Nuclear Receptor, 2005; 3: 3-3 (más artículos en esta revista)

La expresión de genes de perfiles de los posibles-peroxisome proliferador activado del receptor (PPAR) objetivo genes humanos hepatoblastoma en líneas celulares que expresan diferentes inducibly PPAR isoformas

BioMed Central
Keisuke Tachibana (nya@phs.osaka-u.ac.jp) [1], Yumi Kobayashi (doi@phs.osaka-u.ac.jp) [1], Toshiya Tanaka (tanaka@med.rcast.u-tokyo . Ac.jp) [2], Masayuki Tagami (doi@phs.osaka-u.ac.jp) [1], Akira Sugiyama (sakira-tky@umin.ac.jp) [2], Tatsuya Katayama (doi @ Phs.osaka-u.ac.jp) [1], Chihiro Ueda (doi@phs.osaka-u.ac.jp) [1], Daisuke Yamasaki (yama045d@phs.osaka-u.ac.jp) [1 ], Kenji Ishimoto (kenji@phs.osaka-u.ac.jp) [1], Mikako Sumitomo (mikako-s@phs.osaka-u.ac.jp) [1], Yasutoshi Uchiyama (yuchiyama@ppmx.com ) [2], Takahide Kohro (tkohro-tky@umin.ac.jp) [2], Juro Sakai (jmsakai-tky@umin.ac.jp) [2], Takao Hamakubo (hamakubo@ns.med.rcast. U-tokyo.ac.jp) [2], Tatsuhiko Kodama (kodama@lsbm.org) [2], Takefumi Doi (doi@phs.osaka-u.ac.jp) [1]
[1] Escuela Superior de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Osaka, Osaka, Japón
[2] Laboratorio de Sistema de la biología y la medicina, el Centro de Investigación Avanzada para la Ciencia y la Tecnología, la Universidad de Tokio, Tokio, Japón
[3] Perseo Proteómica Inc, Tokio, Japón
[4] Escuela de Estudios Superiores de Medicina de la Universidad de Osaka, Osaka, Japón

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Resumen
Antecedentes

Peroxisome los receptores activados por el proliferador (PPARs) son activados por ligando y comúnmente factores de transcripción desempeñan un papel importante en la regulación de la homeostasis de los lípidos. PPARs humano para identificar los genes de respuesta-, que estableció la tetraciclina regulado humanos hepatoblastoma líneas de células que pueden ser inducidas a expresar cada PPAR humanos investigados y perfiles de la expresión genética de estas células.

Resultados

La expresión de un gen introducido PPAR se investigó el uso de varias concentraciones de doxiciclina en la cultura de los medios de comunicación. Hemos encontrado que la expresión de un subtipo PPAR fue estrictamente controlada por la concentración de la doxiciclina en estas líneas celulares establecidas. DNA microarray analiza el uso de estas líneas celulares se realizaron con o sin la adición de cada subtipo ligando y proporcionó información muy importante sobre el PPAR objetivo genes implicados en el metabolismo lipídico, el transporte, el almacenamiento y otras actividades. Curiosamente, se señaló que, si bien ligando activado PPAR-δ la expresión génica inducida por objetivo, unliganded PPAR δ reprimidos estos genes. El tiempo real de RT-PCR se utilizó para verificar la alteración de la expresión de genes seleccionados por PPARs y encontramos que estos genes son inducidos a expresar en el mismo modelo que detectó en el análisis de microarrays. Además, analizó la región 5'-acompañamiento de la diferenciación adiposo humano relacionados con la proteína (adrp) gen que respondió a todos los subtipos de PPARs. De los análisis detallados de los ensayos de reportero, la EMSAs, y ensayos de ChIP, se determinó la PPRE funcional de los genes humanos adrp.

Conclusión

Los resultados sugieren que estas líneas celulares son herramientas importantes utilizadas para identificar los PPARs humanos-genes de respuesta.

Antecedentes

El peroxisome proliferador-receptores activados (PPARs) son activados por ligando factores de transcripción que pertenecen a la superfamilia de receptores hormonales nucleares [1]. Tres subtipos, PPAR α, β PPAR / δ y PPAR γ, y se han identificado estos subtipos con un alto grado de conservación de la secuencia de cada subtipo en diversas especies, se han caracterizado. El ADN vinculante dominios de los tres subtipos son idénticos el 80%, mientras que su ligando vinculante dominios exhiben un menor grado (aprox. 65%) de la identidad. En consonancia con esta relativamente alta divergencia entre los subtipos específicos de los dominios ligando vinculante, la activación diferencial de PPARs por compuestos endógenos y exógenos puede dar cuenta de la actividad biológica específica de los tres subtipos de PPAR [2, 3].

PPAR α se expresa en el hígado, riñón, corazón y músculo en el que se regula la homeostasis energética. PPAR α activa el catabolismo de ácidos grasos, estimula la gluconeogénesis y la síntesis de cetonas en cuerpo y está implicado en el control de las lipoproteínas de montaje [4]. Aunque PPAR α es así caracterizado, las diferencias funcionales de PPAR α derivados de las especies no están claras. Por ejemplo, la sostenida activación PPAR α tiene consecuencias cancerígenas en el hígado de los roedores, pero a largo plazo el uso de activadores PPAR α en datos epidemiológicos, se ha demostrado que los efectos similares tienen poca probabilidad de ocurrir en los seres humanos [5, 6]. Δ PPAR se expresa doquier, y está implicado en la oxidación de ácidos grasos, en la diferenciación de los queratinocitos y la cicatrización de heridas y en la mediación lipoproteína de muy baja densidad de señalización de los macrófagos [7 - 11]. Sin embargo, la función de PPAR δ es menos entendido que PPAR α y γ. Existen dos isoformas de PPAR γ, PPAR γ1 y γ2. PPAR γ2, que es generado por splicing alternativo, contiene un adicional de 28 aminoácidos en el extremo N-terminal en relación con PPAR γ1. PPAR γ3 es un empalme de la variante de PPAR γ1 y da lugar a la misma proteína. PPAR γ2 se expresa exclusivamente en el tejido adiposo y tiene un papel fundamental en la diferenciación de los adipocitos, el almacenamiento de lípidos en el tejido adiposo blanco y la disipación de la energía en el tejido adiposo pardo [12, 13]. Por otra parte, PPAR γ1 se expresa en el hígado y otros tejidos, y la expresión de PPAR γ hepática se incrementa en algunos obesos y diabéticos modelo de ratones [14 - 17]. PPAR γ participa en el metabolismo de la glucosa a través de la mejora de la sensibilidad a la insulina, pero su función no está bien definida.

