic et al. [27]. En pocas palabras, neurite longitudes superiores a 100 μ M se han tenido en cuenta y fue evaluado y comparado con los controles.

El análisis estadístico de los datos

Todos los datos se expresan en los medios + SEM. Todas las comparaciones necesarias se llevaron a cabo utilizando el Tukey-Kramer prueba de comparación múltiple. Diferencias estadísticas de p <0,05 se consideró significativo. El densitométricas datos para iNOS y MnSOD, y para todos los fosforilación blots se expresan en una escala arbitraria.

Resultados
AICAR atenúa LPS-A y β-péptido induce la expresión de citoquinas y iNOS, y en la producción de células gliales

Se ha sugerido que, en el SNC, astrocitos y microglia activada están vinculados a la neurodegeneración como resultado de la expresión de mediadores inflamatorios por estas células gliales [6, 28, 29]. Las principales citoquinas implicadas en AD (con la importante excepción de IFN-γ), incluyen TGF-β, TNF-α, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10 y IL-12 [3]. Además de la expresión y la liberación de citoquinas, rata primaria células gliales se sabe expresar iNOS así como de la COX-2. Como se mencionó anteriormente, LPS ha sido habitualmente utilizado para estimular o inducir las respuestas de citoquinas inflamatorias en células gliales [7, 8, 10]. Por lo tanto, para imitar las respuestas inflamatorias, rata cultivos de células gliales primaria fueron tratados con LPS ± A β (1-42) péptido. Como se desprende de (Fig. 1a, c, e, y 1g], y 2, A β upregulated la LPS significativa de la producción de citoquinas TNF-α, β IL-1, IL-6 y el óxido nítrico (NO) en células gliales, que es Además apoyado por el aumento de la expresión de ARNm de iNOS, TNF-α, β IL-1 e IL-6 (Fig. 1b, d, f y 1h]. AICAR atenuada la LPS / A β de la producción de TNF-α, β IL-1, IL-6 y NO, y de su expresión mRNA, en una forma dependiente de la dosis (Fig. 1a-h].

Hemos informado anteriormente de que SMase activados por la ceramida liberación redox es delicada y que la ceramida mediada por la inducción de la MnSOD y especies reactivas de oxígeno (ROS) es fundamental para la generación de respuestas inflamatorias en las células gliales [12, 30 - 32]. De ahí la expresión de MnSOD fue evaluada como una forma rutinaria ROS inducida por el estrés sensor de proteína [33]. La Figura 2 muestra la expresión de iNOS, MnSOD y de la COX-2 en células gliales. Un péptido β upregulated LPS-mediada la expresión de la MnSOD. Un péptidos β (1-40) y (1-42) indujo la expresión de iNOS, COX-2, y MnSOD, pero no un β (40-1) péptido en secuencia inversa. Respondió a las células β A ambos péptidos (1-40) y (1-42). Sin embargo, con estos dos péptidos en combinación, en equimolar concentraciones (7,5 μ M cada uno), un β (1-42) inducida de aproximadamente dos veces la cuantía de la liberación de óxido nítrico y su correspondiente aumento iNOS expresión, en comparación con un β (1-40) (carril 11 Lane vs 14). En concentraciones más altas (15 μ M cada uno) de estos péptidos, las diferencias en la expresión iNOS o nitrito de producción (carril 12 Vs 15) ya no eran evidentes. AICAR tratamiento bloqueado la iNOS, COX-2 de expresión, así como una expresión casi normalizado de MnSOD.

El tratamiento de las células gliales con LPS y un péptido β (25-35) provocó una respuesta inflamatoria similar, en términos de liberación de citoquinas y la iNOS, COX-2 y MnSOD expresión (Fig. 3 y 4], así como una inhibición dosis-dependiente con AICAR. Figura 3A muestra el dependiente de la dosis de expresión de TNF-α, β IL-1 e IL-6 por un péptido β (25-35) y la figura 3B muestra la inhibición dosis-dependiente de estas citoquinas por AICAR. Fig 4 muestra la inhibición de la iNOS y MnSOD expresión en 0,5 mM AICAR a una determinada concentración de LPS (125 μ g / ml) con varias concentraciones de un péptido β.

