Particle and Fibre Toxicology, 2005; 2: 7-7 (más artículos en esta revista)

Partículas ultrafinas citoesqueleto causa disfunciones en los macrófagos: el papel del calcio intracelular

BioMed Central
Winfried Möller (moeller@gsf.de) [1], David Brown M (Da.Brown @ napier.ac.uk) [3], Wolfgang G Kreyling (kreyling@gsf.de) [2], Vicki Stone (V. Stone@napier.ac.uk) [3]
[1] GSF Nacional Centro de Investigación del Medio Ambiente y la Salud, Clínica grupo de investigación 'Enfermedades inflamatorias de pulmón', Robert Koch Allee 29, D-82131 Munich-Gauting, Alemania
[2] GSF Nacional Centro de Investigación del Medio Ambiente y la Salud, Instituto de Biología inhalación, y Focus Red Aerosoles y de la Salud, Ingolstädter Landstr. 1-85746 Neuherberg / München, Alemania
[3] Napier University, Facultad de Ciencias de la vida, Edinburgh EH10 5DT, UK

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

Contaminación atmosférica por partículas se informa de causar efectos adversos para la salud en individuos susceptibles. Dado que la mayoría de estas partículas son derivados de los procesos de combustión, que es el principal producto es la composición de carbono con un diámetro muy pequeño (ultrafinas, de menos de 100 nm de diámetro). Además de la inducción de especies reactivas de oxígeno y de la inflamación, partículas ultrafinas (UFP) puede causar transitorios de calcio intracelular y represión de los mecanismos de defensa de los macrófagos alveolares, como la migración o la alteración de la fagocitosis.

Métodos

En este estudio el papel de los transitorios de calcio intracelular causado por UFP se estudió el citoesqueleto de las funciones relacionadas con la J774A.1 macrófagos. Diferentes tipos de finas y ultrafinas partículas de negro de humo (CB y ufCB, respectivamente), como el carbono elemental (EC90), comercial de carbono (Printex 90), de partículas diesel (DEP) y el polvo urbano (UD), fueron investigadas. Phagosome mecanismos de transporte y la integridad mecánica citoesqueleto se estudiaron por cytomagnetometry y viabilidad celular se estudió por microscopía de fluorescencia. Macrófagos fueron expuestos in vitro con 100 y 320 μ g UFP μ g / ml / millón de células de 4 horas en medio libre de suero. Antagonistas del calcio Verapamil, BAPTA-AM y W-7 se utilizaron para bloquear los canales de calcio en la membrana, quelato de calcio intracelular o para inhibir la calmodulina vías de señalización, respectivamente.

Resultados

Phagosome alteración de transporte y el aumento de la rigidez citoesqueleto ocurrió en EC90 y P90 concentraciones de 100 μ g μ g / ml / y por encima de millones de células, pero no con el DEP o UD. Verapamilo y W-7, pero no BAPTA-AM impedido el citoesqueleto disfunciones causadas por EC90 o P90. Además la presencia de 5% de suero o el 1% de albúmina sérica bovina (BSA) suprimió el citoesqueleto disfunciones. Célula de viabilidad mostró resultados similares, donde la cultura de la co-ufCB junto con Verapamil, W-7, FCS BSA o muerte celular producido menos en comparación con las partículas únicamente.

Antecedentes

Estudios epidemiológicos sugieren que el aumento de los riesgos para la salud (disminución de la función pulmonar, aumento de la morbilidad y mortalidad) después de la exposición a partículas ambientales [1, 2]. Recientes estudios epidemiológicos muestran, que no sólo la masa de las partículas inhaladas urbano (es decir, PM10 o PM2.5 ≡ masa de todas las partículas de un tamaño inferior a 10 μ m μ m o 2,5 μ m μ m, respectivamente) se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad, sino también la Número de partículas con aún mayor importancia [3, 4]. Debido a la masa de pequeños ultrafinas (diámetro <100 nm), en comparación con las partículas finas, que contribuyen poco a la masa total, pero son importantes en el número total de partículas. La mayoría de las partículas urbanas resultado de los procesos de combustión, por lo que la fracción dominante ultrafinas contiene partículas de carbón. Estas partículas son menos soluble y, por tanto, puede residir en los pulmones por más tiempo. Las partículas más grandes y las bacterias son phagocytized por los macrófagos alveolares y las vías respiratorias y las células dendríticas en cuestión de horas y más digerido, de mantenimiento de la superficie pulmonar en estado estéril (bajo condiciones fisiológicas). UFP no sólo son phagocytosed por los macrófagos alveolares, pero puede entrar en las células epiteliales, puede penetrar en la circulación, siendo más redistribuidas a otros órganos del cuerpo [5]. Por lo tanto, UFP puede llegar a los lugares del cuerpo lejos del sitio de entrada, donde pueden causar reacciones inflamatorias, en contraste con las partículas más grandes [6, 7]. Con la disminución del tamaño de las partículas de la superficie de partículas aumenta en relación con el volumen de partículas o partículas de masa. Las partículas que forman los agregados que se componen de subunidades de mucho menor tamaño puede aumentar su superficie en relación con la masa (superficie específica). Debido a su alta superficie específica, UFP puede catalizar las reacciones químicas, lo que puede inducir a la inflamación crónica. Los estudios en animales y los estudios de células in vitro han demostrado que las altas concentraciones de partículas ultrafinas pueden inducir procesos inflamatorios y el aumento de los transitorios de calcio [8 - 13], puede inducir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, al igual que el H 2 O 2, O 2 -) [14 - 16], puede inducir a la oxidación de las proteínas citoesqueleto [17, 18] y disfunciones citoesqueleto [19, 20], o puede actuar como vehículos para el transporte de gases y sustancias tóxicas a la periferia del pulmón [21].