Todos los PPARs unirse a una repetición directa de dos hexanucleotides, espaciadas por uno o dos nucleótidos (DR1 el motivo o DR2) como heterodimers con el receptor retinoide X (RXR), y activar varios genes diana [18 - 20]. Estos elementos peroxisome proliferador de respuesta (PPREs) se encuentran en los diferentes genes que están implicados en el metabolismo lipídico y la homeostasis energética, incluyendo el almacenamiento o el catabolismo de lípidos, ácidos grasos y el transporte, la captación intracelular y vinculante [21].

Uno de los enfoques para la investigación de los genes de PPARs objetivo es construir líneas estables de células que pueden ser inducidas a expresar PPARs. El tet-off es un sistema bien establecido sistema de la expresión de genes inducibles. En este sistema, la transcripción está encendido o apagado en respuesta a la doxiciclina (Dox, un derivado de la tetraciclina), en un plano estrictamente dependiente de la dosis. Por lo tanto, los antecedentes o filtraciones expresión en la ausencia de la inducción es extremadamente bajo. El tet-off sistema nos permite comparar la misma línea celular antes y después de la inducción del gen de interés. Anteriormente, hemos establecido los humanos hepatoblastoma líneas de células (células HepG2), que fueron inducidos a expresar estrictamente la hepatitis C proteínas no estructurales mediante la eliminación de Dox de los medios de comunicación, y se caracterizaron los cambios en la expresión mRNA perfil a través de análisis de microarray de ADN [22].

En el presente estudio, para determinar humanos PPARs-genes de respuesta en la línea de células del hígado, establecimos firmemente tet-regulables células HepG2, que pueden ser inducidas a expresar cada PPAR humanos. Hemos demostrado que los humanos PPARs son importantes reguladores de la homeostasis de los lípidos en estas líneas celulares utilizando microarrays de ADN y en tiempo real de RT-PCR tecnologías. Análisis posteriores revelaron que todos los PPARs adiposo diferenciación inducida por humanos relacionados con la proteína (adrp) la expresión de genes a través de la misma PPRE de la ADRP promotor, mientras que unliganded PPAR δ reprimidos este gen. Nuestros resultados implican que estas líneas celulares son herramientas importantes, que pueden ser utilizados para identificar al humano PPARs-genes de respuesta.

Resultados
Establecimiento de las células HepG2 que pueden ser inducidas a expresar PPARs

PPARs humano para identificar los genes de respuesta-, que establece cada línea celular que expresa uno de los subtipos de PPAR (α, β / δ, γ1 o γ2) utilizando el sistema de tet-regulado. Anteriormente, hemos establecido firmemente la tet-regulables clon de células HepG2 (HY-Toff), que fue transfectadas con el vector pTet-off, y que esto tuvo un gran clon de inducción / represión tasa [22]. El tet-off regulables HY-Toff células fueron transfectadas con el pBabepuro (por puromycin resistencia) y pBI-EGFP vector abrigo a los humanos cDNA para PPAR α, δ PPAR, PPAR γ1 o PPAR γ2. Hemos elegido puromycin-clones resistentes. Entre estos clones, hemos elegido la que responda estrictamente líneas celulares (HepG2-tet-hPPAR fuera de las células) a la concentración de Dox. Estas líneas celulares fueron cultivadas en presencia de Dox a 0, 0,01, 0,1 o 1000 ng / ml para 5 días, y encontramos que PPARs expresión en estas líneas celulares se indujo en una forma dependiente de la dosis (Figura 1A-D]. Luego examinó el tiempo de cada experimento PPAR expresión después de la eliminación de Dox. Los resultados mostraron que tanto el ARNm (Figura 2A-D] y proteína (Figura 2E-H] de cada uno de los niveles de PPAR se incrementaron después de la eliminación de Dox del medio de cultivo. En estas condiciones, la proliferación de las células en estas líneas celulares no se vio afectada hasta 7 días después de la eliminación de Dox. Sobre la base de estos resultados, se decidió que la expresión de PPAR en cada una el 5 º día es más apropiado para los análisis, tales como la determinación de los genes diana de cada subtipo PPAR.

Los cambios en los perfiles de expresión de mRNA de la inducción de cada subtipo PPAR con los ligandos PPAR

Para caracterizar la regulación de la expresión génica de cada subtipo PPAR, se realizó el análisis de microarray de oligonucleótidos. HepG2-tet-off-hPPAR células fueron cultivadas en la presencia o ausencia de Dox durante 5 días, y luego tratados con el PPAR ligandos (100 μ M de ácido fenofibric PPAR α, 100 nM GW501516 para PPAR δ o 10 μ M ciglitizone para PPAR γ) o vehículo para 24 h. Total RNA de muestras se han obtenido de estas células, y el análisis de microarray de oligonucleótidos se realizó a través de Affymetrix HG-U133A arrays que contienen> 22000 sonda fija.

