Plant Methods, 2005; 1: 2-2 (más artículos en esta revista)

Perfiles metabólicos de láser microdissected haces vasculares de Arabidopsis thaliana

BioMed Central
Martina Schad (schad@mpimp-golm.mpg.de) [1], Rajsree Mungur (mungur@mpimp-golm.mpg.de) [1], Oliver Fiehn (ofiehn@ucdavis.edu) [2], Julia Kehr ( Kehr@mpimp-golm.mpg.de) [1]
[1] Instituto Max-Planck de Fisiología Molecular de Plantas, Departamento Lothar Willmitzer, 14424 Potsdam, Alemania
[2] UC Davis, 4321 GBSF Edificio de Ciencias de la Salud Drive, Davis (CA) 95616, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Microdissection láser es una herramienta útil para la recogida de muestras de tejido-específico o incluso de las células individuales de los animales y las plantas de tejido secciones. Esta técnica ha sido empleada con éxito para el estudio de células de tipos específicos de expresión en el ARN y, más recientemente, también a nivel de proteínas. Sin embargo, los metabolitos no son susceptibles de análisis después de láser microdissection, debido a los procedimientos aplicados habitualmente para la preparación de muestras. El uso de estándares y de la fijación del tejido que incluyen protocolos para preparar secciones histológicas, metabolitos se extrajeron de manera eficiente ya sea por deshidratación solventes, o lavado a cabo por agentes de la incrustación.

Resultados

En este estudio, hemos utilizado cryosectioning como un método alternativo que preserva suficiente estructura celular y reducir al mínimo la pérdida de metabolito con exclusión de cualquier soluto intercambio pasos. El uso de este procedimiento de tratamiento previo, Arabidopsis thaliana secciones del tallo se prepararon para microdissection láser de los haces vasculares. Muestras fueron posteriormente analizados por cromatografía de gases-tiempo de vuelo de la espectrometría de masas (GC-TOF MS) para obtener perfiles de metabolitos. De 100 recogidos haces vasculares (~ 5000 células), 68 metabolitos pueden ser identificados. Más de la mitad de los metabolitos identificados, podrían ser demostrado ser enriquecido o agotadas en los haces vasculares, en comparación con los tejidos circundantes.

Conclusión

En este estudio se utiliza el ejemplo de los haces vasculares de demostrar por primera vez que es posible analizar un conjunto amplio de metabolitos de láser microdissected muestras de tejido a un nivel específico, dado que una adecuada preparación de la muestra se utiliza el procedimiento.

Antecedentes

A diferencia de los organismos unicelulares, plantas y animales han evolucionado tan complejo organismos que se definen por la distribución especial de las funciones vitales separados espacialmente de órganos y tejidos. Las distintas funciones de los tejidos y órganos integrados resultado de la actividad de las células individuales. Enfoques actuales de la mayoría de hacer caso omiso de este hecho a través del análisis de muestras que consisten en una variedad de diferentes tipos de células y, por tanto, media y diluir la información obtenida. Los parámetros que definen la función y el estado fisiológico de las células son la expresión de genes y proteínas, sino también el complemento de bajo peso molecular de compuestos como los lípidos, hidratos de carbono, vitaminas y hormonas que llevan a cabo gran parte de la célula de la empresa. Por lo tanto, además de transcriptomic y estudios proteómicos, un metabolito de análisis de alta resolución espacial es esencial para caracterizar completamente el estado de un determinado tejido.

Para lograr este objetivo, el análisis de los pequeños solutos en las células de plantas individuales hasta ahora se ha realizado después de la extracción de muestras de tamaño picoliter con vidrio microcapillaries [1] y especializados se han desarrollado técnicas para acceder a los componentes de esas muestras en pequeña escala [2 - 5] . Sin embargo, estas técnicas intensivas en mano de obra se mantuvo y requieren conocimientos especializados y la capacitación.