Las células fagocíticas en el pulmón, tales como los macrófagos, leucocitos polimorfonucleares y las células dendríticas juegan un rol fundamental en la defensa de reacción. Ellos ingieren materiales extraños, digerir las bacterias y los virus, y la presente, a fin de antígenos específicos de activación (inmunológicos) mecanismos de defensa [22 - 24]. Macrófagos residentes en el alvéolo y la quimiotaxis de gradientes directo los macrófagos en cuestión de minutos al sitio de deposición de partículas. Durante la fagocitosis de partículas se incorporan en una vesícula membranosa, y se ingiere en phagosomes intracelular, que se funden con lisosomas [25]. Phagolysosomes son ácidos (pH ≈ 5), y contienen especies reactivas de oxígeno (H 2 O 2) [26, 27]. Son el sitio donde la mayoría de las bacterias y los hongos son digeridos. No digeribles partículas son retenidas en el pulmón por períodos más largos de tiempo, por ejemplo, las partículas de óxido de hierro tienen un trazador de limpieza de medio tiempo de 120 días en sujetos sanos no-fumadores [28]. UFP no sólo están sumidas por la fagocitosis y, por tanto, no necesariamente deben residir en phagolysosomes, que pueden suponer mucho más tiempo de residencia veces en el pulmón. El citoesqueleto de la AM es crucial que participan en la fagocitosis en las reacciones de defensa, incluida la locomoción y migración celular, fagocitosis, transporte intracelular, phagosome-lisosomas fusión y transducción de señales [29 - 31]. El citoesqueleto se compone de tres diferentes estructuras filamentosas. Microfilamentos (actina) participan en procesos dinámicos de la célula, como el rastreo y la fagocitosis. Microtubuli están involucrados en forma de células y el transporte de vesículas intracelulares. Filamentos intermedios contribuir a la parte estática del citoesqueleto. Cada estructura filamentosa tiene su propia familia de proteínas que se encarga de motor para el transporte de vesículas y moléculas [32]. Estos procesos de transporte requieren energía en forma de ATP [33, 34]. El citoesqueleto es sensible a ROS y estrés oxidativo, debido a la presencia de grupos tiol situado en la microfilamentos de actina, que son sensibles a la oxidación, lo que cruzar la vinculación de la reducción de la motilidad y [18, 35], y la dinámica del citoesqueleto está regulado por el calcio citoplásmico .

Hemos desarrollado protocolos para el estudio del citoesqueleto asociado funciones en los macrófagos in vivo e in vitro, como phagosome transporte, la integridad mecánica (viscoelástico propiedades, rigidez) y la fagocitosis, utilizando micropartículas ferromagnéticas [36 - 38]. En los estudios in vitro magnetico micropartículas (1,8 μ m μ m de diámetro) se incubaron durante 24 horas junto con los macrófagos cultivados, después de que más de un 95% se ingieren. Las partículas son entonces magnetizado y alineados en un breve pulso de campo magnético, y puede ser detectado por un sensor de campo magnético. Phagosome transporte intracelular causas disorientations estocásticos de las partículas, lo que resulta en una descomposición de los remanentes del campo magnético de la celda de la sonda (relajación). Además viscoelástico propiedades mecánicas del citoesqueleto pueden ser investigadas por las torsiones de la micromagnets en un débil campo magnético. Este método se denomina 'Twisting Citometría magnético' (MTC) [39, 40] y se ha utilizado para investigar el papel de las diferentes estructuras citoesqueleto en función de los macrófagos después de co-incubación con drogas citoesqueleto (Cytochalasin D, Nocodazole [37]]. Además se ha demostrado que el MTC puede supervisar la citotoxicidad de las partículas de GaAs-in vivo en macrófagos pulmonares de los animales [41, 42] e in vitro causados por partículas ultrafinas [20].