PPARs humano para identificar los genes de respuesta-, analizamos los genes inducida por ligando-activado PPARs. Los criterios de selección de genes que se describen en la sección Métodos. Sobre la base de estos criterios, 29, 21, 60 y 107 genes estaban reguladas hasta por ligando activado PPAR-α, δ PPAR, PPAR γ1 y PPAR γ2, respectivamente. Como se muestra en el cuadro 1 y la archivo adicional 1, cada PPAR afecta a los niveles de expresión de varios genes implicados en el metabolismo lipídico, la homeostasis de la glucosa, etc PPAR α tiende a inducir la expresión de un número de genes implicados en la β-oxidación de los ácidos grasos Por las mitocondrias, peroxisomal la oxidación de ácidos grasos, antioxidantes y ketogenesis. La mayoría de los genes que fueron inducidos por PPAR δ fueron similares a los expuestos por PPAR α. Hemos observado que induce la expresión de PPAR δ aumento de la expresión de la presencia del ligando, mientras que unliganded PPAR δ reprimida la expresión de genes en lugar de su meta. Por otra parte, PPAR γ tiende a inducir la expresión de varios genes implicados en la gluconeogénesis, lípidos almacenamiento, el transporte y metabolismo. Además, PPAR γ es probable que inducen varios genes implicados en la angiogénesis, citoesqueleto organización, la modificación de proteínas, la regulación de la transcripción, transducción de señales, etc

La verificación de los perfiles de expresión génica con el análisis de PCR cuantitativa

La expresión de un subconjunto de los genes en la respuesta al tratamiento con ligandos PPAR Se caracterizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real los análisis. Total de ARN de las muestras se prepararon HepG2-tet-off-hPPAR células, que se cultivaron en la presencia o ausencia de Dox por 5 días, y posteriormente tratados con el PPAR ligandos (100 μ M fenofibric ácido, 100 nM GW501516 o 10 μ M de ciglitizone PPAR α, δ PPAR y PPAR γ, respectivamente) o el vehículo de 0, 8, 24, 48 ó 72 h. Varios genes PPAR-sensible (ADRP, 3-hidroxi-3-methylglutaryl-coenzima A sintetasa 2 (mitocondrial) (HMGCS2), hidroxiacil-Coenzima A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzyme A thiolase / enoyl-Coenzima A hydratase (trifuncionales proteína) , La subunidad α (HADHA), phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PEPCK), acyl-Coenzima A deshidrogenasa, C-4 a C-12 recto cadena (MCAD), angiopoietin-como la proteína 4 (ANGPTL4), la proteína de unión de ácidos grasos 1, hígado ( L-FABP)) fueron hasta regulados por la expresión de PPAR α y PPAR γ (Figura 3]. Por otra parte, sólo ligando PPAR-δ activado induce la expresión de estos genes, pero unliganded PPAR δ reprimidos ellos, de acuerdo con análisis de microarrays (Figura 3B y Tabla 1].

Aunque hasta ahora la C-terminal y la vinculación de la modulación de la proteína / dominio PDZ que contiene 1 (CLAMP/PDZK1) ARNm no se ha reportado como un objetivo para PPARs, se observó que los PPARs CLAMP/PDZK1 ARNm inducida por análisis de microarrays (Tabla 1]. Nosotros, por lo tanto, verificar la expresión de mRNA CLAMP/PDZK1 uso de PCR cuantitativa en tiempo real de análisis. Un resultado similar se observó en el patrón de expresión de mRNA CLAMP/PDZK1 (Figura 3].

Aunque todos los subtipos de PPARs podría inducir la expresión de estos genes, PPAR α fue más eficaz que otros subtipos en la PCR en tiempo real los análisis (Figura 3].

PPARs modular ADRP promotor de la actividad humana a través de un PPRE

Para determinar si uno de estos genes está regulada por PPARs directamente, hemos realizado experimentos de transfección transitoria con el promotor ADRP humanos. Se ha informado de que el ratón ADRP contiene un promotor funcional PPRE [11]. El examen de la correspondiente región de los genes humanos adrp indicó que las características esenciales de este elemento es probable que se conserve, y nos encontramos con que la figura humana ADRP promotor PPRE un potencial en las posiciones -2361 a -2345 (Figura 4A].

Para analizar si este sitio puede ser regulada por PPARs, ya sea el tipo salvaje de 4 kb fragmento de la ADRP humanos promotor (hADRP-4K), la supresión promotor (hADRP-d1) cuyo potencial PPRE se suprime o mutación promotor (hADRP-mut) Cuyo potencial es PPRE mutado, fue clonado en frente del reportero pGL3-luciferase genes para construir reportero plásmidos (Figura 4B]. Estamos co-transfectadas o bien la expresión PPAR plásmido (pcDNA3-hPPAR α, pcDNA3-δ hPPAR, pcDNA3-hPPAR γ1 o pcDNA3-hPPAR γ2) o el vector plásmido (pcDNA3) como control junto con cada reportero plásmido en las células HepG2, y posteriormente estas células incubadas Con o sin ligandos (100 μ M fenofibric ácido, 100 nM GW501516 o 10 μ M ciglitizone para PPAR α, δ PPAR y PPAR γ, respectivamente) durante 24 h. Ligando-activado PPARs inducida por la actividad promotora de la salvaje tipo 2 a 5 veces mayor que la de control (no hay expresión sin ligando PPAR) (Figura 4C-F]. Curiosamente, la expresión de PPAR δ sin ligando disminuido el tipo salvaje ADRP reportero de la expresión de genes de alrededor del 60% del control en las células HepG2 (Figura 4D]. No hemos detectar esta observación cuando se eliminan o mutan PPRE reportero plásmido se utilizó. Estos datos indican que este PPRE en la ADRP promotor es un elemento cis-actuando por la que modulan PPARs ADRP promotor de la actividad humana.

Para determinar si PPARs humanos / RXR heterodimers α enlazar este PPRE en la ADRP promotor, EMSAs se realizaron con esta respuesta como un elemento radiomarcado sonda (Figura 5A-D]. EMSAs reveló que todos los subtipos de PPAR podría obligar a la PPRE de la ADRP promotor de la presencia de RXR α (privadas de flecha sobre carriles 2 a 4). Además, estos complejos se supershifted por anticuerpos anti-PPAR (abierto de flecha en el carril 5). Esta formación de los complejos se compitió por el aumento de las cantidades (10 - y 100 veces superiores) de la etiqueta de la libre competencia (ADRP) y rata acyl CoA oxidasa (ACO) PPRE fragmentos, pero no por el mutado PPRE (ADRPmut) sondas (a 6 carriles 11). Además, ningún complejo ADN-proteína se observó al utilizar los mutantes PPRE (ADRPmut) sonda (carril 12). En conjunto, estos datos demuestran que todos los PPARs se unen al mismo PPRE sitio en la posición -2361 a -2345, y modulan ADRP promotor de la actividad humana.