En conjunto, estos estudios indican que un β (25-35) proinflamatorias péptido induce respuestas similares a los observados con una β (1-40 o 1-42) péptido. Por lo tanto, una β (25-35) péptido fue utilizado en el resto de este estudio. Viabilidad celular fue probado en condiciones experimentales, tal como se describe en este estudio, pero no fue evidente en la toxicidad o MTT en los ensayos de liberación de LDH.

La observó expresión de las citoquinas TNF-α e IL-1 β activada por células gliales (Figuras 1 y 3], es coherente con la expresión de estas citoquinas en los cerebros de los modelos animales experimentales de la enfermedad de Alzheimer y en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer [3]. Hemos informado anteriormente de que un β también upregulates TNF-α y la IL-1 β-iNOS inducida expresión y nitrito liberación [12]. Por lo tanto, para estudiar autocrina y paracrina efectos, astrocitos en cultivo fueron tratados con TNF-α y la IL-1 β. Como se muestra en el gráfico 5, TNF-α y la IL-1 β tratamiento llevado a un aumento de iNOS y COX-2 de expresión, y el nitrito de producción que se upregulated mediante la adición de un β (25-35) péptido. La inducción de estos mediadores pro-inflamatorios también fue significativamente atenuada por AICAR (Fig. 5]. Además, el incremento en la expresión de la enzima antioxidante MnSOD en respuesta a TNF-α y la IL-1 β β ± A (25-35), también fue reducido a un tratamiento previo de las células gliales con AICAR (Fig. 5C]. De estos estudios se concluye que AICAR atenúa LPS/cytokine- y un péptido β inducida por liberación de citoquinas inflamatorias, y la iNOS, COX-2 y MnSOD expresión.

Anti-oxidante funciones de AICAR sobre LPS, β-Un estrés oxidativo inducido respuestas

Estudios anteriores de nuestro laboratorio [12, 30], así como de otros [20, 34] han informado de citoquinas-o LPS-y A-β indujo alteraciones en redox celular activar el sphingomyelin (SM) de la ceramida (Cer) cascada de transducción de señal - Por la conversión de sphingomyelin a la ceramida en células gliales en la cultura. Este pro-cascada inflamatoria de los acontecimientos podría ser bloqueada por antioxidantes como la vitamina E y NAC, así como por neutral sphingomyelinase inhibidor (3-o-metil sphingomyelin) [12, 19, 30]. La elevada expresión de la MnSOD, Cu / ZnSOD, especies reactivas de oxígeno (ROS), y la reducción de glutatión, indican alterado el equilibrio redox a LPS, β un tratamiento, que fue atenuada por el tratamiento de vitamina E [35]. Cuantificación de la producción de ROS, después de que el tratamiento de células gliales con LPS / A péptido β, utilizando un tinte fluorescente basado en ensayo (HE fluorescencia) mostró un aumento en la generación de ROS, que fue bloqueado por AICAR pre-tratamiento (Fig. 6A]. Esta inhibición de la generación de ROS por AICAR tratamiento posiblemente los bloques más altos de los objetivos con lo que la inhibición de la expresión de genes inflamatorios. La generación de ceramida de sphingomyelin se informó de que se redox sensibles [30] y la ceramida generada por exógenos sphingomyelinase upregulated la expresión de iNOS [30]. Hemos observado que SMase - [la enzima que degrada sphingomyelin (SM) a la ceramida (cáncer)] y A-β tratamiento de las células gliales también conduce a un aumento de iNOS expresión y de la producción de la que es inhibida por las células preincubating con AICAR (Fig. 6B] . Esto también confirma nuestra observaciones anteriores de la participación de SM-cascada de señalización de la ceramida en la expresión de iNOS y citocinas [12]. Estos observaron alteraciones de SM-Cer-ROS y de señalización mediada, con LPS / A β-proinflamatorias inducidas expresión de los mediadores, por la actividad antioxidante de AICAR son consistentes con observaciones anteriores de que nuestro LPS / A β-inducida por la expresión de iNOS y la producción de NO se Bloqueada por antioxidantes (vitamina E o NAC) (Fig. 6C] y, por tanto, el apoyo a la conclusión de que AICAR funciones en el bloqueo de la generación de ROS y, a su vez, el SM-ceramida cascada como supresor de la actividad pro-oxidante [12]. Además, el glutatión intracelular y mercaptanos (que incluye el total de celulares grupo de compuestos tiol), que mostró una disminución con LPS / SMase y / o un péptido β tratamiento, se restablecieron a niveles significativos con AICAR tratamiento (fig. 7], lo que confirma el potencial de AICAR Para equilibrar el estado redox celular.