En este estudio, hemos investigado el papel del calcio intracelular transitorios producidos por el medio ambiente y la multa correspondiente modelo de partículas ultrafinas en la inducción de las reacciones adversas en el citoesqueleto de los macrófagos, utilizando la técnica del Comité de Transporte Marítimo. Cultivado macrófagos de la línea celular J774A.1 se incubaron con cantidades cada vez mayores de partículas. Phagosome transporte intracelular (relajación), la rigidez del citoesqueleto celular y la viabilidad de las mismas. Partículas sobre la base de carbono negro (CB) con diferentes composiciones químicas y de las impurezas, y una amplia gama de diámetros (12 nm - 1,5 μ m μ m) y la superficie de zonas específicas (≈ 1 m 2 / g - 600 m 2 / g) Probado.

Materiales y métodos
Objetivo células

J774A.1 macrófagos proceden de un BALB / c / NIH ratón [43] y se obtuvieron de la Colección de alemán Animal Cell Cultures (Tumorbank, DKFZ Heidelberg, Alemania). Las células fueron cultivadas en Medio RPMI 1640 (Sigma, Taufkirchen, Alemania), complementado con 5% de suero de ternera fetal (FCS), 100 U / ml de penicilina, 100 μ g μ g / ml estreptomicina, 2,5 μ g μ g / ml de anfotericina y 0,3 g / L - Glutamina en NaHCO 3. El cultivo de células crece con un tiempo de duplicación de 2 días y se sub-culta cada 4 días. En estudios de citotoxicidad se incubaron las células con las partículas y con agonistas de calcio en suero libre de soporte. Además, las células fueron incubadas con 5% FCS para probar el posible efecto citotóxico de la falta de suero en el medio.

Ensayo mediante partículas magnéticas vinculante

Un número de 0,2 millones de macrófagos se incubaron con 10 μ g μ g de 1,8 μ m μ m micropartículas esféricas ferromagnéticos en viales de vidrio (12 mm de diámetro exterior) durante 24 horas antes de la adición de antagonistas del calcio o partículas ultrafinas. Esta garantizada la adhesión de los macrófagos y más del 95% de la fagocitosis magnética cuentas. Antes de la adición de UFP o antagonistas del calcio, las células no adherentes y libre de partículas se eliminan por lavado con medio. Ferromagnéticos 1,8 μ m μ m magnetita micropartículas (tonos) se prepararon con reducir el tamaño de variación (desviación estándar geométrica <1.1) y de forma esférica [44], que es importante para el análisis de los datos utilizando modelos matemáticos para estimar la viscosidad y propiedades elásticas del citoesqueleto. Las partículas no son más de revestimiento, a fin de evitar la activación de los receptores específicos de la superficie celular. Se ha informado de que la no específica de los receptores Scavenger media fagocitosis de las partículas de la magnetita [45].

Prueba de partículas ultrafinas y calcio fármacos moduladores

Cuadro 1 ofrece una visión general de la prueba de partículas utilizadas en el estudio, junto con sus propiedades físicas. Debido a que la mayoría urbana partículas resultantes de los procesos de combustión, la fracción dominante contiene finas y ultrafinas partículas de carbón. Ultrafinas de carbono (EC90) fueron producidos por partículas de una chispa eléctrica generador [46] bajo condiciones de baja impurezas (metales de transición, por ejemplo, hidrocarburos policíclicos; alrededor del 5% de carbono orgánico). La movilidad de diámetro en el aire de estas partículas fue de 90 nm y la elevada superficie específica de 600 m 2 / g indicó que había mucho más pequeños agregados subunidades. Otra opción, disponible en el comercio de carbono partículas ultrafinas se utilizaron (Printex, P90, Degussa, Frankfurt, Alemania), que tiene un nivel bajo de impurezas orgánicas (≈ 1%), pero algunas impurezas de metales de transición (hierro, etc.) Partículas Diesel (Standard Material de referencia 1650, DEP) y el polvo urbano (Standard Material de referencia 1649a, UD) se utiliza para simular la exposición a partículas ambientales [47, 48]. El certificado de análisis de la UD no da una estimación de la superficie específica, por lo tanto, un valor de la literatura se obtuvo para un polvo urbano sonda (PM2.5) [49]. Las partículas fueron suspendidos dentro de tubos de vidrio en agua desionizada por ultrasonication y, a continuación, más diluido en medio sin suero. Microscópica investigación mostró que una gran fracción de las partículas de carbón como agregados apareció en la celda sondas.