Para confirmar que los PPARs / RXR heterodimers α obligar a la PPRE en la ADRP promotor in vivo, hemos realizado immunoprecipitation cromatina (ChIP) ensayos usando un anti-PPAR α, PPAR anti-δ, anti-PPAR γ, o anti-RXR α anticuerpos. HepG2-tet-off-hPPAR células fueron cultivadas en ausencia de Dox por 5 días, y posteriormente fueron tratados con el PPAR ligandos (100 μ M fenofibric ácido, 100 nM GW501516 o 10 μ M troglitazone para PPAR α, δ PPAR y PPAR γ, respectivamente) para 8 h, y posteriormente utilizado para los ensayos de ChIP. PPARs / RXR heterodimers α obligado a la PPRE en la ADRP promotor in vivo (Figura 6].

Discusión

En el presente estudio, con el fin de identificar humanos PPARs-genes de respuesta en el hígado, hemos establecido firmemente tet-regulables humanos hepatoblastoma líneas de células que pueden ser inducidas a expresar cada PPAR humano (HepG2-tet-hPPAR fuera de las células). DNA microarray y en tiempo real de RT-PCR analiza el uso de estas líneas celulares estables indican que los PPARs activar la expresión de genes implicados en el metabolismo lipídico, la homeostasis de la glucosa, y otras actividades (Tabla 1 y Figura 3]. La proliferación de las células de estas líneas celulares no se vio afectada hasta 7 días después de la eliminación de Dox. Sin embargo, se requiere más investigación para definir la influencia de la expresión de PPARs en la proliferación de estas líneas celulares.

Hemos identificado una serie de genes que son esenciales para muchos aspectos del metabolismo de los lípidos y carbohidratos, incluyendo el transporte intracelular de ácidos grasos, ácido graso mitocondrial β-oxidación, y por ketogenesis PPAR α (Tabla 1]. De hecho, PPAR α regula la expresión de genes que codifican para enzimas que participan en la proliferación peroxisomal y la oxidación de ácidos grasos en las mitocondrias peroxisomes y [2]. Además, PPREs están presentes en la región promotora o intronic la secuencia de estos genes diana [4]. Sin embargo, nuestros resultados muestran que el PPAR α y de otros subtipos de PPAR inducir la expresión de estos genes. De hecho, el hígado PPAR γ regula la expresión de genes involucrados en la lipogénesis, ácidos grasos de transporte, el almacenamiento y la oxidación utilizando tanto los ratones de tipo salvaje y adiposo de ratones deficientes [23]. Otros informes también mostraron que PPAR δ inducida por la oxidación de ácidos grasos mediante la regulación de genes implicados en el transporte de ácidos grasos, β-oxidación, y la respiración mitocondrial en diversos tejidos [7 - 9]. Estos informes apoyo de nuestros resultados cual cada subtipo PPAR induce la oxidación de ácidos grasos en el hepatoblastoma líneas celulares. En la PCR en tiempo real los análisis PPAR α fue más eficaz que otros subtipos en el hepatoblastoma líneas celulares, a pesar de todos los subtipos podría inducir la expresión de estos genes (Figura 3]. Por lo tanto, suponemos que PPAR α desempeña un papel importante en el hígado, sin embargo, el mecanismo de este efecto sigue siendo incierto.

Células de mamífero utilizar la glucosa como una importante fuente de energía, y el origen de la producción de glucosa hepática pasa de la glucogenolisis principalmente a la gluconeogénesis prolonga el ayuno como para mantener los niveles de glucosa en la sangre. Los principales precursores de la gluconeogénesis hepática son lactato, piruvato, glicerol y alanina, que se convierten en glucosa a través de una serie de reacciones en el citosol y las mitocondrias. PPAR α desempeña un papel fundamental en la gestión de los almacenes de la energía durante el ayuno [2]. De hecho, PPAR-α nula ratones, en ayunas de 24 h, la exposición de la hipoglucemia grave [24, 25]. Recientemente, Patsouris et al. PPAR α demostrado que estimula la expresión de un conjunto de genes involucrados en la gluconeogénesis hepática de glicerol [26]. En el presente estudio, glicerol quinasa y glicerol transportista aquaporin 3 fueron hasta reguladas por la liganded PPARs. Sorprendentemente, un hallazgo que fue hasta la PEPCK fue reglamentado por PPARs en estas líneas celulares. PEPCK cataliza la etapa limitante de la tasa de gluconeogénesis hepática. Camino et al. Zucker mostraron que cuando las ratas diabéticas grasos fueron tratados con agonistas de PPAR γ, PEPCK expresión se redujo en el hígado, y sugirió que los agonistas PPAR γ disminución de la gluconeogénesis [27]. Aunque no podemos explicar plenamente esta incoherencia, hay varios informes, que apoyan nuestros resultados. Un estudio in vivo demostró que los niveles de mRNA PEPCK se encuentra elevado en el hígado de dexametasona (DEX) tratados PPAR-α + / + ratones, y no tratados con DEX PPAR-α / - ratones, y que se incrementa cuando PEPCK hepática PPAR α expresión es reconstituido en DEX Tratados PPAR-α / - LDLR-/ - ratones. Además, la combinación de la DEX y potente ligando PPAR α Wy14, 643 aumentó la expresión de PEPCK en hepatocitos humanos [28]. Sin embargo, la razón de esta diferencia de la inducción sigue siendo desconocido.