AICAR tratamiento upregulates fosforilación de AMPK, y posiblemente hacia abajo-regula la Pkb / Akt cascada

Informes recientes de Jhun et al., [36] y en un estudio anterior de Morrow et al. [37] informó de la participación de Pkb / Akt quinasas a través de la activación de PI-3 cinasa en la liberación de óxido nítrico en las vías y en los macrófagos endoteliales Células. Por lo tanto, probamos el estado de fosforilación de Akt tras la estimulación con LPS / A β, con o sin tratamiento con AICAR. Hubo un aumento de la fosforilación de la Ser-473 de p-Akt en la estimulación de las células con LPS / A β, que se redujo significativamente en los tratados con células AICAR (Fig. 8A].

Hemos informado anteriormente de que AICAR media sus efectos a través de la activación de la AMPK y que activan AMPK downregulates pro-inflamatorias respuestas por downregulation de la IKK cascadas [19]. En el interior de la celda (en vivo) AICAR se convierte a ZMP (un análogo de la AMP), que activa la quinasa AMP kinasa (AMPKK), que a su vez activa la quinasa AMP (AMPK) de la fosforilación en residuos de Thr 172 de la α 1 / α 2 y subunidades En Ser 108 de la subunidad β de AMPK. AICAR tratamiento de las células gliales activadas AMPK como se desprende de la mayor intensidad de la proteína específica fosfato bandas de este AMPK en el Ser-108 y Thr-172 (Fig. 8B y 8C]. El análisis por inmunotransferencia de las citoquinas (TNF-α y la IL-1 β) células tratadas mostraron significativamente el aumento de la fosforilación ERK (MAP quinasa de activación) y un tratamiento más β upregulated esta MAP quinasa activación (Fig. 8D]. AICAR tratamiento regulado por citoquinas / A β-inducida por la activación de las MAP quinasas. Estas observaciones indican que la activación de AICAR quinasa AMP por la fosforilación de sus subunidades catalíticas (Thr-172 de α 1 / α 2 subunidades) puede posiblemente abajo-MAP quinasa regular la activación e inhibición de la expresión de genes proinflamatorias. Sin embargo, en la actualidad, no está claro cómo la activación de la quinasa AMP mediara cascada de activación de la reducción de las MAP quinasas.

AICAR inhibe o LPS-SMase y A-β (25-35) inducida por NF-κ B, AP-1, C / EBP y CREB vinculante actividad

Como factores de transcripción NF κ B, AP-1, CREB y la C / EBP son a menudo el blanco de abajo MAP quinasa cascadas de señalización, para el transactivation de genes expresados bajo condiciones proinflamatorias [12, 38, 39]. Estos factores de transcripción tienen consenso secuencias de las regiones en el promotor de los genes proinflamatorias como la iNOS, COX-2, MnSOD, así como los de citoquinas [38]. Por lo tanto, estamos investigando el posible papel de estos factores de transcripción en AICAR mediada regulación de la expresión de genes proinflamatorias. Los cultivos de células transfectadas transitoriamente con vectores de expresión de NF-κ B luciferase o C / EBP-luciferase, a la estimulación con LPS / A β (1-42) péptido upregulated luciferase actividad, un reflejo de la activación de estos factores de transcripción. El tratamiento con AICAR mostró dependiente de la dosis de atenuación de estas actividades luciferase (Fig. 9A]. Para confirmar aún más estas observaciones, se realizó la AESM para la activación de estos factores de transcripción. Un tratamiento β upregulated la LPS-SMase o inducida por unión de estos factores de transcripción y este aumento de la actividad vinculante fue bloqueada por AICAR tratamiento (Fig. 8B]. NF κ B / IKK-transcripcional mediada actividad implica diferentes subunidades de NF κ B (RelA/p65, c-Rel y Rel B, o la NF κ B p50 y p52 heteromeric combinación) [38, 40]. Supershift análisis de NF κ B usando anticuerpos frente a diferentes subunidades de NF κ B demostrado la posible participación o implicación de p65, p52 y Rel B subunidades en la NF κ B complejos [Fig. 9 (ci]]. C / EBP β y δ Según se ha informado, los reguladores clave en el pro-inflamatorias cascadas en células gliales rodean a la placa amiloide en la enfermedad de Alzheimer el cerebro [12, 39]. El mismo análisis usando anticuerpos frente a diferentes C / EBP subunidades puesto de manifiesto la participación de C / EBP α, β y δ componentes en LPS / A β-péptido induce la activación de C / EBP (Fig. 9C-ii].

