Nuclear Receptor, 2005; 3: 2-2 (más artículos en esta revista)

Evolutivo de selección a través de la superfamilia de receptores hormonales nucleares con un enfoque en la subfamilia NR1I (vitamina D, pregnane X, y constitutiva androstane receptores)

BioMed Central
Mateo D Krasowski (krasowskim@upmc.edu) [1], Kazuto Yasuda (kazuto.yasuda @ stjude.org) [2], Lee R Hagey (lhagey@ucsd.edu) [3], Erin G Schuetz (erin.schuetz @ Stjude.org) [2]
[1] Departamento de Patología, Hospital de Niños de Pittsburgh, 5834 Main Tower, 200 Lothrop Street, de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EE.UU. 15213
[2] Department of Pharmaceutical Sciences, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, 38105 USA
[3] Department of Medicine, University of California, San Diego, CA, 92093, USA

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Resumen
Antecedentes

Los receptores hormonales nucleares (NR) superfamilia complemento en el ser humano se compone de 48 genes con diversas funciones en la homeostasis metabólica, el desarrollo, y de desintoxicación. En general, rupias están muy conservados entre las especies de vertebrados, y algunos ejemplos de la adaptación molecular (selección positiva) dentro de esta superfamilia se han demostrado. Estudios anteriores utilizando dos especies comparaciones revelan fuerte purificador (negativo) NR selección de la mayoría de los genes, con dos posibles excepciones son el ligando vinculante dominios (LBDs), de la del receptor de pregnane X (PXR, NR1I2) y la constitutiva androstane receptor (CAR, NR1I3), dos proteínas implicadas en la regulación del metabolismo de compuestos tóxicos y la eliminación. El objetivo de este estudio fue aplicar detallado análisis filogenético utilizando métodos de máxima verosimilitud a todo el complemento de los genes de vertebrados en la superfamilia NR. Los análisis se llevaron a cabo tanto a través de todos los vertebrados y limitada a los mamíferos y también por separado para los dos principales ámbitos de rupias, el dominio vinculante ADN (DBD) y LBD, además de las secuencias de larga duración. Adicional datos funcionales es también informó de la activación de PXR y el receptor de la vitamina D (VDR; NR1I1) para obtener más información sobre la evolución de la subfamilia NR1I.

Resultados

La NR genes parecen estar sometidas a una fuerte selección purificadora, en particular en el DBDs. Las estimaciones de la proporción de los no sinónimos sinónimo de nucleótidos a las tasas de sustitución (relación entre la ω) reveló que sólo el PXR LBD tenido una subpoblación de los codones con un estimado de ω ratio mayor que 1. CAR también fue inusual en el que muestran elevados en relación ω ratios tanto en el DBD y LBD, un hallazgo que puede referirse a la reciente aparición de la CAR gen (presumiblemente por la duplicación de un pre-gen de mamíferos PXR) justo antes de la evolución de los mamíferos. Análisis funcionales de la subfamilia NR1I demostrar que humanos y de pez cebra PXRs muestran similares activación de las hormonas esteroides y principios de las sales biliares, las propiedades no compartida por la lamprea de mar, un ratón o humano VDR, o por Xenopus laevis PXRs.

Conclusión

NR genes en general, muestran un fuerte secuencia de conservación y pocas pruebas de selección positiva. Las principales excepciones son PXR y CAR, los genes que pueden se han adaptado a las diferencias entre las especies tóxicas en el complejo de la exposición.

Antecedentes

Los receptores hormonales nucleares (rupias) ligando son activados por factores de transcripción que trabajan en concierto con los co-activadores y co-represores de regular la expresión de genes [1 - 3]. Rupias comparten una estructura modular de dominio, que incluye, de las N-terminal a C-terminal, un modulador A / B de dominio, el dominio vinculante ADN (DBD; dominio C), la bisagra D dominio, el dominio vinculante ligando (LBD ; Dominio E) y una variable C-terminal F de dominio que no se da en algunas rupias [3]. Ejemplos de ligandos rupias para incluir una gama de compuestos endógenos como las hormonas esteroideas, la hormona tiroidea, y los retinoides [3, 4]. Unas pocas rupias, como el 'xenobióticas sensores' pregnane X receptor (PXR, NR1I2) y constitutiva androstane receptor (o NR1I3 CAR), se activan por estructuralmente diversos ligandos exógenos [5 - 7].

La NR superfamilia de los mamíferos está compuesto de aproximadamente 50 genes funcionales, con 48 genes en los seres humanos, 47 en ratas, ratones y 49 en [8]. Peces óseos tienen un complemento de algo más grande NR genes debido a la duplicación de genes, por ejemplo, los 68 NR genes que se encuentran en el genoma de la pufferfish Fugu rubripes [9]. La actual nomenclatura oficial de la superfamilia rupias divide en 7 familias (NR0-6) [10, 11]. El NR0 familia, en los seres humanos representados por DAX-1 (dosis de sexo y sensible AHC crítica región en el cromosoma X; NR0B1) y SHP (pequeños heterodimer socio; NR0B2) son extraños en esencia ser 'dominio singletons ", que carecen de una DBD [ 12, 13]. Rupias nepalesas han sido el centro de una serie de estudios evolutivos que incluye detalladas investigaciones sobre los orígenes de la superfamilia [11, 14 - 16] y en el desarrollo de la selectividad ligando por el sexo y los receptores de hormonas esteroides adrenocortical [17 - 20].