CLAMP, un período de cuatro PDZ-dominio-que contiene proteína también llamada PDZK1 [29], fue identificado como el receptor scavenger clase B tipo I (SR-BI), proteína asociada a la membrana de hígado de rata, extractos [30]. CLAMP/PDZK1 regula el estable SR-BI expresión de la proteína por un mecanismo post-transcripcional [31]. La expresión hepática de SR-BI desempeña un papel fundamental en el metabolismo de las lipoproteínas, principalmente debido a su capacidad de mediar selectivo lipoproteínas de alta densidad (HDL), la absorción de colesterol [32, 33]. HDL elimina el colesterol de los tejidos periféricos y, a continuación, transfiere al hígado. CLAMP/PDZK1 puede modular el transporte intracelular y el metabolismo de los ésteres cholesteryl tomado de HDL. Aunque hasta ahora, clamp/pdzk1 no ha sido reportado como consecuencia directa de genes PPAR objetivo, observamos que CLAMP/PDZK1 mRNA fue inducida por PPARs establecido en la líneas de células (Tabla 1 y Figura 3]. Estos datos sugieren que es un objetivo CLAMP/PDZK1 gen de PPARs. En el caso de los seres humanos, PPRE existe en la CLAMP/PDZK1 promotor y PPARs puede obligar directamente a esta región (datos no publicados). Por lo tanto, activadores PPAR pueden desempeñar un papel en la regulación del metabolismo de HDL. Sin embargo, se requieren nuevas investigaciones para definir los mecanismos moleculares subyacentes a la PPAR-mediado el metabolismo de HDL.

Nuestro análisis de microarrays se indica que hay muchos genes que son inducidos por todos los subtipos de PPAR (Tabla 1, de ficheros adicionales 1]. Sin embargo, PPAR y PPAR α δ tienden a inducir la expresión de un número de genes implicados en la β-oxidación de los ácidos grasos por la mitocondria y la oxidación de ácidos grasos peroxisomal, y PPAR γ tiende a inducir la expresión de varios genes implicados en la gluconeogénesis, lípidos almacenamiento, el transporte Y el metabolismo. Curiosamente, también se observó que los genes implicados en la angiogénesis, citoesqueleto organización, la transducción de señales, proteínas modificación y regulación de la transcripción son regulados hasta en nuestra HepG2-tet-off-γ hPPAR líneas celulares. De hecho, hay varios informes de que PPAR γ ligandos modulan la angiogénesis [34]. Más investigación es necesaria para certificar el subtipo función específica de PPARs.

En el presente estudio se observó también que ligando activado PPAR-δ la expresión génica inducida por objetivo, sin embargo, unliganded PPAR δ reprimidos estos genes en las líneas celulares establecidas (Tabla 1, Figuras 3, 4]. Se ha informado de que unliganded PPAR δ une a PPRE y reclutas corepressors, como un mediador para silenciar retinoide y receptor de la hormona tiroidea (SMRT), nuclear receptor corepressor (NCoR), etc Por otro lado, liganded PPAR δ se cree que la liberación corepressor Y forma un complejo con coactivators [35, 36]. Desde este punto de vista, estas líneas celulares establecidas tienen una aplicación potencial para proporcionar un alto rendimiento de cribado para detectar el PPAR δ ligandos (véase más adelante).

Para investigar más a fondo la regulación de la expresión génica por objetivo PPARs, hemos analizado los humanos ADRP promotor en detalle. ADRP, expresó doquier, es una proteína que cubre gotitas de lípidos [37]. El ratón adrp gen exhibe un PPRE entre -2004 y -1992 pb que se une PPARs / RXR heterodimers [11]. La secuencia de la respuesta correspondiente en el elemento humano de genes entre -2361 y -2345 bp es muy similar a la del ratón PPRE (Figura 4A]. Se realizó EMSAs con este elemento y de todos los subtipos de PPAR vinculados a la misma PPRE sitio de la ADRP promotor (Figura 5]. Además, este sitio humanos PPRE confiere transactivation por PPARs a un reportero luciferase genes, y las mutaciones que perturban el orden vinculante de PPARs / RXR sobre este PPRE abolir transactivation (Figura 4]. Durante la preparación de este manuscrito, se informó de que la ADRP PPRE fue el sitio de unión funcional PPAR y puede ser activado por humanos PPAR α y δ [38]. En el presente estudio, que mostró el mismo resultado y que PPAR γ1 y γ2 también puede obligar a PPRE y regular la expresión de los genes humanos adrp. Además, fuimos los primeros en confirmar que PPARs / RXR heterodimers α obligar a la PPRE en la ADRP promotor in vivo mediante ensayos de ChIP (Figura 6].

PPARs están vinculados a trastornos metabólicos y, por lo tanto, son objetivos interesantes farmacéutica. Entre los ligandos sintéticos que activan estos receptores, los fibratos hipolipemiantes son compuestos que activan PPAR α. El tiazolidinadionas, que activan selectivamente PPAR γ, hipoglucemiantes son moléculas que se utilizan para tratar la diabetes del tipo II. Recientemente, nosotros y otros grupos informó de que los agonistas PPAR δ podría forma efectiva los medicamentos para la obesidad, la diabetes y las enfermedades cardiovasculares [7 - 9, 39, 40]. Desde este punto de vista, estas líneas celulares se han establecido una posible aplicación en los diversos ensayos de alto rendimiento. Por ejemplo, el gen reportero de ensayo utilizando el plásmido reportero que contiene la ADRP promotor proporcionará un útil sistema de detección de ligandos de PPAR δ como posibles candidatos de drogas en el HepG2-tet-off-δ hPPAR línea celular [41].

Conclusión

En conclusión, hemos establecido firmemente tet-regulables humanos hepatoblastoma líneas de células que pueden ser inducidas a expresar cada PPAR humanos. Estas líneas celulares presentó pruebas de que PPARs humanos son importantes reguladores de la homeostasis de los lípidos y glicerol y nuevas percepciones acerca de los genes candidatos objetivo de PPARs. Por lo tanto, estas líneas celulares son herramientas poderosas para el análisis de la función de los PPARs.