Las partículas se incubaron a concentraciones de 100 y 320 μ g μ g / ml / millón de células de 4 h en el medio libre de suero, o en combinación con antagonistas del calcio, como Verapamil (100 μ M μ M, Ca 2 + canal bloqueador), BAPTA-AM (20 μ M μ M, quelante de Ca 2 +), o W-7 (N-(6-aminohexyl)-5-cloro-1-naftaleno-sulfonamidas clorhidrato, 25 μ M μ M, inhibidor de calmodulina). La concentración de la Ca-antagonistas se obtuvo de estudios previos y la prueba de que no sean tóxicas propias respuestas en los estudios preliminares. El antioxidante Nacystelin (NAL, 200 μ M μ M) también se incluyó. Nacystelin (NAL), un tiol antioxidante compuesto lysinated que es un derivado de la N-acetil cisteína (NAC), posee potentes capacidades mucolíticos y ha demostrado inhibir efectos de las especies reactivas de oxígeno [50]. Tiene la ventaja de tener un pH neutro en comparación con NAC, que es ácido, y por lo tanto, puede ser administrado a las vías respiratorias sin el local que se produce irritación de las vías respiratorias con NAC. Además de la función de suero (FCS, el 5%) o la albúmina sérica bovina (BSA, 1%) en el medio se investigó. En algunos experimentos a largo plazo de incubación (24 horas) se llevó a cabo una comparación con datos anteriores.

Viabilidad celular

Viabilidad celular fue probado por el yoduro de propidio (PI), la exclusión de pruebas. Células necróticas permitir la penetración de la PI en la célula y el núcleo, donde el colorante fluorescente pueden ser visualizadas. Después de 10 min de incubación PI con células adherente, las sondas fueron analizadas por microscopía de fluorescencia, la utilización de un microscopio invertido (Axiovert 25, Zeiss GmbH, Jena, Alemania), junto con una lámpara de arco de mercurio-y un sistema de filtro para la detección de yoduro de propidio ( PI) tinte y un sistema de cámaras digitales (CoolSnap-pro, Inc Mediacybernetics, Silver Spring, MD, EE.UU.). Las imágenes digitales fueron registrados y procesados utilizando el paquete de software Image Pro (Mediacybernetics Inc, Silver Spring, MD, EE.UU.). Por cada sonda una transmisión de imagen fue grabada, así como una imagen de fluorescencia. La transmisión de la imagen se utiliza para contar el número total de células en una región de interés (ROI), definido por una red superpuesta y con unos 80-100% de la imagen. Cada retorno de la inversión que abarca al menos 100 células. En la segunda imagen de fluorescencia el número de células positivas PI fue analizada en el mismo retorno de la inversión, permitiendo que la fracción de células muertas (PI +) que hay que evaluar.

Citometría de torsión magnéticos

In vitro para la medición de la relajación y el viscoelástico de células propiedades magnética torcer citometría de dispositivo (MTC) se utilizó [40]. Un vial de vidrio (12 mm de diámetro) que contienen adherente macrófagos ingeridos con partículas magnéticas se posiciona en un segundo gradiometer gama de sensores de flujo de puerta (Förster GmbH, Reutlingen, Alemania; Figura 1]. Las partículas en las células fueron alineados en paralelo a la dirección de los sensores de un 200 mT, 10 μ s μ s campo magnético pulso. La sonda fue girado a los 6 Hz y la señal de la matriz de flujo es más grande y la fase sensible detectado que redujo significativamente el ruido del sistema y la mejora de la sensibilidad. 10 μ g μ g de partículas ferromagnéticas remanent inducir un campo magnético (RMF) de ≈ 1 nT en el array de sensores. Partículas torsión se realizó en un campo magnético de torsión (1 - 2, 5 mT) perpendicular a la dirección de detección (paralelo al eje de rotación).

Estocástico phagosome movimiento (relajación)

La moción de vesículas y phagosomes sucede continuamente dentro de las células vivas y que forma parte del sistema de transporte intracelular. Relajación describe la decadencia del campo magnético después de la alineación de partículas en un campo magnético de pulso y se origina a partir de la asignación al azar de las partículas magnéticas. Suponemos que la phagosomes están acoplados a los filamentos del citoesqueleto de motor por las proteínas y que el hydrolization de ATP proporciona la energía para mover el phagosomes y para inducir rotación aleatorio patadas a la phagosome [33, 39, 51, 52]. Un modelo hidrodinámico relajación se elaboró bajo el supuesto de que la aleatorización intracelulares de energía E r se comporta como la energía térmica kT, lo que supone un proceso de movimiento browniano rotacional junto con un decaimiento exponencial en una viscosidad de Newton. La relajación modelo hidrodinámico fue ajustado a los datos experimentales por un no-regresión lineal algoritmo. Además dos potentes relajación parámetros fueron analizados, que se mantiene independiente de cualquier modelo (Figura 2A]. Esta es la RMF normalizaron después de 1 minuto, b1 = B (1 min) / B 0, que caracteriza a la fase inicial de rápida decadencia, y que después de 5 minutos, b5 = B (5 min) / B 0, que es característica de La decadencia en la siguiente fase lenta. Figura 2A ilustra la descomposición de las partículas y alineados por el deterioro y la UFP por Cytochalasin D, un agente de perturbación microfilament.