Uno de los temas centrales de filogenética molecular ha sido una búsqueda de pruebas de selección positiva (adaptación molecular) [21]. Una variedad de técnicas computacionales se han desarrollado en los últimos decenios para detectar las variaciones de nucleótidos entre los diferentes genes indicativos de selección positiva [21, 22]. Para las comparaciones dentro de la codificación de las regiones, el enfoque más común es comparar las variaciones de nucleótidos que no es sinónimo (es decir, cambios de secuencia de aminoácidos codificados por los codones) o sinónimos (no cambios secuencia de aminoácidos). Sinónimo variación que se considera neutral, un supuesto que es cierto en general, aunque hay excepciones [23]. La proporción de la tasa de no sinónimos frente a la tasa de variación sinónimo de nucleótidos (es decir, cuántos no sinónimos o sinónimos se han producido cambios en comparación con el número total de no sinónimos o sinónimo cambios posibles; d n / d S o Ω) proporciona algunas indicaciones selectivas en las fuerzas que actúan sobre un determinado gen. Para la mayoría de las comparaciones de genes, ω es inferior a uno, a menudo menos del 0,1, de reflexión o de la purificación de selección negativa de mantener una secuencia de aminoácidos conservados. Ω = 1 refleja neutral de selección (una proporción que la que se esperaría para un pseudogen no funcionales), mientras que ω> 1 sugiere selección positiva. Un gran escala de comparación de los 3595 grupos de genes homólogos reveló que menos del 0,5% ha ω ratios mayores que 1, con muchos de estos genes se encuentran en los microorganismos [24]. Habida cuenta de que las comparaciones entre los de larga duración secuencias genéticas raras veces en el resultado ω ratios mayores que 1, se han desarrollado técnicas para detectar subpoblaciones de los codones que tienen elevados coeficientes de ω. Diferentes enfoques matemáticos que se han aplicado para lograr este objetivo, incluido el de máxima verosimilitud [25, 26] y [27] Bayesiano métodos. En este estudio, se emplearon las PAML (Análisis filogenético por máxima probabilidad) de software, desarrollado por Yang y colaboradores [28], ya que esta metodología es sólida y cuenta con una amplia bibliografía publicada asociados con su aplicación en la investigación biomédica [21].

La mayoría de los genes están fuertemente NR conservados entre las especies de vertebrados. No es de sorprender que los estudios anteriores que utilizan dos de las comparaciones entre especies-humano, el ratón y la rata o de los seres humanos, los chimpancés, los genomas del ratón y de la NR reveló que los genes son, en general, con sujeción a la selección negativa [8, 29], con sólo unas pocas excepciones tales posible Como la LBDs de PXR y CAR [8, 30]. Un análisis más detallado análisis filogenético de PXR, CAR, y el otro miembro de la subfamilia NR1I, el 1,25 - (OH) 2 vitamina D-3 del receptor (VDR; NR1I1), y dentro de los mamíferos a través de los vertebrados, mostraron coeficientes de la ω CAR y PXR LBDs notablemente más alto que el de la VDR LBD [30]. Para el PXR LBD análisis en los mamíferos, la proporción es superior a un ω para un subgrupo de población de los codones que comprende aproximadamente el 5% del total de codones en el LBD [30].

Dado que una de las principales funciones de PXR y CAR es detectar tóxicos endógenos y compuestos xenobióticos que probablemente difieren entre las especies [5, 6], estos dos genes pueden representar inusual NR ejemplos de genes que se han sometido a la selección positiva en sus LBDs de ventaja funcional. El objetivo de este estudio fue aplicar detallado análisis filogenético a toda la superfamilia de genes en vertebrados NR para detectar posibles positivos de las firmas de selección. Este análisis filogenético, en combinación con los análisis funcionales de PXRs y VDR, brinda un contexto detallado en la forma inusual de la variación de nucleótidos PXR y CAR es el resto de la superfamilia.

Resultados
Secuencias disponibles para el análisis filogenético

Los datos de la secuenciación del genoma de proyectos (por ejemplo, humanos, chimpancé, ratón, rata, perro, pollo, Xenopus tropicalis, Fugu rubripes, y Tetraodon nigroviridis) ha aumentado mucho el número de secuencias de codificación NR disposición del público a través de análisis filogenético de los vertebrados. El conjunto completo de las especies y números de acceso para la NR genes analizados en este estudio se presenta en el archivo adicional 1: Los genes utilizados para el análisis filogenético. Completar las secuencias de nucleótidos en PAML se proporcionan en formato de archivo adicional 2: Secuencias utilizados para el análisis filogenético de PAML. Para poder mejorar la precisión de la detección de positivos y de selección para minimizar el riesgo de falsos positivos, PAML análisis sólo se realiza si la secuencia de datos de al menos seis especies de por lo menos seis géneros estaban disponibles [22, 31 - 33]. Habida cuenta de que algunos de los datos de la secuencia fue parcial y sólo contiene datos completos para el DBD o LBD (y no de larga duración en la secuencia de los casos), el número de especies disponibles para los distintos análisis para cada uno de genes (es decir, de larga duración, DBD sólo, y sólo LBD) difiere en algunos casos. El número de secuencias varía ampliamente en la superfamilia NR, principalmente debido a que algunos receptores se han estudiado más intensamente que otros. Por ejemplo, el 33 de longitud completa secuencias están disponibles para el análisis de la α-receptor de estrógeno (ER α, NR3A1), mientras que sólo 6 están disponibles para los receptores de estrógenos relacionados con β-(ERR β, NR3B2).

PAML análisis de la superfamilia NR

El PAML los análisis utilizados corresponden a modelos M0, M3 (con ncatG = 2, 3, 4, en donde ncatG es el número de poblaciones de los codones con distintos coeficientes de ω), M7, M8 y en el software de PAML (véase Materiales y Métodos) [ 25, 26]. Modelos M0 y M3 son "discretos" en el sentido de que asignan a la población de los codones (s) de los distintos coeficientes de ω. Por ejemplo, un análisis de un determinado gen puede ceder el 95% de los codones ω a un ratio de 0,05 (en consonancia con la purificación de selección) y el restante 5% a un ω ratio superior a 1 (indicativos de selección positiva). Para cada M0/M3 análisis, el 'mejor modelo de mínimos "se determinó. Un análisis de M3 fue elegido si sólo fue estadísticamente superior a la simple modelo más cercano (por ejemplo, la M3 con 2 ω ratios versus M0). Los coeficientes de ω en el M0 o M3 análisis puede ser cualquier valor 0 o mayor. M7 asigna codones en un gen a lo largo de una coeficientes ω β función de distribución entre 0 y 1 con parámetros α y β. Dependiendo de los parámetros α y β, β la distribución puede tener más ω ratios agrupados cerca de 0 o se distribuyen más uniformemente entre 0 y 1. M8 es un modelo en el que algunos han codones ω ratios que se encuentran a lo largo de un β distribución, pero el resto de los codones formar una población separada, con un discreto ω ratio que puede ser cualquier valor 0 o mayor (incluido el mayor que 1). M8 puede detectar la presencia de la selección positiva (es decir, la clase ω extra puede ser mayor que 1) que no puede M7.