AICAR atenúa la inhibición de la neurite resultado en PC-12 células por astroglial medio condicionado obtenido de neuroglia después de la estimulación con LPS y un β (25-35)

La acumulación de la proteína amiloide-β, una característica patológica de la EA, que también contribuye a muchas alteraciones de la estructura neuronal que conduzca a la pérdida axonal y la consiguiente a la pérdida de células neuronales [41, 42]. Para investigar más a fondo el papel de AICAR como agente neuroprotector en contra de citocinas y mediadores inflamatorios liberados por células gliales (citocinas, prostanoides y el óxido nítrico), se estudió el efecto de los medios de comunicación de LPS acondicionado / A β-péptido tratados sobre células gliales NGF inducida neurite Extensión de la PC-12 células. El régimen de tratamiento se describe en la figura 10A, y en virtud de 'Métodos'.

PC-12 células (Fig. 10], después de la estimulación con NGF, mostró crecimiento neuronal formando una red neuronal que recuerda de extensiones (Fig. 10B]. Ellos tienden a formar una amplia neurites que parecía estar bien conectado a las células adyacentes. Desafío de las células con pre-medio condicionado de células gliales llevado a la pérdida de NGF inducida neurite extensión y también a la agrupación de células y la muerte de las células (Fig. 10C]. AICAR células tratadas (vehículo) sin los medios de comunicación acondicionado mostraron, en promedio, 20% menos que neurites control de las células no tratadas (Fig. 10D]. Sin embargo, de que a medio impugnada células mostraron mayor que el 80% de pérdida en neurites en la media, mientras que, AICAR tratamiento de la reducción de esta pérdida a un 25% la pérdida de neurites. Para descartar la posibilidad de que un β (25-35), el péptido de medio condicionado puede ser un factor que contribuye a la pérdida observada de neurites, A β (25-35) (1 μ M), tratada con células PC-12 ~ 18% mostró pérdida En neurites en comparación con más del 80% de pérdida en el medio condicionado de células tratadas. AICAR tratamiento a concentraciones de 0,25, 0,5 y 1 mM llevado a 40 -, 53 - y 62 por ciento de protección contra la pérdida neurite, respectivamente (Fig. 10E]. Sin embargo, la mayor concentración de AICAR (2 mM) resultaron ser tóxicos (datos no presentados). En una serie de experimentos similares se observó similar neurite extensión de la protección por AICAR contra citoquinas (TNF-α e IL-1 β) / A β (7,5 μ M) (datos no mostrados aquí).