Métodos
Materiales

Fenofibric ácido y GW501516 fueron sintetizados como se describe anteriormente [7]. Ciglitizone fue comprado a Sigma. Troglitazone se adquirió de Productos Químicos de las Islas Caimán.

Constructores de plásmido

Construcción de pcDNA3-hPPAR α, pcDNA3-δ hPPAR, pcDNA3-hPPAR γ1 y pcDNA3-hPPAR γ2 expresión plásmidos fueron descritas anteriormente [42]. PPARs fragmentos humanos fueron extirpados de pcDNA3-hPPAR vectores. PBI-EGFP (Clontech) fue digerido con PvuII PvuII, y ligated con el PPAR fragmento (denominado pBI-EGFP-hPPAR).

Para generar humanos ADRP promotor-reportero plásmidos, que contienen humanos ADRP promotor -2981 a +1066 bp (hADRP-4K) y la supresión promotor contiene -2345 a +1066 bp (hADRP-d1) se obtuvieron por medio de la PCR con la artificial bacteriano Cromosoma (BAC) clonar un plásmido (BACPAC centro de recursos en el Children's Hospital Oakland Research Institute) utilizando una cartilla con interés 5'-GGTACCTATCCCTGGTGCCAAAAAGGTTGGGGA GGTACCTATCCCTGGTGCCAAAAAGGTTGGGGA-3 '(incluido un KpnI KpnI sitio, subrayado) para hADRP-4K o un delantero primer 5'-GGTACCGAGAGTCTTCTGATGCAAAGTAAGAGG GGTACCGAGAGTCTTCTGATGCAAAGTAAGAGG-3 '(incluido un KpnI KpnI sitio, subrayado) para hADRP-d1 y un primer revertir 5'-AGATCTTTTTCTTCCTGGAGAAAGAAATCTGCAGAAAAGAG AGATCTTTTTCTTCCTGGAGAAAGAAATCTGCAGAAAAGAG-3' (incluido un BglII BglII sitio, subrayado). Cada promotor fue clonado en el KpnI KpnI-BglII BglII sitios de un vector pGL3-Básica (Promega). Un punto de mutación fue introducido en la ADRP promotor de la metodología por PCR. Para generar un punto de mutación construir (pGL3-hADRP-mut), un fragmento de 101 pb mutante se generó partir de la cartilla (5'-GCAAAAAGAAGCTTGCTCAG-3 ') e invertir primer (5'-GACTCTCGCCCTTaagCtTgCggAATG-3') (Mutated bases son Como se muestra en minúsculas). Luego, utilizando este mutante fragmento de 101 pb para una cartilla, que amplifica un fragmento de 1273 bp mutante utilizando un cebador inverso (5'-GTGCAGGGTTATGCATTGTT-3 '). El fragmento de 1273 bp mutante fue digerida con Bpu1102I Bpu1102I y EcoT22I EcoT22I y, a continuación, el fragmento se inserta en la Bpu1102I Bpu1102I / EcoT22I EcoT22I-digeridos pGL3-hADRP-4K vector.

Las secuencias de nucleótidos de estos plásmidos fueron confirmados por ABI PRISM ® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Cultivo de células

Células HepG2 se cultivaron en MEDM (Nacalai tesque), que contiene 10% de carbón térmico-inactivadas / dextrano tratarse de suero fetal bovino (SFB) (HyClone), 100 UI / ml de penicilina y 100 μ g / ml estreptomicina. El herméticamente tet-regulables clon de células HepG2 (HY-Toff), que fue transfectadas con el vector pTet-off, se aisló como ha sido descrito previamente [22]. HY-Toff células fueron co-transfectadas con pBI-EGFP-hPPAR y pBabepuro utilizando TransIT ®-LT1 transfección Reactivos (Mirus). Las células se cultivaron en un medio que contiene 600 μ g / ml G418 (Nacalai tesque), 1 μ g / ml puromycin (Sigma) y 1 μ g / ml Dox (Clontech). G418-y puromycin-clones resistentes fueron aisladas. Estos clones fueron seleccionados para seguir bien inducible clones por el control de la expresión de EGFP usando microscopía de fluorescencia y la expresión de las proteínas PPAR inmunoblot usando análisis en la ausencia de Dox.

Cuantitativo PCR en tiempo real

Total RNA se aisló ARN utilizando un kit de preparación (Isogen; Nippon Gene Corp). Primer capítulo cDNA fue sintetizado a partir del 5 μ g de RNA total de cada celda de la muestra utilizando el SuperScript ™ primer capítulo de síntesis del sistema de RT-PCR (Invitrogen) con oligo (dT) 12-18 primer. El ADNc se utilizan como plantillas para las distintas reacciones de PCR usando primers específicos conjuntos (Tabla 2], que fueron diseñados por el programa Primer3 escrito por el Whitehead Institute [43]. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando QuantiTect ™ ® SYBR Green PCR Kit (Qiagen). La PCR cuantitativa análisis se ha realizado mediante el ADN Opticon Engine ™ System (Bio-Rad Laboratories). Amplificación especificidad fue verificado en la visualización de los productos de PCR en un bromuro de etidio-manchados 3% gel de agarosa. Glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utiliza para la normalización de los datos de cada expresión.

Análisis por inmunotransferencia

Se obtuvieron extractos nucleares como ha sido descrito previamente [44]. Cada extracto nuclear (50 μ g) se resolvió en un 10% SDS-PAGE, y electroblotted a membranas de nitrocelulosa. Western blot los análisis se realizaron utilizando anti-humano PPAR α [H0723], PPAR δ [K7701] (Perseo Proteómica Inc) o PPAR γ [E-8] anticuerpos (Santa Cruz). Las señales se visualizan con el sistema de detección ECL (Amersham Biosciences).