M0 y M3 análisis

Los resultados completos de todas las PAML análisis adicionales se proporcionan en el archivo 3: Resultados de PAML análisis y treefiles. La distribución de frecuencia y los porcentajes para todos los ω NR genes se traza en la Figura 1 (partes A, B, C, y corresponden a la secuencia de larga duración, sólo DBD y LBD sólo analiza, respectivamente; los círculos abiertos son para los análisis de todos los vertebrados Mientras que los círculos cerrados de análisis se limita sólo a los mamíferos). Cada punto en las parcelas en la Figura 1 corresponde a la frecuencia y ω ratios mínimas para el mejor modelo que proporciona un ajuste estadísticamente superior a los datos a través de la simple modelo más cercano (ver leyenda de la Figura 1 para más detalles).

En términos generales, los análisis confirman la M0/M3 original observaciones de dos especies de las comparaciones que la NR genes son, en general, sujeto a una fuerte selección negativo, en particular en el DBD [8, 29]. El DBDs mostrar ω ratios más bajos que el LBD o secuencias de larga duración (Figura 1B]. Sólo NR1C1 (peroxisome-proliferador activado del receptor-α; PPAR α) tiene una sub-población de los codones en el DBD con un estimado de ω ratio es superior a 0,5, y esta sub-población corresponde a sólo el 1 codón de las 66 analizadas. Una serie de genes, incluida la NR1B1 (ácido retinoico receptor-α; RAR α), NR2B1 (receptor retinoide X-α; RXR α), NR3B1 (ERR α), y NR3B2 (ERR β), prácticamente no muestran no sinónimo de nucleótidos diferencias entre especies diferentes En el DBD y han ω ratios cerca de 0 (<0,01). NR1A1 (TR α) y NR1I3 (CAR) son poco frecuentes en relación a los otros genes en NR tener al menos el 15% de los codones con un estimado de ω ratio es superior a 0,1.

El LBDs de la NR genes muestran claramente superior ω ratios de la DBDs (Figura 1C]. Sin embargo, a pesar de esto, la mayoría de los receptores (41 de 48) han ω ratios para todas las subpoblaciones de menos de 0,5 codones. Sólo PXR genes, sólo analizó el contenido de los mamíferos, con una sub-poblaciones de los codones ω con un ratio superior a 1, lo que corresponde a la clase ω 5% de todas las analizadas en los codones PXR LBD. El análisis de la larga duración del receptor de las secuencias en general sigue las tendencias visto para el análisis LBD sólo con pequeñas diferencias (comparar Figura 1A y 1C]. Para proporcionar otro comparación con PXR y CAR, PAML análisis se aplicó a la LBD de los receptores de hidrocarburos aril-1 (AHR), una organización no-NR que tiene una función similar a la CAR y PXR, es decir, para responder a ligandos (incluyendo xenobióticos) Y regular la expresión de genes implicados en el metabolismo y la eliminación de compuestos potencialmente tóxicos [34]. En contraste con PXR y CAR, la ω coeficientes asociados a la AHR LBD son más similares a la mayoría de los genes que a NR PXR o CAR (véase rojo abierto y cerrado triángulos en la Figura 1C].

M7 y M8 análisis

Para la mayoría de los análisis, M8 no fue estadísticamente superior a la neutral modelo M7. Sólo 10 de 132 análisis de todas las especies de vertebrados y 3 de 65 para los análisis de los mamíferos sólo reveló M8 resultados estadísticamente superiores a M7. Ninguno de los análisis M8 identificó una subpoblación de los codones ω con un ratio superior a 1. Una vez más, sin embargo, el análisis no identificar una subpoblación de los codones en el PXR LBD con un alto coeficiente de ω en relación con otros rupias (por ejemplo, para el análisis de la escuela para pedir PXR receptores para todos los vertebrados, la M8 análisis encontró 3,4% de PXR los codones, todo ello en el LBD, ω con un ratio de 0,97).

La Figura 2 muestra las parcelas derivadas de la estimación de β-parámetros para la distribución M7 (M8 o, de ser estadísticamente superior a M7) análisis de los genes NR. El β-es una distribución continua de la función para la que PAML análisis está restringido a los valores entre 0 y 1. Dependiendo de los parámetros α y β-β de la distribución, los valores pueden ser agrupados más hacia 0 o ser más uniformemente distribuidos entre 0 y 1. Figura 2 parcelas para un determinado gen cuántos codones han estimado los coeficientes ω igual o inferior a un determinado ratio ω en la abscisa. Por ejemplo, para el análisis de la LBD de NR3B1 (ERR α), el análisis M7-β produce una distribución donde todos los coeficientes de variación de ω a través de los codones se explica por ω ratios <0.01 (ver Figura 2C]. En cambio, para el análisis PAML DBD y LBD de β-CAR muestran las distribuciones que abarcan una gama de ω ratios superiores a todos los otros genes NR; el mismo análisis para PXR están en segundo lugar solamente a la CAR en el rango de coeficientes abarcó ω (Figura 2B , C]. Los dos LBD dominio 'simple', DAX-1 y SHP también muestran un mayor lapso de ω ratios que la mayoría de otros genes NR (Figura 2A, C; DBD análisis de DAX-1 y SHP no es posible ya que son de dominio singletons). Similar a la M0/M3 los análisis descritos anteriormente, PAML M7/M8 análisis se aplica también a la de la LBD AHR LBD. En contraste con PXR y CAR, la β-ω coeficientes de distribución a través de los codones en el AHR LBD fue semejante a la mayoría de los genes NR PXR o que a la CAR (ver línea roja en la Figura 2C].

Variación individual entre los codones en determinados genes NR

El M3 PAML análisis también proporcionan estimaciones de la media ω ratio para cada codón en un gen o genes de dominio. Esto proporciona alguna indicación específica de que los codones son potencialmente sujetos a la selección positiva. La Figura 3 muestra una parcela de media calculada ω coeficientes de la LBDs NR, de 7 de los genes y los genes AHR. LBDs a través de la comparación de los genes NR1I subfamilia muestra que ha PXR muy diversos coeficientes de variación de ω a través de los codones con el 5,1% de los codones en el análisis de los mamíferos sólo significa haber estimado ω ratios superiores a 1 (Figura 3C]. En cambio, VDR, cuya función principal es responder a 1,25 - (OH) 2-vitamina D 3 (calcitriol), un ligando se conserva en todas las especies de vertebrados, se muestra mucho más baja entre el codón variación de los coeficientes de ω CAR o PXR (Comparar figuras 3A, C, E]. El patrón de variación a través de los codones ω CAR de la AHR y de genes son similares descriptiva (Figura 3E, H]. Para los mamíferos, sólo el análisis, la media mayor ω ratios están claramente asociados con la Helix1-3 (H1-3) 'insertar' de la región PXR. La H1-3 insertar es muy divergentes entre los genes y el PXR, similar a la CAR los genes, los dos Xenopus laevis BXRs falta esta secuencia por completo. Este tramo de la secuencia se excluyeron de los análisis de VDR y PXR para todas las especies de vertebrados debido a la extrema divergencia de secuencias y dificultades en la adaptación.