Discusión

Hemos informado anteriormente de que LPS / A β-proinflamatorias inducidas expresión de los mediadores (por ejemplo, iNOS) es mediado a través de la SM-ceramida asociada cascada de señalización redox celular [12, 32]. El estudio muestra la activación de AMPK por AICAR, y su posible baja regulación de LPS-o citoquinas / A β de señalización mediada por actos relacionados con el estrés oxidativo celular y la actividad inflamatoria. Estas conclusiones se basan en las observaciones siguientes. El antioxidante funciones de AICAR se desprende de las observaciones que los bloques de AICAR-LPS y LPS ± A β-inducida por la generación de ROS (Fig. 6], así como la liberación de óxido nítrico, muy similar a la observada con otros antioxidantes como la NAC O Vitamina E [12, 43]. Además, MnSOD expresión (el sensor de estrés oxidativo mitocondrial), se upregulated junto con citoquinas proinflamatorias, iNOS, y la COX-2 en LPS / A β-estimulado las células y su expresión está regulada por AICAR siguiente tratamiento (Figs 2, 3, 4, 5, 6]. Estos antioxidantes y anti-inflamatorios funciones de AICAR (Figs. 1, 2, 3], sus efectos protectores asociados, y su promoción de neurite resultado prórroga por PC-12 células (Fig. 10] expuestos a la neuroglia acondicionado medios de comunicación (y, por ende, a Mediadores de la inflamación activado secretada por las células gliales) indican que AICAR puede ofrecer protección contra los mediadores de la inflamación (citoquinas, el NO y el O 2 • -) y A-β a la toxicidad mediada por las neuronas en la EA. En estudios de cultivo de células (in vitro) AICAR es eficaz para atenuar el proceso inflamatorio en 0.5-1 mM, y hasta 2 mM sin toxicidad observada. También hemos probado la eficacia de AICAR en la atenuación de la lesión por isquemia-reperfusión en un modelo canino de la autotransfusión trasplante renal a 50 mg / kg de peso corporal [44], un modelo animal de la encefalomielitis autoinmune experimental [45], un modelo animal de múltiples En la esclerosis 100-500 mg / kg de peso corporal, y la neurotoxicidad inducida por LPS en ratas a 100 mg / kg de peso corporal [19], sin efectos secundarios. Esto apunta a la in vivo efectos beneficiosos de este compuesto en contra de los mecanismos de respuesta inmune inflamatoria.

AICAR, a la internalización en las células es inmediatamente cinasa fosforilados por adenosina monofosfato riboside AICA a la ZMP (un nucleótido de purina), que imita el efecto de la AMP, sin alterar la relación de celular ATP / AMP y, por lo tanto se activa quinasa AMP kinasa (AMPKK), y, en A su vez AMPK [16, 46]. AMPK se sabe que regulan el transporte de glucosa [47] y su metabolismo [48], la disminución de la presión arterial, hígado impulsar la acción de la insulina [49], mejorar la resistencia a la insulina inducida por los ácidos grasos libres [18], y regular la síntesis de proteínas [50] y forkhead Factor de transcripción FKHR (FOXO1a) [51]. También se informa de que disminuye la síntesis de ácidos grasos, así como de colesterol [52]. Estas observaciones indican la participación de AMPK en la regulación del metabolismo energético celular. Hemos informado anteriormente sobre el papel anti-inflamatorio de AICAR través de la activación de la AMPK en el refrescante LPS inducida pro-inflamatoria por bloqueo de las respuestas MAP quinasa y IKK α/β- cascadas de señalización [19]. AICAR tratamiento activado actividad quinasa AMP, y oligonucleótidos antisentido para AMPKK α, así como expresión de cDNA dominante negativo de AMPK α neuroglia invertido en la AICAR-iNOS mediada por la inhibición de la expresión génica en respuesta a LPS de tratamiento [19]. Estos estudios demuestran AICAR atenuación de LPS-o citoquinas / A β-inducida por la expresión de los mediadores de la inflamación (por ejemplo, iNOS, COX-2 y citoquinas) mediante la inhibición de la activación de factores de transcripción (NF κ B, y C / EBP) que se requieren para la inducción del proceso inflamatorio . Por otra parte, el presente estudio pone de relieve una nueva novela AICAR en función de la protección de neurite producto contra la toxicidad de los mediadores de la inflamación secretada por astrocitos y microglia activada. Esta protección de neurite crecimiento puede ser mediado, en parte, a través de la energía (ATP) de ahorro de los mecanismos de activación de la AMPK desde AMPK se sabe que el cierre o la lentitud de las reacciones de consumo de energía en la célula [16].