Magnética phagosome torcer

Aplicación de un débil campo magnético B TW induce torsión de un dipolo magnético de partículas y permite la investigación de reología frente al citoplasma de la integridad mecánica y [36, 53]. Las partículas en suspensión una viscosidad η rotar en una fuerza de torsión externa de acuerdo a la ley de Newton:

Donde θ d / dt es la tasa de cizallamiento y σ es la aplicada cizallamiento ( , H = remanent magnetización de las partículas, κ = factor de forma rotativa). En caso de la elasticidad de la tensión aplicada es proporcional a la deformación elástica (cepa θ) y obtenemos con el módulo de elasticidad ν la ley de Hook:

Σ = νθ (2)

Cuele se estimó a partir de la medición de campo de la célula B (t) de acuerdo con θ (t) = arccos B (t) / B 0. Primero fueron las partículas magnetizado y alineados paralelamente a los sensores de campo (Figura 2B]. Después de 20 segundos de relajación torcer el campo, se aplicó durante 10 segundos de duración y viscoelástico retroceso fue registrada por otros 3 minutos. Viscoelástico retroceso no dipolos la fuerza de nuevo a la curva de relajación inalteradas, la indicación de cortante viscoso, que puede reflejar una deformación permanente (ruptura de las interacciones filamentosos), de la estructura citoesqueleto. Figura 2B se muestra el cambio de alineación de partículas en el campo magnético de torsión, junto con la elástica retroceso en comparación a una curva de relajación registrados sin ningún tipo de fuerzas externas a las piedras magnéticas. Deformación permanente se caracteriza por la diferencia en completo retroceso elástico y sin molestias de relajación, como se ilustra en la Figura 2B. Cell rigidez se calcula como el cociente entre el promedio de estrés y la tensión después de un constante torcer duración de 10 segundos. Este análisis de las partículas no torcer vista específico viscoso o propiedades elásticas. Por lo tanto, este parámetro se ofrece una descripción integral del citoesqueleto propiedades mecánicas.

El análisis de los datos

Los datos presentados en las figuras 3 y 4 bajo la influencia de drogas o partículas se normalizaron a los resultados de control de sondas de partículas sin co-incubación. Un inhibe la relajación (más lenta decadencia, la mayor b5) resulta entonces en un valor normalizado mayor que uno. Que se acelere la relajación muestra como un valor normalizado más pequeño que uno. Cada conjunto de UFP / antagonista del calcio se realizó mediciones de al menos el 5 por separado sondas junto con un conjunto de medidas de control. Todos los parámetros estimados en el marco del conjunto de los antagonistas se normalizaron al conjunto de las mediciones de control. Una desviación significativa de los parámetros de la unidad normalizada denota una influencia de la UFP / antagonista. Utilizando un 2 caras de la t de Student Test, desviaciones de la unidad fueron analizados por su nivel de significación estadística. Una influencia por el antagonista fue aceptada cuando el nivel de significación fue de p <0,05. Análisis de correlación de Pearson se realizó a través WINSTAT, Versión 2001,1, Fitch Software, Cambridge, EE.UU..

Resultados
Influencia de la UFP en phagosome moción y sobre las partículas magnéticas torcer

Los resultados de estocástico phagosome transporte intracelular y la integridad mecánica de citoesqueleto después de 4 horas de incubación de J774A.1 macrófagos con 100 μ g μ g / ml multa o partículas ultrafinas se muestran en la figura 3 (que se resumen en los cuadros 2 y 3]. En comparación con las células sin partículas (control), P90 y EC90 causar un retraso de la relajación tanto, para las concentraciones de 100 μ g μ g / ml y de 320 μ g μ g / ml (datos no presentados). Este retraso no se ve o DEP UD partículas. El retraso de la relajación puede ser inhibido, en parte, por la co-incubación con Verapamil, pero no con BAPTA-AM. Co-incubación de la W-7 con 100 μ g μ g / ml P90 inhibe en parte el retraso de la relajación, a pesar de que no con 100 μ g μ g / ml EC90 partículas. UD relajación significativamente retrasados sólo por la alta concentración de 320 μ g μ g / ml; el retraso puede ser inhibida por los antagonistas del calcio. Las mediciones de la rigidez citoesqueleto (Figura 3B] reflejan los mismos resultados que se encontraron en las medidas de relajación. P90 y EC90 causa un aumento de la rigidez citoesqueleto, cuando no está presente en el suero. Verapamilo reducir el endurecimiento causado por P90 o por EC90. W-7 impedido el endurecimiento P90 sólo para co-incubación, pero no con EC90. BAPTA-AM no influyó en el endurecimiento de partículas inducida para ambos tipos de partículas. La más alta concentración de partículas de 320 μ g UFP μ g / ml refleja una respuesta comparables. Las partículas urbanas (DEP o UD) no modulan citoesqueleto rigidez, ni por sí sola o en combinación con antagonistas del calcio (datos no presentados). En resumen los datos muestran citoesqueleto disfunciones causadas por P90 y EC90, pero no por DEP, y por UD. Citoesqueleto disfunciones pueden ser inhibidas en parte por el canal de Ca 2 + blocker Verapamil y por el inhibidor de calmodulina W-7, pero no por el Ca 2 + quelante BAPTA-AM.