Affymetrix oligonucleótido análisis de microarrays

HepG2-tet-off-hPPAR células se cultivaron en presencia (Dox) o ausencia de Dox para 5 días. En el caso de la ausencia de Dox, las células fueron tratadas con ligandos PPAR (100 μ M de ácido fenofibric PPAR α (Feno), 100 nM GW501516 para PPAR δ (GW) o 10 μ M ciglitizone para PPAR γ (Cig)) o vehículo (DMSO) Durante 24 h. Total RNA de muestras se han obtenido de estas células utilizando un kit de preparación de ARN (Isogen). Hibridación muestras fueron preparadas de acuerdo con el protocolo de Affymetrix como ha sido descrito previamente [7]. En resumen, 10 μ g de RNA total se utilizó para generar de primera línea cDNA. Después del segundo capítulo cRNA síntesis, la biotina y la amplificación de ARN fueron purificados usando RNeasy (Qiagen) y su cuantificación por un espectrofotómetro. Biotina cRNA muestras se hibridó a Affymetrix Genoma Humano U133A arrays. Estas matrices contienen conjuntos de sonda> 22000 EST transcripciones y clones. Después de la hibridación, microarrays se lavaron, escaneado, y analizó con el software GeneChip ® Microarray Suite (MAS) Ver.5.0 (Affymetrix). Los criterios de selección de los genes que fueron inducidos por ligando-activado PPARs fueron los siguientes: (1) en presencia del ligando, la diferencia media de los genes era ≥ 100 y el gen representados de la "presencia", (2) la proporción de El nivel de expresión en la presencia de ligando a nivel de la expresión en la presencia de Dox superior a dos, y (3) la relación entre el nivel de la expresión en la presencia de la expresión del ligando a nivel en ausencia de ligando fue mayor de 1,5 . Raw se dispone de datos NCBI en GEO, la página web número GSE2699.

Luciferase Assay

Células HepG2 fueron transfectadas utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. HepG2 células (3 × 10 4 células / así) fueron sembradas en placas de 96 pozos 14-18 h antes de transfección. Las células fueron transfectadas con 50 ng de plásmido reportero ADRP humanos, 50 ng de phRL-CT (Promega) y, o bien 5 ng de pcDNA3, pcDNA3-hPPAR α, pcDNA3-δ hPPAR, pcDNA3-hPPAR γ1 o la pcDNA3-hPPAR γ2 expresión vector. Veinticuatro horas después de transfección, las células fueron incubadas con un medio que contiene dimethylsulfoxide (DMSO) (vehículo), 100 μ M fenofibric ácido, 100 nM GW501516 o 10 μ M ciglitizone. Después de un período de 24 h, tanto luciérnagas y Renilla luciferase actividades se cuantificarán mediante un Dual-Luciferase ® Reporter sistema de ensayo (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Turno de ensayo de movilidad electroforética (EMSA)

Humanos PPAR α, δ humanos PPAR, PPAR γ2 humanos y humanos RXR α proteínas se prepararon utilizando el IMPACT ™ - NC sistema (New England Biolabs). PPAR γ1 Humanos de la proteína se sintetiza in vitro utilizando el TNT ® Quick Junto Transcripción / Traducción Systems (Promega). Doble capítulo de oligonucleótidos fueron etiquetados con [α-32 P] dCTP y un fragmento Klenow y se utilizaron como sondas. PPAR α, δ PPAR, PPAR γ1, PPAR γ2 y / o RXR α proteínas fueron incubadas con 32 P-etiquetados sonda en un volumen total de 12,5 μ l vinculante buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), el 5% de glicerol, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 μ g poli (de-dC), 30 μ g BSA) a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de una incubación a 4 ° C por 30 min. Supershift ensayos se realizaron mediante la adición de anticuerpos antes de 1 h de incubación con un oligonucleótido sonda a temperatura ambiente. Todos los anticuerpos monoclonales (PPAR α [H0723], PPAR δ [K9418], PPAR γ [A3408A]) se obtuvieron a partir de Perseo Proteómica. En estudios de la competencia, las proteínas se pre-incubaron con 10 - o 100 veces superior a molar etiquetados de tipo salvaje o mutante oligonucleótidos. Proteínas-ADN complejos se resolvieron en un 5% nondenaturing gel de poliacrilamida en buffer TAE 1 ×. El gel se fijó cargado con 10% metanol y 10% ácido acético y, a continuación, el gel se seca y autoradiographed. Doble varados oligonucleótidos compone de las siguientes secuencias se utilizaron para los ensayos de carácter vinculante y de la competencia: ADRP humanos PPRE tipo silvestre, 5'-GCATTTTGTAGGTGAAAGGGCGAGAGTC-3 '; ADRP PPRE mutante, 5'-GCATTccGcAaGcttAAGGGCGAGAGTC-3', y la rata acyl-CoA oxidasa (ACO) PPRE tipo silvestre, 5'-GCGGACCAGGACAAAGGTCACGTTC-3 '(Mutated bases figuran como minúsculas).