Las alteraciones de redox celular parecen ser el centro de eventos inflamatorios asociados con la toxicidad amiloide (Fig. 11] [12, 20, 43]. Citoquinas así como un β péptidos son conocidos perturbar el estado redox intracelular a través de la generación de especies reactivas de nitrógeno (RNS; NO, ONOO -) y especies reactivas de oxígeno (ROS; O2 -, OH - y de H 2 O 2) [53, 54 ] Y, más importante aún, por la reducción de tioles celulares [glutatión y otros mercaptanos (total de los compuestos que contienen grupo tiol)] [35]. Células gliales tratados con LPS y β mostró una significativa reducción de los niveles intracelulares de glutatión y mercaptanos. Sin embargo, el tratamiento AICAR restaurado tioles intracelulares (Fig. 7]. Del mismo modo, MnSOD expresión es casi normalizado en las células tratadas con AICAR (Figs 2, 3, 4, 5, 6]. Estos resultados apoyan la idea de antioxidantes y anti-inflamatorios de AICAR funciones y, por ende, el potencial de AICAR como posible terapia para la enfermedad inflamatoria procesos.

Detalles de las vías de transducción de señales que median los efectos neurotóxicos de β-amiloide en las neuronas y en la neuroglia siendo difícil de alcanzar. Sin embargo, la biología gliales en relación con neuro-respuestas inflamatorias es importante por las siguientes razones: a) el número de células de Glial neuronas, b) Glia participan en la upregulation iNOS y de las citoquinas y, por tanto, podrán participar en β-amiloide crónica inducida por la activación De astrocitos observado en AD [55]. Astroglia de citocinas liberadas puede activar aún más en torno a astrocitos que sean necesarias para phagocytose excesivamente generado amiloide. El posible papel del NO en el daño neuronal con el apoyo de la protección observada con inhibidores de NOS (g N-nitro-L-arginina metil ester [L-NAME]) en A-β (1-42) inducida por la pérdida selectiva de neuronas colinérgicas [13 , 29, 56]. Además, la inducción de la iNOS tras la inyección directa de β-amiloide en el cerebro de ratas también apoya un papel para el NO en la toxicidad inducida por un β-neurotoxicidad mediada [55]. Liberación de citoquinas inflamatorias, iNOS, ROS y NO puede causar estrés directo a las neuronas. Sin embargo la generación de ROS y NO en el mismo entorno puede tener efectos potencialmente perjudiciales, debido a la formación de los radicales peroxinitrito, que tienen el potencial para causar estrés y de la apoptosis neuronal (Fig. 11A y [57]]. En roedores modelo de estudios, astrocitos se informó de daños a las neuronas a través de la producción de NO [3]. Por lo tanto nuestros resultados descritos en este estudio, la documentación de la inhibición de la producción de NO y ROS por AICAR, sugieren AICAR / AMPK mediada la protección contra la citoquina / A β-inducida por el estrés oxidativo / neurotoxicidad en AD.

Varios estudios han indicado que el uso de antiinflamatorios no esteroideos (AINE) puede retrasar la aparición y / o frenar el deterioro cognitivo en EA [58, 59]. COX-2 es una importante enzima en la PLA2 vías para la síntesis de diversos eicosanoids (Fig. 11 y [55]]. Hay pruebas de que la COX-2 puede exacerbar la lesión neuronal en una variedad de enfermedades [58]. Se ha informado de que la ceramida generada por SMase activado activa cPLA2 cascadas que conduzca a una mayor expresión de COX-2 y, por tanto, a la liberación de eicosanoids [55, 60]. ROS son otra consecuencia de la conversión de ácido araquidónico a prostanoides (prostaglandinas y leucotrienos), y tal vez uno de los principales contribuyentes de la muerte de las células neuronales [61]. COX-2 sobre-expresión ha informado de apoptosis neuronal en la muerte celular, y la inhibición de la COX-2 ha informado de la actividad para proteger a las neuronas contra excitoxicity en isquemia-e incautación inducida por lesión [58, 62]. Inhibidores específicos COX-2 también se ha informado de reprimir la actividad COX-2 y reducir la muerte celular neuronal en el SNC de los modelos animales de isquemia cerebral [63, 64]. Upregulation de expresión COX-2 en un modelo murino de Alzheimer [65] y en el cultivo de células de los estudios se ha informado, en respuesta a una β toxicidad [66], lo que indica el potencial de los selectivos de la COX-2 inhibidores como agentes neuroprotectores en AD [58, 59] . Dado que, iNOS y COX-2 son importantes componentes de la lesión después de la cascada inflamatoria en diversos tipos de daño cerebral [67], observó la supresión de un β y LPS / citocinas inducidas COX-2/iNOS expresión en cultivos de células gliales indica la Potencial de AICAR para proteger contra un β-enfermedad inflamatoria inducida proceso.