Influencia de suero, la BSA y Nacystelin sobre phagosome moción y sobre las partículas magnéticas torcer

La figura 4 muestra los resultados de suero y de la BSA en phagosome citoesqueleto en el transporte y la rigidez después de co-P90 con la cultura y EC90 (resumen en la Tabla 2 y Tabla 3]. Ambos, el 5% FCS y el 1% de BSA son capaces de inhibir la partícula inducida retraso de la relajación (Figura 4A] y el aumento de la rigidez de células (Figura 4B]. El antioxidante Nacystelin no inhibe la partícula citoesqueleto inducida disfunciones. Suero, la BSA y Nacystelin no influyen en ninguno de los efectos de la DEP o UD, por lo tanto, los datos no se muestran.

Influencia sobre la viabilidad celular

Después de 4 horas tiempo de incubación ninguna de las partículas o las drogas disminuyó la viabilidad celular por debajo del 90% a una concentración de partículas de 100 μ g μ g / ml / millón de células. Figura 5 muestra los resultados de la prueba de citotoxicidad (PI exclusión) de las células para J774A.1 una concentración de partículas de 320 μ g μ g / ml y 4 horas tiempo de incubación. P90 y EC90 mejorado de manera significativa la fracción de células muertas en medio w / o suero, que en parte podría ser suprimida por Verapamil y W-7, pero no por BAPTA-AM. Además FCS y la BSA, pero no NAL redujo la fracción de células muertas después de co-P90 con la cultura o EC90. Comparado con el control, no hubo aumento significativo en la fracción de células muertas después de co-DEP con la cultura o el uranio empobrecido. Un tiempo de incubación de 24 horas mejorado aún más el efecto citotóxico de la UFP (datos no presentados). La viabilidad de las células bajo el control de las condiciones (w / o partículas) fue de alrededor del 90% de FCS, BSA o NAL y disminuye a alrededor del 80% w / o FCS (p <0,01 en comparación a 4 horas tiempo de incubación). 24 h de incubación con el Ca-modulación de las drogas mostraron una reducción de la viabilidad de un 80% de Verapamil y BAPTA-AM, y el 70% para W-7. Esto refleja no condiciones fisiológicas de la Ca-antagonistas de la modulación a largo plazo después de la exposición. 320 μ g μ g / ml P90 y EC90 planteó la fracción de células muertas de hasta el 80% y el efecto de la Ca-modulación de las drogas no es uniforme. A largo plazo con la cultura co-DEP no planteó la fracción de células muertas, en comparación con el control de las condiciones de incubación. UD causado una duplicación de la fracción de células muertas, que puede ser inhibido, en parte, por la co-cultura con Verapamil, W-7, y con el NAL, pero no con BAPTA-AM.

Discusión y conclusión
Necrosis causada por UFP

Figura 5 muestra el potencial citotóxico de las partículas para inducir la necrosis de las células utilizadas en el estudio, junto con la modulación de Ca-antagonistas, en particular después de 4 horas tiempo de incubación. Las partículas ultrafinas de carbono negro (P90 y EC90) tuvo el mayor efecto sobre la viabilidad celular, con una duplicación de la fracción de células muertas después de 4 horas y una triplicación después de las 24 horas. EC90 partículas causado más células muertas debido a la mayor superficie específica en comparación con P90. FCS y BSA tanto reducir el potencial citotóxico de P90 y EC90. En presencia de FCS o BSA, la superficie de partículas puede llegar a ser recubiertos con proteínas, que pueden escudo reactiva sitios en la superficie de partículas y la reducción de los posibles causantes de las reacciones oxidativas. Aunque a medio libre de suero permite clara condiciones experimentales en el caso de los receptores dependientes de las respuestas, los niveles séricos de co-cultura puede estar más cerca de las condiciones fisiológicas en el pulmón, donde surfactante opsonizes abrigos y las partículas. Por otra parte, el efecto inhibitorio de la Ca-antagonistas no habría sido visto con la presencia de suero en el medio. A largo plazo de incubación de J774A.1 macrófagos sin suero indujo una disminución de la viabilidad celular, que muestran que esta por sí sola no es una condición fisiológica. Curiosamente, la viabilidad celular se podría mejorar por la presencia de suero o de BSA en el medio. Pero para períodos de tiempo cortos (4 horas), la ausencia de suero no lesionar las células.