El análisis de otros genes NR también muestran alguna variación de la diversidad de nucleótidos a través de los diferentes receptores. RXR β (NR2B2) es un ejemplo de un grupo de rupias cuya LBDs muestran muy bajos en todos los ratios ω codones (Figura 3B]. También hay diferencias entre los LBDs del sexo y los receptores de esteroides adrenocortical con el receptor de andrógenos (AR, NR3C4) mostrando bajos coeficientes de ω, la β-receptor de estrógeno (ER β, NR3A2) algo mayor, y el receptor de glucocorticoides (GR, NR3C1) Los más altos coeficientes de ω de los tres (Figura 3D, F, G]. El algo mayor ω ratios para seleccionar los codones en el GR puede referirse a este receptor puede ser uno de los evolutivamente 'nuevos' clásicos receptores de esteroides, los receptores de estrógeno y progesterona siendo los más ancestrales [17 - 20].

Los receptores descritos anteriormente son ligando-dependientes. Un grupo de receptores de contrastantes son los' ligando-independiente 'rupias, de los cuales relacionados con los receptores de estrógenos (ERR α, NR3B1; ERR β, NR3B2; ERR γ, NR3B3) [35], androgénica, factor 1 (SF-1; NR5A1) [36 ], Y el hígado del receptor homólogo 1 (LRH-1, NR5A2) [36] son ejemplos. Estos rupias se activan en ausencia de ligando, aunque trabajos recientes han demostrado que la fosfatidilcolina inositols es probable ligandos endógenos para el SF-1 y LRH-1 [36]. La historia evolutiva de ligando-independiente rupias es incompleta entendido [11, 20], con una propuesta vinculante que el ligando es, en realidad, el estado ancestral para el SF-1 y LRH-1 [36]. Los coeficientes de ω α ERR, ERR β, γ ERR, SF-1, y LRH-1 son todos en el extremo inferior de la superfamilia NR, tanto a través de todos los vertebrados y dentro de los mamíferos (archivo adicional 3: Resultados de PAML análisis y treefiles), con Ω patrones de variación a través de los codones proporción muy similar a la observada con el receptor de andrógenos (Figura 3G]. Aunque es posible limitarse selección positiva se ha producido en un pequeño número de codones en los cinco ligando-independiente de los receptores se ha dicho, este no fue detectado por los análisis de PAML.

La figura 4 muestra la variación ω través de la relación de los codones DBDs de seis NR genes. En general, los coeficientes de ω son en general muy inferiores a 1, en consonancia con fuerte purificador de la DBD. En general, la CAR y PXR mostrar ω ratios superiores a través de los codones que los otros cuatro genes NR, pero el calculado ω ratios son todavía inferiores a 0,2 para todos los codones (Figura 4C, E].

Las comparaciones de la subfamilia NR1I genes

El NR1I subfamilia incluye VDR, PXR, y CAR. Alineaciones de la secuencia de determinados genes LBDs de esta subfamilia se presentan en la Figura 5. Aminoácidos identificados como directamente en la interacción con ligandos de alta resolución de estructuras cristalinas se indican en negrita. Como se desprende de la inspección de la Figura 5 y destacando la historia común de PXRs, CARs, y VDR, una serie de ortólogos aminoácidos están involucrados en ligando vinculantes en más de un receptor. Por ejemplo, la leucina-240 de la PXR humano interactúa directamente con el antibiótico rifampicina [37] y hyperforin (componente activo de las hierbas anti-depresivo hierba de San Juan) [38]; de residuos en la ortólogos humanos VDR (L227) interactúa directamente Con calcitriol análogos [39] mientras que en la misma posición del ratón CAR (L168) se une el plaguicida contaminante 1,4-bis [2 - (3,5-dichloropyridoxyl)] benceno (TCPOBOP) [40].

En una publicación anterior, los autores han determinado codón posiciones en la Xenopus laevis BXRs que muestran pruebas de selección positiva en la evolución de esta inusual linaje de PXRs 23; tales codones fueron identificados, y todos se encontraban en el LBD del BXRs [30 ]. El BXRs son notables en la PXRs por haber perdido la capacidad de ser activado (y presumiblemente de obligar a) estructuralmente diferentes ligandos. Además, estos receptores tienen un patrón de expresión tisular marcadamente distinto de los demás PXRs, que se encuentra en altos niveles en el tejido gonadal, pero no metabolismo de xenobióticos de órganos, como el hígado o los intestinos, [41 - 43], y se activan de manera eficaz sólo por benzoato de compuestos Que tienen un papel en el desarrollo de rana [41, 42, 44]. Curiosamente, el 9 de los 23 aminoácidos de residuos puestos en el BXR linajes que tienen pruebas de selección positiva son ortólogos o directamente adyacentes a los residuos que son ortólogos a los residuos humanos PXR demostrado que interactúan directamente con los ligandos SR12813, hyperforin, y / o rifampicina En cristalográficos de rayos X las estructuras de los humanos PXR (Figura 5); otros dos residuos son ortólogos ligando vinculante a los residuos humanos en el VDR y, también, en un caso, ligando vinculante a los residuos humanos en el CAR y el ratón también. La evidencia es coherente con la selección positiva en la evolución de la BXRs están dirigidas a alterar el LBD ligando específico, en gran parte por la orientación aminoácidos capaces de interactuar directamente con ligandos. Este ha sido, presumiblemente, un importante factor subyacente en la mucho más reducida ligando selectividad observado en el moderno BXRs.