El reciente desarrollo de métodos que permiten la obtención de células individuales suficientes para procesar con métodos analíticos estándar es un paso clave para integrar la alta resolución espacial de análisis de laboratorio de rutina en el trabajo. Láser microdissection (LM) [6, 7] es, mientras tanto, bien establecidas y de los animales y con las muestras y permite la investigación de ARN y proteínas específicas de tipos de células [8, 9]. Recientemente, las plantas también se han utilizado con éxito en este tipo de experimentos y la información acerca de los genes [10 - 12], así como la expresión de la proteína [13] se obtuvo.

Antes de cualquier tejido puede microdissected, histológicos que se han preparado. Con este fin, el tejido es normalmente fijo y, posteriormente, ya sea incluidas en parafina [14, 15] o cryosectioned [15 - 17]. Sin embargo, la fijación y deshidratación de las medidas incluidas en estos procedimientos a una inevitable pérdida de los pequeños componentes celulares. Por lo tanto, las secciones de tejido resultante no permiten mediciones de la distribución de los metabolitos celulares y otros de bajo peso molecular compuestos.

La intención del presente estudio fue desarrollar un tejido que permite el procedimiento de tramitación de los tejidos específicos de las mediciones de metabolitos en microdissected vascular haz láser de muestras de A. Thaliana con tallos bien establecidas las técnicas de perfiles metabólicos. Una combinación de perfiles de metabolitos con los ya establecidos de genes y expresión de proteínas microdissected análisis de muestras de tejidos permitirá una amplia descripción de los organismos bajo diferentes de desarrollo, las condiciones bióticas o abióticas en un nivel específico de los tejidos, un nuevo paso importante en la biología integradora.

Resultados y discusión
Preparación y recogida de células de tipos específicos de muestras

La etapa más importante en el análisis de determinados tejidos o células, incluso es el único aislamiento de la meta de tejidos fuera de las células adyacentes. Usando microcapillaries es una opción para recoger el contenido de las células vegetales de vida [1, 3, 18]. Esta técnica de muestreo de los resultados, no sólo en el muy pequeño tamaño de las muestras en el picoliter gama, pero también es limitado principalmente a las células de la superficie expuesta. En este estudio, hemos utilizado el láser microdissection (LM) como una poderosa alternativa método de muestreo, que permite una recogida libre de la contaminación de las grandes poblaciones homogéneas de células a partir de células también situado en el interior del tejido [19].

Hasta la fecha, LM ha sido ampliamente utilizado, sobre todo tipo de células para estudiar la expresión de genes específicos y con menos frecuencia en tejidos específicos de análisis de proteínas en los tejidos animales [8, 9]. Recientemente, esta técnica se introdujo en las ciencias de las plantas tipo de células para permitir la expresión de genes específicos [10 - 12] y la proteína [13] de perfiles. Microdissection láser láser junto a la presión catapultarlas (LMPC) es un método que se aplica a material vegetal y permite el contacto libre de la recogida de células específicas [20]. Para realizar con éxito LMPC, sequedad de las secciones histológicas razonable con la morfología celular y la integridad son necesarios. Si bien la preservación de la buena morfología es necesaria para distinguir los diferentes tipos de células, también es crucial para mantener los analitos en su localización in vivo. Este último punto en particular debe tenerse en cuenta para el análisis de sustancias como metabolitos de los pequeños, ya que es evidente que no es difícil que reubicarse o pierden durante la preparación de tejidos.

En principio, hay dos métodos disponibles para el tratamiento de tejidos que son apropiados para su posterior análisis de proteínas o ARN. El primero es la inserción de parafina-[21 - 23], en el que participan numerosos pasos para solucionar el problema y deshidratan el tejido, llevando a una pérdida total de bajo peso molecular compuestos. La segunda opción es cryosectioning, que se utiliza comúnmente para preparar secciones para estudios moleculares de los tejidos animales, pero a menudo degrada la arquitectura histológica. Tejidos vegetales es especialmente propenso a la morfología de células daños, ya que la formación de cristales de hielo se ve facilitada en los tejidos ricos en agua. Para superar este problema, el material vegetal suele ser infiltrado con cryoprotection agentes antes de la congelación [11, 12]. Pero, como con la fijación de parafina, el uso de cualquier disolvente en el procedimiento de preparación de tejidos resulta en una pequeña pérdida de las sustancias y hace que las células de tipos específicos de metabolito de perfiles inviable.