Conclusión

Los temas principales de la formación de ROS y RNS asociados a la neuroinflammatory procesos, y la represión de los mismos por el estrés mecanismos antioxidantes, continuará dando frutos buenos candidatos para nuevas terapias. Anti-oxidantes se han notificado a tener efectos beneficiosos contra la enfermedad de Alzheimer [6, 20]. Numerosos estudios experimentales en diversos paradigmas de la muerte de las células neuronales tanto in vitro como in vivo, han demostrado la protección por radicales libres incluyendo la vitamina E, el estrógeno, ebseleno, flavanoids, N-acetil cisteína, glutatión, ácido α-lipoico, etc [20] . El hecho de que un β-péptido asociado el daño oxidativo conduce a neuroinflammation, que es efectivamente atenuada / bloqueado por AICAR tratamiento, proporciona una fuerte evidencia de que los procesos de alteración de equilibrio redox están directamente relacionados con la neuroinflammation.

Progresión de la enfermedad en la enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa de estrés neuronal masiva, contribuyendo a la pérdida de la función cognitiva observada en la enfermedad. Muchas regiones del cerebro en pacientes con EA muestran los cambios en los campos axonal y dendrítica, neurites distrófico, la pérdida de sinapsis, así como la pérdida neuronal [41]. La acumulación de β-amiloide y la proteína tau cambios inducidos (en forma de 'ovillos neurofibrilares') son características patológicas de la enfermedad y se cree que contribuyen a muchas de estas alteraciones neuronales de las estructuras [42]. Más aún, las áreas del cerebro que muestra un alto grado de plasticidad son particularmente vulnerables a la degeneración en la enfermedad de Alzheimer. Quizás esto se debe a una pérdida de la capacidad regenerativa del cerebro, relativa a la reanudación del crecimiento axonal, o tal vez una menor capacidad de las células madre pluripotentes para sustituir neurites distrófico. AICAR, por lo tanto, el potencial de la ayuda a neurite derivación en células PC-12 desafió con mediadores tóxicos indica que puede resultar beneficiosa en la AD, tal vez conduzca a la recuperación funcional de estos pacientes. En conclusión, observó el anti-inflamatorio y anti-oxidante y neuroprotectores funciones de AICAR punto a las múltiples posibilidades de regulación y terapéuticos de este fármaco para la AD.

Lista de abreviaturas utilizadas

AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamida-1-beta-4-ribofuranoside); A β (péptido beta amiloide), ROS (especies de oxígeno reactivo); RNS (especies de nitrógeno reactivo); NGF (factor de crecimiento del nervio); MnSOD (manganeso Superóxido dismutasa); SDS-PAGE (dodecil sulfato de sodio-electroforesis en gel de poliacrilamida); MTT (methylthiazoletetrazolium); EMSA (Electrophoretic movilidad cambio de ensayo), la COX-2 (Cycloxygenase-2), TNF-α (factor de necrosis tumoral alfa); SMase (Sphingomyelinase); ROS (especies reactivas del oxígeno); NF κ B (factor nuclear kappa B), C / EBP (CCAAT potenciador de la proteína de unión).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

KRA llevado a cabo los diversos experimentos, participó en el diseño del estudio y ayudó a redactar el manuscrito.; AKS y se participó en el diseño del estudio y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Dr Shailendra Giri por su inmensa ayuda en las diversas etapas de experimentación y en el proceso de preparación del manuscrito. También damos las gracias a Ramandeep Ratán para la asistencia de laboratorio, el doctor Manu Jatana por su ayuda con la microscopía y la Sra Joyce Bryan secretariado para ayudar. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones (NS-22576, NS-34741, NS-40144, NS y NS-40810-37766) de los Institutos Nacionales de Salud.