El NR1I subfamilia miembros también difieren notablemente en la conservación de la ligando vinculante residuos a través de especies de vertebrados. La Figura 6 muestra de VDR, PXRs, CARs y cuántas especies diferentes de los humanos en el receptor de residuos de aminoácidos posiciones conocidas de interactuar directamente con los ligandos. VDR mostrar apretado conservación de los residuos ligando vinculante. Sólo 4 de 22 residuos de aminoácidos mostró ninguna variación en absoluto a través de las especies, que van desde jawless pescado (lamprea de mar), pez teleósteo, reptiles, ranas, aves y mamíferos (Figura 6A]. PXRs, por el contrario, muestran una amplia secuencia de aminoácidos en la divergencia ligando vinculante residuos con sólo 3 de 23 posiciones conservadas a través de los 13 vertebrados secuenciados PXRs actualmente; para el 9 de los 23 puestos, más de la mitad de los no-humanos tienen un amino PXRs De residuos de ácido diferente de la secuencia humana (Figura 6B]. CARs también muestran mayor divergencia en las posiciones ligando vinculante que humano VDR, pero no tan grande como la PXRs, si bien el análisis es limitado debido a la presencia de genes CAR sólo en mamíferos (Figura 6C].

Discusión

La búsqueda de genes que muestran pruebas de selección darwiniana positiva ha sido un importante foco de filogenética molecular [21, 22]. Los genes de la superfamilia NR nucleótidos generalmente muestran variación entre las especies compatibles con fuerte purificador de selección, en particular en el DBDs. En este estudio se aplicó el análisis filogenético de un método de máxima verosimilitud a todo el NR superfamilia en vertebrados para analizar los patrones de variación nucleotídica que pueden ser indicativos de selección positiva. Los resultados anteriores extender más limitado el análisis filogenético de los genes PXR y CAR [8, 29, 30, 58] y demuestran claramente que el PXR LBDs de la CAR y los genes han ω ratios elevadas en el extremo final de la superfamilia NR. Otros dos genes que tienen los mismos coeficientes de variación de ω son DAX-1 y SHP, dos rupias que carecen de una determinada DBD y LBD se clasifican como simple [12, 13]. Los elevados coeficientes de ω en el DAX-1 y SHP, en relación con otros genes NR, puede estar relacionada con la única presiones evolutivas estos dos genes cara como dominio singletons [8, 11].

Esta posibilidad de la firma de selección positiva en el PXR LBDs de la CAR y los genes está en consonancia con la función de PXR CAR y tóxicos como sensores de compuestos endógenos y exógenos que pueden variar entre especies [5, 6]. Por PXR y CAR, evolutivo de selección sería dirigida a perfeccionar ligando especificidad hacia los más importantes compuestos tóxicos (o clase de compuestos) para una determinada especie. PXR y CAR claramente difieren notablemente en la variación de nucleótidos de VDR, el otro miembro de la subfamilia NR1I; en términos de variación de nucleótidos, VDR comporta como otros rupias y no PXR o CAR. Los elevados coeficientes de ω PXR CAR y no son simplemente un resultado de sinónimos y no sinónimos sustituciones que se aumentó a la par. Como las comparaciones con dos genes dentro de los mamíferos [8], sinónimo de las tasas de sustituciones y PXR CAR genes a través de los vertebrados son promedio, en comparación con otras NR genes [30, 58]. La estimación de ω coeficientes de la codones de la CAR y de LBDs PXR genes son también superiores a las de la AHR gen, un no-NR que cualitativamente tiene funciones muy similares a los CAR y PXR, incluyendo la capacidad de upregulate la expresión de los genes CYP Implicados en la desintoxicación de xenobióticos [34].

Otro hallazgo fue que con la CAR ω coeficientes de la CAR DBD están en el extremo superior de la superfamilia NR. Esto puede ser un reflejo de la reciente divergencia de la CAR después de la duplicación de genes de un pre-PXR de genes de mamíferos [59]. Diversificación funcional con tasas más elevadas de no sinónimo de sinónimo sustituciones es común en un gen que se ha duplicado recientemente [60, 61]. Una vez que dos copias de un gen existen, uno de los dos genes es libre de diversificar función ventaja evolutiva a pesar de que los dos genes todavía puede compartir la superposición de funciones. La CAR y PXR DBDs muestran considerable reactividad cruzada entre sí en términos de interacción con la meta de genes de respuesta los elementos [62 - 67], que se extiende incluso a la de pollo PXR [68]. Esta reactividad cruzada pone de manifiesto las estrechas de la historia evolutiva y PXR CAR y puede indicar que fisiológicamente importante CAR proporciona redundancia de funciones importantes de PXR en mamíferos. (Tenga en cuenta que incluso PXR y VDR, que están más alejadas de la CAR y PXR, muestran un considerable solapamiento en la regulación de genes objetivo. VDR es capaz de upregulate expresión de las proteínas como desintoxicante CYP3A4 [53, 69, 70] mientras que recientemente se ha PXR Muestra de regular la expresión de las proteínas implicadas en el metabolismo de las moléculas relacionadas con calcitriol y [71, 72]]. La relativamente alta proporción de los no-sinónimo de sinónimo sustituciones de la CAR DBD (al menos en comparación con otros rupias) sugiere, sin embargo, que la CAR no es DBD evolutivamente "estáticas" y es de reconocer la diversificación de otros elementos vinculantes o por interactuar de modo distinto PXR que comparte con los elementos vinculantes.

Los análisis filogenéticos presentan aquí tienen algunas limitaciones. El número de secuencias disponibles para el análisis varía notablemente en toda la superfamilia NR. Para aquellos que tienen pocos genes de las secuencias disponibles, el análisis filogenético tendrá más poder limitado para detectar las pequeñas subpoblaciones de codones con elevados coeficientes de ω [22, 32, 33]. Por otro lado, el análisis de muy pocos genes corre el riesgo de aumento de falsos positivos [22, 31 - 33], lo que fue la razón de un mínimo de seis el número de genes de seis diferentes géneros se aplicó a la superfamilia de datos NR. Además, las dificultades en la alineación de secuencias son un problema potencial para algunos genes y obligado a eliminar algunos de los codones de análisis filogenético. Para el NR1I subfamilia, se trataba de una cuestión en particular con la H1-H3 insertar. Esta secuencia no fue analizado por el PXR genes VDR y cuando se aplica a todos los vertebrados. Curiosamente, la H1-H3 insertar PXR región de los genes dentro de los mamíferos fue identificado como una región en la que varios de los codones han estimado ω ratios mayor que uno. Teniendo en cuenta el papel de esta región en la expansión del ligando vinculante bolsillo de los humanos en relación con las demás PXR rupias [37, 38, 73], la variación de la H1-H3 insertar dentro de la región de mamíferos PXRs puede haber permitido evolutivamente ventajoso cambios en la especificidad ligando a través de Especies.