En tejidos específicos metabolito de perfiles de los haces vasculares y secciones sin haces vasculares, por lo tanto, la estrategia seguida ilustra en la Figura 1. Se empleó un procedimiento en donde el material vegetal se congela sin la adición de compuestos de cualquier protección, y se seca sin químicos para evitar la deshidratación o la pérdida de los pequeños relocalization componentes celulares.

La morfología de las secciones obtenidas de congelados A. Thaliana se debe utilizar un criostato es completamente razonable y suficiente para selectivamente los impuestos especiales por los haces vasculares LMPC. Sin embargo, el obtener decente morfología de los tejidos estable piezas como haces vasculares es menos complicado en comparación con otros tipos de células, y también podría ser más difícil de alcanzar cryosections de planta de los órganos más delicados, como las hojas o raíces. Por lo tanto, la criopreservación y la sección tiene que ser optimizada en función de las especies de plantas, de órganos y tejidos de tipo de interés.

LMPC se realizó para obtener muestras de tejidos específicos, como se indica en la Figura 1. El gradual proceso de recogida de muestras de material cryosectioned tallo se ilustra en la Figura 2. En primer lugar, los haces vasculares se han marcado y, por tanto, seleccionada para la escisión, mediante la utilización de las imágenes de software especializados PALM (figura 2a]. El corte fue realizado por un rayo láser centrado (figura 2b], mientras que la última colección de tejidos en la tapa de un tubo microfuge fue alcanzado por una defocused láser de pulso (figura 2c y 2d]. El límite inferior del tamaño de los tejidos que se pueden recoger depende de la magnificación y la anchura mínima de los haces de láser que se encuentra en el rango de 1 μ m. En principio, LMPC puede ser usado para aislar algunos [19], e incluso las células individuales que se resuelven por ejemplo, en 40 × magnificación (datos no presentados). La tapa se llenó de etanol para inactivar enzimas metabólicas durante la recogida de las muestras. Este etanol había que reponer cada 10 min, debido a la evaporación del disolvente, ya que la recogida de una muestra compuesta de 100 haces vasculares requiere aproximadamente una hora. Después de recoger todos los haces vasculares de una sección, el remanente secciones sin haces vasculares se desprendieron en etanol utilizando un bisturí.

Si bien hay estudios que demuestran metabolito mediciones en solo individuo o sólo algunas células vegetales, los volúmenes resultantes pequeña muestra limita el posterior análisis de metabolitos a un número restringido de metabolitos en que se determinó por métodos enzimáticos [1, 24] o la electroforesis capilar [4 , 5]. Estos planteamientos permiten a la determinación de los azúcares o aminoácidos con extrema sensibilidad, pero necesitan conocimientos especializados que sólo se puede acceder en unos pocos laboratorios especializados. Al emplear GC-TOF MS, la intención de tomar ventaja de un sólido método de análisis que, aunque menos sensible que los métodos descritos anteriormente, y no adecuado para medir los metabolitos de las células individuales, tiene la ventaja de permitir a una variedad amplia de perfil De los compuestos de diferentes clases al mismo tiempo [25, 26]. Por otra parte, GC-MS para plataformas basadas en el análisis global metabolito son técnicas estándar accesible en muchos laboratorios.

Metabolito de perfiles

Hacer frente a tales comparativamente pequeño como el tamaño de las muestras obtenidas por LMPC aumenta el peligro de contaminaciones no deseadas. Los primeros experimentos con tubos de reacción de plástico sin tratar durante todos los pasos de la colección de tejidos de derivatización llevado a GC-MS espectros de espacios en blanco que no sólo prevé la figura artificial picos resultantes de la columna de derivatización y sangrado, pero también inesperadas como metabolito picos más contaminantes. El uso de los tubos de reacción de distintos proveedores, dio como resultado decenas de picos de contaminantes en todos los cromatogramas método en blanco. Como consecuencia de ello, los tubos de reacción para todos los nuevos experimentos (0,5 ml reacción de los tubos de plástico para LMPC, así como viales de 0,2 ml de vidrio para derivatización GC-MS) fueron lavados dos veces con agua destilada y secada. Puntas de pipeta una vez fueron lavadas con etanol directamente antes de su uso. Después de la recogida de las muestras, vortexing y centrifugación, sobrenadantes se transfirieron a viales de vidrio donde la derivatización se llevó a cabo. Estas precauciones mejorado notablemente la calidad de los espacios y son esenciales para el metabolito de perfiles de las pequeñas cantidades de muestra.