Immunoprecipitation cromatina (ChIP) de ensayo

HepG2-tet-off-hPPAR células fueron cultivadas en ausencia de Dox para 5 días. Las células fueron tratadas con ligandos PPAR (100 μ M de ácido fenofibric PPAR α, 100 nM GW501516 para PPAR δ, o 10 μ M troglitazone para PPAR γ) durante 8 h. Las células fueron fijadas en vivo a temperatura ambiente durante 10 minutos mediante la adición de formaldehído a una concentración final de 1% directamente en los medios de cultivo de células. La fijación se completó después de la adición de glicina 0,125 M con una concentración final de la incubación y fue seguido por otros 5 min. Las células fueron lavadas dos veces utilizando helado de buffer fosfato salino y recogidos. Los gránulos de las células fueron lavadas con buffer de lisis celular (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP-40, y de un cóctel de inhibidores de la proteasa (Sigma)) tres veces, y disuelta en SDS buffer de lisis (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 270 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 4% NP-40, 1,3% SDS, y de un cóctel de inhibidores de la proteasa) y se mantuvieron en hielo durante 10 Min. Las células fueron lisados sonicated a cortante de ADN cromosómico con un promedio de longitud de 1000 pb. Después de centrifugación para eliminar los materiales insolubles, la cromatina solución diluida fue de 10 veces en un buffer de dilución de la propiedad intelectual (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Tritón X-100, 0,01% SDS, Y un cóctel inhibidor de la proteasa), y la solución diluida fue despejado con la validez de la proteína G Sepharosa piedras en una rotación de la rueda a 4 ° C durante 1 h. Perlas se eliminaron por centrifugación y los sobrenadantes se incubaron con 2 μ g de anticuerpos a PPAR α (H-98, Santa Cruz), PPAR δ (H-74, Santa Cruz), PPAR γ (H-100, Santa Cruz), o RXR α (D -20, Santa Cruz) a 4 ° C durante la noche. Para un control negativo, pre-inmune de conejo IgG (Santa Cruz) se incubaron con el sobrenadante. Los complejos se immunoprecipitated con proteína G Sepharosa cuentas. Las cuentas una vez que se lavaron con buffer de dilución de la propiedad intelectual, dos veces con buffer de lavado 1 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Tritón X-100, 0,1% SDS, y un cóctel inhibidor de la proteasa ), Una vez lavado con buffer de 2 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Tritón X-100, 0,1% SDS, y de un cóctel de inhibidores de la proteasa), una vez con buffer de lavado 3 ( 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoxycholate), y dos veces con buffer TE. Inmunocomplejos que se eluida de la cuentas en la elución de amortiguación (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0,5% SDS, 10 mM TDT) por 15 min. Las proteínas fueron eliminadas de ADN por digerir con 1,5 mg / ml pronase a 42 ° C por 2 h. El crosslink se invirtió añadiendo 5 M NaCl a una concentración final de 200 mM seguido de incubación a 65 ° C durante 6 h. La muestra AND Luego se extrajeron con fenol-cloroformo-alcohol isoamyl (25:24:1), precipitado con etanol en la presencia de glucógeno, y resuspendido en buffer TE. Del mismo modo los fragmentos de ADN de la cromatina extractos (entrada) se utilizaron como control de las reacciones de PCR. AND precipitado se analizaron por PCR de 32 ciclos utilizando primers 5'-GCAAAAAGAAGCTTGCTCAG-3 'y 5'-TGTTGCCATCTTCAGTGTTT-3' que la flanqueado PPRE de la ADRP promotor o primers 5'-ATGGTTGCCACTGGGGATCT-3 'y 5'-TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA-3 'Que se encuentra a unos 6-kb aguas arriba del promotor GAPDH (control negativo). Productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 2% y teñidos con bromuro de etidio.

Lista de las abreviaturas

ACO, acyl-CoA oxidasa; ADRP, adiposo diferenciación relacionados con la proteína; ANGPTL4, angiopoietin-como la proteína 4; CLAMP/PDZK1, C-terminal y la vinculación de la modulación de la proteína / PDZ dominio que contiene 1; DMSO, dimethylsulfoxide; Dox, doxiciclina; GAPDH, Glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa; HADHA, hidroxiacil-Coenzima A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzyme A thiolase / enoyl-Coenzima A hydratase (trifuncionales proteína), la subunidad α; HDL, lipoproteínas de alta densidad; HMGCS2, 3-hidroxi-3 - Methylglutaryl-coenzima A sintetasa 2 (mitocondrial); L-FABP, la proteína de unión de ácidos grasos 1, de hígado; MCAD, acyl-Coenzima A deshidrogenasa, C-4 a C-12 cadena recta; PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase 1; PPAR, peroxisome proliferador Activados por los receptores; PPRE, peroxisome proliferador elemento sensible; RXR, los receptores X retinoides; Tet, la tetraciclina.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

K. Tachibana llevado a cabo todos los experimentos y preparó el manuscrito. Y. Kobayashi realizado ensayos de la reportera de genes. T. Tanaka participó en el diseño de los experimentos. Y. Kobayashi y A. Sugiyama generado los humanos ADRP promotor-reportero plásmidos. Y. Kobayashi, M. Tagami, T. Katayama, C. Ueda, D. Yamasaki, K. Ishimoto, y M. Sumitomo asistida con el cultivo de células y el establecimiento de las líneas celulares estables. Y. Kobayashi, M. Tagami, T. Katayama, C. Ueda, Y. y Uchiyama realizó el análisis de inmunoblot. T. Kohro asistida con el análisis de los datos de microarrays. J. Sakai, T. Hamakubo, T. Kodama, y T. Doi desarrollado la idea para el estudio, y participaron en su diseño y coordinación. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Los cambios en los niveles de expresión de mRNA en HepG2-tet-off-hPPAR líneas celulares por ligandos.
Microarray Se realizaron análisis sobre HepG2-tet-off-hPPAR células, la células se cultivaron en presencia (Dox) o ausencia de Dox para 5 días. A falta de Dox, las células fueron tratadas con ligandos PPAR (100 μ M de ácido fenofibric PPAR α (Feno), 100 nM GW501516 para PPAR δ (GW) o 10 μ M ciglitizone para PPAR γ (Cig)) o vehículo (DMSO) para 24 h . Perfiles de expresión génica se compararon entre DMSO y Dox (DMSO
Versus
Dox), ligandos y Dox (Feno
Versus
Dox, GW
Versus
Dox, y Cig
Versus
Dox se indica en el caso de los PPAR α, δ PPAR y PPAR γ, respectivamente) o ligandos y DMSO (Feno
Versus
DMSO, GW
Versus
DMSO, y Cig
Versus
DMSO se indica en el caso de los PPAR α, δ PPAR y PPAR γ, respectivamente). Promedio de las diferencias expresadas la intensidad de los niveles de mRNA en HepG2-tet-off-hPPARs líneas celulares. Las muestras se analizaron mediante GeneChip
®
Software Microarray Suite (MAS) Ver.5.0 (Affymetrix).
Agradecimientos

Damos las gracias al Dr Ying Huang y el doctor Yutaka Midorikawa por su ayuda en el establecimiento de las líneas celulares estables, y la Sra Akashi Izumi por la excelente técnica que se utiliza en el análisis de experimentos de microarrays de ADN.