DEP UD y producen menos citotoxicidad frente a la pura partículas de negro de humo, a pesar de otros reactivos material puede estar presente, como metales de transición, y adsorbido sustancias orgánicas. Una de las razones para la reducción de la citotoxicidad de los DEP y UD puede ser la menor superficie específica. En un estudio previo podría mostrar citoesqueleto disfunciones causadas por DEP, y la UD, tras 24 horas de tiempo de incubación [20]. En este estudio las diferentes condiciones de incubación se utilizaron, en donde las partículas se dispersa en medio que contiene el suero. Se demostró que las partículas sin crear grandes agregados de proteínas de suero en el medio, causando racimos de partículas en el μ m μ m de tamaño rango [54]. Esos grupos están sujetos a diferentes mecanismos de captación y procesamiento de las células (frente a la fagocitosis endocitosis de las partículas más pequeñas), aunque ambas están basadas en mecanismo de actina. Phagocytosed materiales son procesados a través de la digestión lisosomal ruta, que no es el caso después de endocitosis. Además, la superficie específica es más pequeño de las partículas de agregados. Así mismo, se observó que la materia orgánica adsorbida a partículas de la superficie puede reducir la superficie específica, pueden proteger a los sitios de reacción por lo menos hacer las partículas tóxicas que partículas llanura [55]. Sugerimos aquí que las sustancias orgánicas son estables cuando vinculado a la superficie, junto con bajas concentraciones en el medio. El obligado orgánicos de las partículas puede causar una superficie de revestimiento, que pueden proteger a los sitios de reacción de las centrales de carbón.

Influencia de la UFP en phagosome moción y sobre las partículas magnéticas torcer

MTC estudios investigan el transporte de micras de tamaño phagosomes desde dos perspectivas diferentes. Relajación supervisa directamente la dinámica de acoplamiento entre phagosomes y el citoesqueleto [39] mientras phagosome torcer examina la integridad mecánica (viscoelástico propiedades, la rigidez) de los filamentos de citoesqueleto, que están vinculados a la phagosomes [56]. Phagosome transporte requiere un citoesqueleto intacto, incluyendo motor intacto phagosomes proteínas y energía (ATP) [33, 57]. Además, intracelular de calcio juega un papel importante para el citoesqueleto y las funciones de señalización intracelular en relación con inmunológicos y no inmunológicos de defensa reacciones [58, 59]. Citotóxica reacciones pueden implicar el metabolismo energético de la célula, el calcio intracelular transitorios [13], la dinámica del citoesqueleto de filamentos y los mecanismos de transporte de phagosomes [41, 42]. Un estudio previo ha demostrado que la destrucción de microfilamentos por citocalasina D dado lugar a un retraso en la relajación y una mayor rigidez [37, 53]. La colchicina, que perturba microtubuli, resulta en una aceleración de la relajación y en un moderado aumento de la rigidez. Figura 2A ilustra el retraso causado por la relajación de 100 μ g μ g / ml P90, y la modulación de Verapamil y BAPTA-AM junto con el retraso producido por 4 μ M μ M Cytochalasin D. En comparación con los efectos inducidos por las drogas citoesqueleto las disfunciones producidas Por el carbón UFP sugiere microfilamentous destrucciones de las estructuras y, por ende, las disfunciones del citoesqueleto. Esto también está de acuerdo con otros estudios que muestran deterioro de la capacidad de fagocitosis (un mecanismo basado en actina) después de la incubación con diferentes tipos de UFP [19, 20].

Intracelular de calcio juega un papel central en la modulación de los mecanismos de defensa que causan la inflamación. Otros estudios han demostrado que las causas ufCB un aumento transitorio de calcio intracelular, la cual puede ser inhibida por el Verapamil bloqueador de los canales de calcio [13, 60]. Esto se refleja en este estudio de la inhibición de la ufCB citoesqueleto inducida por disfunciones en la presencia de Verapamil. Curiosamente, el quelante de calcio intracelular BAPTA-AM no inducir a la represión de espera citoesqueleto disfunción. La razón de esta falta de efecto no es claro, pero indica que no sólo el nivel de calcio intracelular es responsable de la ufCB disfunciones inducidas.