A continuación, la influencia de la preparación de la muestra sobre el procedimiento metabolito composición se investigó. Con este fin se compararon las muestras que fueron (a) disuelto en etanol directamente después de cryosectioning o (b) cortar, transferido a diapositivas, almacenada a 4 ° C, y se utiliza para LMPC. Como era de esperar, algunas diferencias en los perfiles de metabolitos de los dos tipos de muestras son observables: 11 de 72 metabolitos identificados en la medición del 5 completar tallo secciones transversales (10 repeticiones) parecía ser sensible a la preparación de muestras. Estos cambios fueron estadísticamente significativas (P <0,05) y, al menos, mostró un aumento de 1,5 veces o la disminución de la LMPC muestras, en comparación con cryosectioned muestras de control (Tabla 1]. Estos cambios observados son probablemente causados por los procesos biológicos y químicos durante el almacenamiento, la transformación y la microdissection, ya que todos los pasos que se llevaron a cabo a temperatura ambiente sin exclusión aérea. Por lo tanto, las muestras tienen que ser ejecutadas a través de idénticos procedimientos que permitan efectuar comparaciones de los niveles de metabolitos. Absoluta cantidades de determinados metabolitos tienen que ser tratados con precaución. Dehydroascorbate (la forma oxidada de la vitamina C), por ejemplo, se encontró que era fuertemente disminuido por el proceso de preparación de tejidos (cuadro 1], supuestamente debido a la oxidación por vía aérea. LMPC recogidos en los haces vasculares y secciones sin haces vasculares, dehydroascorbate estaba completamente ausente.

En tejidos específicos GC-TOF MS mediciones, hemos preparado tallo de cinco secciones transversales A. Thaliana y de las plantas recolectadas por LMPC cinco réplicas de cerca de 100 haces vasculares (~ 5000 células) de cada planta en etanol. Además, el 10 de los restantes paquete vascular-agotadas las secciones de cada planta se desprendieron las diapositivas y también recogidos en etanol. Los sobrenadantes se secaron, derivatizado con MSTFA y sometidos a GC-TOF MS metabolito de perfiles. Debido a la escasa muestra de las cantidades disponibles, derivatización de los metabolitos se hizo en un volumen de sólo 10 μ l. Por la misma razón, la inyección se llevó a cabo sin medidas de muestra de lavado.

Los datos de evaluación

El uso de la GC-TOF MS enfoque, el 68 metabolitos pueden ser identificados con fiabilidad en los haces vasculares y el 65 en las secciones sin haces vasculares. Este número de metabolitos identificados, es razonable teniendo en cuenta el pequeño número de células (~ 5000) utilizados para las mediciones. Los conjuntos de datos obtenidos fueron investigadas con más detalle para conocer las diferencias y similitudes en los perfiles metabólicos de los haces vasculares y el tejido circundante. En primer lugar, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para ver si agrupación lógica en el conjunto de datos puede estar relacionado con la máxima varianza. Esto sin supervisión de análisis de datos multivariados genera nuevas variables, componentes principales (PC), que tratan de expresar la diferencia en los datos originales. Cuando el trazado de los tejidos específicos metabolito de datos, es inmediatamente evidente que los haces vasculares y secciones sin haces vasculares están bien separados y tenían sus propios perfiles de metabolitos (Figura 3], lo que indica que la localización de los metabolitos se mantuvo durante el procesamiento de la muestra.