La figura 8 muestra una propuesta de filogenia de la subfamilia NR1I, teniendo en cuenta los datos de este estudio y otros. La historia evolutiva de PXR CAR y no se ha resuelto plenamente. Experimentales y análisis de la secuenciación del genoma proyectos en curso no han revelado un gen en el CAR pez teleósteo, con pez cebra, Fugu rubripes, Tetraodon nigroviridis y que poseen cada uno de un solo gen clasificado como PXR debido a la secuencia más estrecha y funcional similar a los genes de mamíferos PXR CAR genes [ 9, 44]. Del mismo modo, el pollo posee un solo PXR / CAR-como el gen (el "pollo del receptor X 'o RX de tórax), con la secuenciación del genoma de la gallina, amplios intentos de clonar un nuevo NR1I gen receptor, y la interferencia por ARN del gen junto con RX de tórax Funcional ensayos no muestran evidencia directa o indirecta de un nuevo miembro NR1I subfamilia de genes [59]. A diferencia de telost pescado PXRs, la RX de tórax tiene similitud con la igualdad de secuencia de mamíferos PXRs y CARs y comparte varias propiedades con CARs de mamíferos, incluidos los de alta actividad constitutiva en ensayos in vitro y la falta de secuencia en la H1-H3 insertar región, que conduzcan a la posibilidad RX de tórax que el gen es en realidad un gen CAR y no un gen PXR clasificados actualmente como [44, 48, 59]. La filogenia en la Figura 8 se clasifica la RX de tórax como PXR parsimoniosa y se presenta la explicación de que el pescado, las aves, y sus ancestros poseían un único gen que PXR duplicado en un mamífero ancestral o la validez de los mamíferos. Uno de los dos genes resultantes entonces divergentes a la CAR de genes [59]. Esta hipotética filogenia se fortalecerán o modificadas por el análisis de PXR / CAR genes adicionales en reptiles y mamíferos como marsupiales y monotremas.

Como se ha descrito anteriormente, la Xenopus laevis BXRs especialmente intrigante son un ejemplo de la amplia divergencia de un gen de otros vertebrados orthologs. El BXRs han alterado radicalmente ligando especificidad tisular y expresión en relación con las demás PXRs. El linaje BXR muestra evidencia sólida de la selección positiva [30], y en particular para los que ligando vinculante residuos, sobre la base de comparación para conocer ligando vinculante de los residuos humanos PXR, VDR humanos, de ratón CAR, CAR y humanos.

Una pregunta sin respuesta en la subfamilia es NR1I las propiedades funcionales del ancestro común más cercano a PXR y VDR. Pistas para esto puede ser revelado si PXR puede ser clonado y caracterizado desde un jawless peces como lampreas o hagfish o con la exploración de invertebrados ortholog (s) a estos receptores. Secuenciación del genoma de la chordate Amphioxus, uno de los parientes más cercanos de invertebrados a los vertebrados, y la lamprea de mar puede ser perspicaz en este sentido. Hay sugerencias de que PXR pez cebra puede tener un importante papel en el desarrollo temprano de pez cebra [74], que, de ser cierto, constituiría un vínculo funcional entre el pez cebra y la rana PXR BXRs [41, 43].

La presencia de una alta afinidad VDR en la lamprea de mar, un pez con una jawless no calcificado esqueleto cartilaginoso, sugiere que la regulación de los niveles de calcio y fosfato no es una función (o una función crítica) de la 'ancestrales' VDR [75 ]. Las concentraciones elevadas de calcio en el agua de mar significa que el mantenimiento de niveles adecuados de calcio en los tejidos y fluidos corporales es principalmente un problema para los terrestres o de agua dulce animales. En los mamíferos, VDR mediar una serie de funciones distintas de regulación de los niveles de calcio y fosfato, con una función esencial en el sistema inmunitario y la piel de desarrollo [76, 77]. Ciona intestinalis (squirt mar), un urochordate que es el pariente más cercano a los invertebrados Vertebrados para los que relativamente completa del genoma de la información está disponible, tiene un solo NR igualmente relacionadas con VDR / PXR / CAR y un Drosophila melanogaster NR [78]. Las propiedades de este gen siendo invertebrados no. Estos resultados ponen de relieve lo poco se sabe de la fisiología de los peces y chordate principios de los invertebrados y de la función de rupias en estos animales.

El marcado de la diversidad y PXR CAR LBDs a través de los vertebrados contrasta notoriamente con la resequencing estudios detallados de la persona humana y PXR CAR genes que ponen de manifiesto que no sinónimos mutaciones en el LBDs de estos genes son raras. Resequencing de 70 personas de tres diferentes grupos étnicos para el CAR de genes [58], y aproximadamente 100 personas de diferentes grupos étnicos para el PXR de genes [79] mostraron muy baja diversidad de nucleótidos y no nonsynonymous sustituciones en el gen de una de las LBD. Secuenciación de 253 sujetos japoneses reveló una sola no es sinónimo de sustitución en el CAR LBD [80]; el residuo identificados (valina-133) es adyacente a un ligando vinculante de residuos humanos CAR [81] CAR y el ratón [40]. Secuenciación de 205 sujetos japoneses encontraron dos no sinónimo PXR sustituciones (R381W y I403V) como único alelos en separar las personas [82]; estas mutaciones causadas modestas reducciones en transactivation de un reportero CYP3A4 basada en [83]. Otro PXR re-secuenciación estudio encontró un solo D163G sustitución en 1 / 74 africanos y 0 / 418 caucásicos y un solo A370T sustitución en 1 / 64 africanos y 0 / 312 caucásicos [84]. Además, la divergencia de nucleótidos de los humanos y los chimpancés CAR y PXR genes son inferiores a la media de otros genes en el genoma humano [29, 58, 85]. Esto sugiere que las funciones importantes de la LBDs de PXR y CAR, incluyendo ligando especificidad, no varían significativamente a través de los sectores de la población, y quizá no entre los chimpancés y los seres humanos también, pero que varían entre los seres humanos y otros mamíferos. Los estudios futuros deben identificar los ligandos que han dado forma a la variación de PXR CAR y entre especies.