Calmodulina (CaM) es una proteína de unión de calcio ubicua que puede obligar a regular y una multitud de objetivos por diferentes proteínas que afectan a muchas funciones celulares. CaM mediador de los procesos, como la inflamación, metabolismo, la contracción muscular y la apoptosis celular circulación. Se ha demostrado que la calmodulina tiene un impacto directo en la polimerización de actina [61 - 63], acto vinculante de la miosina y la vinculación de cruz [64, 65]. CaM se piensa para activar la luz cadena de la miosina quinasa (MLCK) CaM kinasa II y por el desplazamiento de su auto inhibitorio dominios. Muchas de las proteínas que unen a CaM no están en condiciones de obligar a los propios de calcio y, como tal, el uso CaM como un sensor de calcio y transductor de señales. El hecho de que la CaM el inhibidor de la W-7 puede reprimir la mayoría de las reacciones causadas por citotóxica ufCB compañeros de la cultura demuestra que la vía de señalización dependiente de calcio es fundamental para el efecto citotóxico citoesqueleto y disfunciones. La falta de represión después de co-cultivo con EC90 partículas pueden reflejar su mayor superficie específica.

El antioxidante Nacystelin no inhibió la UFP inducida disfunciones del citoesqueleto. Radicales de oxígeno y causar una disminución de la oxidación de proteínas citoesqueleto (tioles), la perturbación de los filamentos de actina y la inhibición de la formación de F-actina, y una cruz la vinculación de actina [18]. La actina es el sistema más sensible constitutivos del citoesqueleto al ataque oxidante. Nacystelin tiol puede inhibir la oxidación [66], pero no se han traducido en una supresión de la UFP citoesqueleto inducida disfunciones. Esto demuestra que la oxidación tiol no puede ser la única respuesta a la exposición UFP (además de la modulación del metabolismo del calcio), pero la cruz de la vinculación de los filamentos de actina principalmente el retraso puede describir la relajación y el aumento de la rigidez del citoesqueleto.

La superficie específica de las partículas se discute a ser un parámetro importante en relación con las respuestas citotóxicas de partículas ultrafinas [16, 67]. Nuestros estudios, en parte, apoyan esta hipótesis. Viabilidad celular parece correlacionarse con la superficie específica de las partículas, en donde EC90 induce más células muertas en comparación con P90 o para UD y DEP. Deterioro de la relajación y el endurecimiento del citoesqueleto parece no depender de la superficie específica, pero W-7 podría inhibir la partícula inducida degradaciones de la P90, pero no en EC90, que tiene la mayor superficie específica. Además de las diferentes características de la superficie de la DEP y UD en comparación con EC90 y P90, la falta de citoesqueleto disfunciones de estos materiales parece ser, en parte, inducida por la menor superficie específica.

Lista de abreviaturas

UFP partículas ultrafinas

UfCB ultrafinas de carbono negro

PM2.5 masa de partículas con diámetro aerodinámico <= 2,5 μ m μ m

EC90 partículas de carbono elemental, el 90 nm de diámetro movilidad

P90 comercial de las partículas de carbono, Printex 90 (Degussa)

DEP partículas de los motores diesel

UD polvo urbano

W-7 (N-(6-aminohexyl)-5-cloro-1-naftaleno-sulfonamidas clorhidrato, 25 μ M μ M, inhibidor de calmodulina

CaM calmodulina

BAPTA-AM Ca2 + quelante

Verap Verapamil

BSA albúmina sérica bovina

FCS suero de ternera fetal

ATP adenosina trifosfato

PI probidium yoduro

ROI de la región de interés

MTC magnética torcer citometría

RMF remanentes del campo magnético de células / partículas magnéticas sonda

B1 = B (1 min) B 0 RMF 1 min después de la relajación

B5 = B (5 min) B 0 RMF 1 min después de la relajación

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

WM cuenta con una larga experiencia en el Comité de Transporte Marítimo mediciones e investigación de la utilización de las funciones del Comité de Transporte Marítimo citoesqueleto. Ha realizado los estudios junto con el doctor David Brown, durante una visita al laboratorio en Gauting / Alemania. PP y VS tiene una larga experiencia en la toxicología de partículas y la inducción de especies reactivas del oxígeno. Tienen una especial capacidad y experiencia en la función de los transitorios de calcio en vías de señalización intracelular. Ellos diseñaron los estudios e interpreta los resultados, y el PP realizó durante una visita de estudios en el laboratorio en Gauting / Alemania. WK es un especialista en estudios de remoción de partículas ultrafinas y translocación, y en la toxicología de partículas ultrafinas. Él produjo la EC90 partículas, que se caracteriza ellos y contribuyó al diseño del estudio y la interpretación.

Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de la CCA, en virtud de contratos FIGD-CT-2000-00053.