Conclusión

NR genes en general, muestran un fuerte secuencia de conservación y pocas pruebas de selección positiva. Las principales excepciones son PXR y CAR, los genes que pueden se han adaptado a las diferencias entre las especies tóxicas en el complejo de la exposición. Los futuros estudios se dirige precisamente a la definición de la cruz-la variación en las especies estructurales CARs y PXRs, relativos a este evolutivamente las diferencias en la exposición a compuestos tóxicos.

Métodos
Análisis filogenético

NR secuencias de los genes fueron descargados de las bases de datos públicas del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez] y Ensembl http://www.ensembl.org. Listado completo de todos los genes, las especies y los números de acceso adicionales se proporcionan en el archivo 1: Los genes utilizados para el análisis filogenético. Secuencias fragmentarias faltan 10 o más codones se excluyeron del análisis. En las situaciones en que el apoyo funcional no se dispone de datos, fue confirmada por orthology BLAST recíproco búsquedas. Secuencias fueron alineadas con Clustal X. Regiones de secuencias que podrían no estar alineadas entre las especies fueron excluidos de los análisis. Esto es sobre todo un problema al intentar ajustar ciertos mamíferos no rupias con mamíferos rupias, un problema especialmente difícil para la PXRs [30, 44]. Estimación de d N / d S (ω) ratios se llevó a cabo por máxima verosimilitud utilizando un codón basada en el modelo de sustitución de PAML (Análisis filogenético por Máximo Riesgo) versión 3,13 [25, 26, 28]. La entrada a PAML es un treefile de la filogenia de las secuencias a ser estudiado y un archivo con secuencias alineados (ver archivo adicional 2: Secuencias utilizados para el análisis filogenético de PAML y archivo adicional 3: Resultados de PAML análisis y treefiles). La filogenia se basa en la conocida relaciones filogenéticas entre las especies que se han estudiado, determinado por un consenso de los datos morfológicos y moleculares [86]. El treefiles para todos los análisis se encuentran en archivo adicional 3: Resultados de PAML análisis y treefiles.

PAML determina ω estimaciones de los coeficientes para los modelos de diversa complejidad. Los modelos más comúnmente aplicados son los siguientes (los números de modelo PAML se muestran en parestheses; los' sitios' se refiere a los codones) [25, 26]: modelo M0 (null modelo con un solo ω relación entre todos los sitios), M3 ( " ; Discreto "modelo, con 2 o más categorías de los sitios con el ratio ω libre de variar para cada sitio en cualquier valor entre 0 y mayor que 1). M7 ( "β modelo", de diez categorías de sitios, con diez ω ratios de la gama 0-1 tomado de un discreto aproximado de la distribución de β), y M8 ( "plus β ω" modelo, de diez categorías de sitios Β de una distribución como en M7, más una categoría adicional de los sitios con un ratio ω que es libre de variar entre 0 y mayor que 1). PAML estimaciones de los coeficientes de ω las que se permite variar en virtud de estos modelos, así como la proporción de sitios (codones) con cada relación.

PAML de los modelos mencionados anteriormente, M0, M3 y M8 puede detectar selección positiva (es decir, ω> 1), aunque sería poco probable que se muestran M0 ω> 1 NR para cualquier gen dado la rareza de este tipo de alta ω ratios A través de todos los codones de todo un gen o genes de vertebrados de dominio [24]. Cada PAML modelo genera un log-riesgo, lo que indica lo bien que el modelo se ajusta a los datos de entrada. Algunos modelos son PAML "anidadas" dentro de unos a otros (por ejemplo, M0 dentro de M3, M7 dentro M8). En esos casos, el doble de la probabilidad log-diferencia entre los dos modelos se compara con una distribución X 2 con grados de libertad igual a la diferencia en los grados de libertad entre los dos modelos [M0 tiene 1 grados de libertad; M3 con dos categorías de Ω sitios (que se define en el software PAML como ncatG = 2) tiene 3 grados de libertad; M3, ncatG = 3, tiene 5 grados de libertad; M3, ncatG = 4, tiene 7 grados de libertad; M7 tiene 2 grados de libertad; M8 tiene 4 grados de libertad] [25, 26]. P valores de los sitios potencialmente positivo en virtud de selección se obtienen utilizando un enfoque bayesiano en PAML [87]. La precisión y el poder de PAML modelos aumenta con más secuencias de mayor longitud y secuencias [32, 33]. Los análisis se realizan sólo si al menos seis especies de seis géneros por separado estaban disponibles. Inferior a seis taxones, el poder de PAML para detectar positivos selección es limitada, y el riesgo de falsos positivos aumenta [22, 31 - 33]. PAML modelos más sencillos son preferibles a menos que un modelo más complejo de los datos se ajusta significativamente mejor. Los datos de un modelo más complejo PAML se presenta solamente para el doble de la probabilidad log-diferencia entre ese modelo y el más cercano modelo más simple (por ejemplo, M0 comparación con M3, ncatG = 2; M7 con M8) difiere significativamente con P <0,05 según A una distribución X 2.

Funcional de los ensayos de PXR y VDR

Ligando y la activación de PXRs VDR fue determinado por un luciferase funcional basado en el uso de métodos de ensayo descritos anteriormente [30]. En pocas palabras, HepG2 (hígado humano), las células que expresan establemente humanos de Na + taurocholate cotransportador (NTCP; SLC10A1) fueron utilizados [30]. Para experimentos con sulfatados sales biliares, humanos OATP (OATP; SLC21) fue co-transfectadas a 10 ng / y sales biliares para facilitar la absorción. Mouse VDR (IMAGEN clon 3.710.866) y pCMV-sport6 vectores fueron obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). El pez cebra RXR β cDNA clon (clon IMAGEN 5.410.111) se obtuvo de la ATCC (Manassus, VA, EE.UU.). Los vectores de expresión fueron los receptores de larga duración (es decir, que contiene tanto una DBD y LBD; humanos PXR, VDR humanos, de ratón VDR, la lamprea de mar VDR) o GAL4/PXR quimeras que contienen sólo el LBD del receptor PXR (BXR α, β BXR , Y el pez cebra PXR). Para los de larga duración vectores de expresión, el reportero fue plásmido CYP3A4-PXRE-Luc, una construcción que contiene un elemento promotor de la CYP3A4 (reconocido por PXR y VDR DBDs) de conducción luciferase expresión. Por la expresión GAL4/LBD construye, el reportero fue plásmido tk-UAS-Luc, que contiene DNA GAL4 vinculante elementos de conducción luciferase expresión. La lamprea de mar VDR cDNA fue co-transfectadas con el pez cebra RXR β (15 ng / así) para más robusta expresión [30, 75].

Cabe señalar que las diferencias entre las especies en el DBDs de diversos PXRs podrían tener efectos en la capacidad de un particular PXR para activar el CYP3A4 humanos basada en promotor de conducción luciferase expresión. Sin embargo, esto es poco probable que afectan a la farmacología de los diversos ligandos estudiados en este informe, en particular en lo ligando la activación de un determinado receptor se normalizó a un máximo de activador. El más alejadas PXRs a los humanos PXR, PXR pez cebra y la rana BXR α y β BXR, fueron estudiados con GAL4-LBD construcciones de la fusión, por lo que las cuestiones de la cooperación transfronteriza, especies diferencias en el DBD no afectan a los receptores en este estudio. Aunque la lamprea de mar es evolutivamente distantes de los mamíferos, a la escuela para pedir la lamprea de mar VDR vigorosamente activa el CYP3A4-PXRE-Luc reportera en respuesta al calcitriol.

La activación de los receptores por ligando se comparó con los receptores expuestos a las mismas condiciones sin ligando ( 'vehículo de control »). En general, dimetil sulfóxido (Sigma) se utilizó como vehículo y se ajustó a ser el 1% (v / v) en todos los pozos. Un control también se ejecuta con transfección de 'vacía' vector (es decir, que carecen de los receptores de cDNA) y reportero para el control de vectores para la activación del reportero por vectores endógenos del receptor (s). En experimentos con una variedad de activadores, la activación de los receptores endógenos no se observó. Los experimentos se realizaron por cuadruplicado y reiterados por un total de por lo menos tres veces. Curvas concentración-respuesta se ajustaron utilizando software Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA, EE.UU.). Los datos se presentan en todo como media ± error en la combinación de datos de múltiples experimentos, el grupo de varianza se calculó mediante la fórmula s = (combinada [(n 1 -1) s 1 2 + (n 2 -1) s 2 2 + .. . + (N k -1) k s 2] / [Nk])) -1 / 2, donde existen N total de puntos de datos entre los grupos k, con n repeticiones en el grupo i ª.

Cada PXR o VDR construir fue probado con compuestos previamente demostrado ser robusto activadores de los receptores [30]. Para facilitar más fiables las comparaciones entre especies, completa curvas concentración-respuesta de ligandos se determinó en la misma microplaca como determinación de la respuesta a un máximo de activador. Esto permite la determinación de la eficacia relativa, ε, que se define como la máxima respuesta a la prueba ligando dividido por la máxima respuesta a la referencia máxima activador (tenga en cuenta que puede superar ε 1). Compuestos con ε <1 fueron considerados' inactivos'. La máxima activadores y sus concentraciones para el PXRs y VDR estudiadas son las siguientes: PXR humanos - 10 μ M rifampicina; pez cebra PXR - 20 μ M 5 α-α androstan-3-ol; Xenopus laevis BXR α - 30 μ M n-butil-p-aminobenzoato; Xenopus laevis BXR β - 50 μ M n-propil-p-hidroxibenzoato; humano VDR - 1 μ M calcitriol, y la lamprea de mar VDR - 0,3 μ M calcitriol.

Scymnol sulfato se aisló de la bilis de la Manchada rayo de águila (Aetobatus narinari) y por la extracción de la columna de cromatografía Flash. Scymnol sulfato se deconjugated utilizando una solución de 2,2-dimethoxypropane: 1,0 N HCl, 7:1 v / v, y incubando 2 horas a 37 ° C, seguida de la adición de agua y la extracción en éter. Cobertura de la deconjugation y evaluación de la pureza se realizó por cromatografía en capa fina utilizando estándares conocidos. Otras sales biliares y esteroides fueron de Steraloids (Newport, RI, EE.UU.). Todos los demás productos químicos eran de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MDK concebido del estudio, llevado a cabo la mayoría de los experimentos, y redactó el manuscrito. KY contribuido al experimento, realizado alguno de la clonación y de la biología molecular, y generó la línea estable de células HepG2 utilizados para ensayos funcionales. CEE participó en el diseño del estudio y ayudó a editar el manuscrito. LRH aislado y purificado los peces cartilaginosos sales biliares y ayudó a editar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Los genes utilizados para el análisis filogenético
Archivo de Excel que contiene los números de la adhesión de todos los archivos utilizados en el análisis filogenético.
Archivo Adicional 2
Secuencias utilizados para el análisis filogenético de PAML
Fichero de texto completo, de larga duración las secuencias de nucleótidos de todos los genes utilizados en el análisis de PAML. El número de nucleótidos correspondiente a la DBD y LBD también se indican.
Archivo Adicional 3
Resultados de PAML análisis y treefiles
Archivo de Excel que contenga un resumen de los datos para todas las PAML análisis. El registro de probabilidad para cada análisis se entrega junto con el resumen de los parámetros más relevantes. Los métodos estadísticos para la comparación de modelos anidados se describen en Material y Métodos. Además, la filogenética treefile para cada análisis también se incluye.
Agradecimientos

Damos las gracias a Ana Di Rienzo (Universidad de Chicago, Departamento de Genética Humana) MDK por acoger en su laboratorio y útil para los debates. MDK también reconoce con gratitud la oferta de plásmidos por Kliewer SA, JT Moore, LB y Moore (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, Carolina del Norte) y la oferta de la lamprea de mar VDR clon por Whitfield GK (Universidad de la Facultad de Medicina de Arizona, Tucson, AZ).

Este trabajo fue apoyado por un sacerdote Robert adjudicación de becas a MDK CEE recibió el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud de Donaciones GM60346 y P40 CA21765 Centro del Cáncer de Apoyo a la concesión, por el Instituto Nacional de Salud / Instituto Nacional de Ciencias Médicas Farmacogenética General de la Red de Investigación y Base de Datos (U01 GM61374, http://pharmgkb.org] bajo concesión U01 GM61393, sirio libanesa y estadounidense Associated Charities (ALSAC). LRH con el apoyo de fondos de la Sociedad Zoológica de San Diego, CA, EE.UU..