"T" de Student las comparaciones entre los conjuntos de datos reveló que alrededor de la mitad de los metabolitos identificados, y fueron significativamente diferentes, ya sea enriquecido o agotadas en los haces vasculares en comparación con las secciones sin haces vasculares (Tabla 2], incluyendo seis metabolitos que se consideraban sensibles a la Procedimiento de preparación de muestras (Tabla 1]. La figura 4 muestra ejemplos de cromatogramas de los haces vasculares y secciones sin haces vasculares de la masa a cargo ratio (m / z) 217. Este rastro de iones se usa para mirar en azúcares y alcoholes de azúcar. El insets (Figuras 4a y 4b] ilustran ejemplos de metabolitos que se enriqueció y agotados, respectivamente, en los haces vasculares. Diecisiete metabolitos fueron significativamente agotadas en los haces vasculares, mientras que el 16 metabolitos fueron enriquecidos en los haces vasculares y tres metabolitos, oxoglutarate, glyceraldehyde y glycerone, incluso se encuentran exclusivamente en este tipo de tejido. No tenemos conocimiento de nada en la literatura que se cuenta para estos metabolitos están localizados exclusivamente a los haces vasculares.

Azúcares representaron una clase entre los metabolitos con diferencias que dependen de los tejidos. Si bien la reducción de azúcares como la glucosa, fructosa y fucose se agotaron en el tejido vascular, la falta de azúcares reductores y sacarosa raffinose fueron enriquecidos. Esta distribución es característica de los azúcares de la savia del floema que probablemente para una gran porción del paquete vascular metabolitos.

Otra clase de compuestos que mostraron los diferentes niveles en los haces vasculares en comparación con el tejido circundante se aminoácidos. De este grupo de glutamato, aspartato y glutamina son los principales aminoácidos distribuidos a través de tubos en el floema A. Thaliana [27] y, por tanto, podría considerarse que se enriqueció en los haces vasculares. En este estudio, hemos encontrado sólo aspartato enriquecido notablemente en los haces vasculares en comparación con el tejido circundante mientras glutamato y glutamina fueron abundantes en los haces vasculares, pero también niveles similares fueron detectados en las secciones sin haces vasculares. Estos hallazgos no parecen ser causados por el tratamiento de la muestra, ya que ninguno de estos aminoácidos pertenecen al grupo de sustancias influenciado por el procedimiento de procesamiento de la muestra (Cuadro 1].

Conclusión

Este estudio demuestra por primera vez que microdissection láser puede aplicarse para analizar la distribución espacial de metabolitos en los tejidos de las plantas. La aplicación de un adecuado protocolo de preparación de muestras, omitiendo cualquier soluto medidas de cambio, seguido por LMPC hace metabolito de 100 perfiles de los haces vasculares, lo que equivale a sólo 5000 células, por norma GC-TOF MS mediciones viable. En principio, este método debe ser aplicable a una gran variedad de células y tejidos, dado que es suficientemente buena morfología obtenida tras la presenta cryosectioning procedimiento. En combinación con el anteriormente descrito ARN y proteínas de perfiles de expresión, el tipo de células específicas de metabolito de perfiles permitirá una caracterización de los distintos tejidos, un paso esencial hacia una comprensión cabal de las funciones de genes.

Métodos
Preparación de las secciones de tejidos y láser microdissection

Arabidopsis thaliana (Col-0) plantas fueron cultivadas en el suelo en una cámara de crecimiento bajo condiciones de día corto (8 h luz, 20 ° C y 16 h oscuridad, 16 ° C, 75% HR) durante cuatro semanas y, a continuación, en el invernadero bajo Condiciones de día largo (16 h de luz, 20 ° C, 60% HR y 8 h oscuridad, de 18 ° C, 75% HR). Los tallos, de 6 semanas de edad, las plantas se congelaron en nitrógeno líquido y trasladado a un criostato (Microm, Waldorf, Alemania) enfriada a -30 ° C. El uso de un bisturí, de 15 mm de largo tallo piezas se cortaron. Tallo piezas fueron pegados a la placa de la muestra mediante el empleo de Neg-50 (Richard Allan-científico, Kalamazoo, MI, EE.UU.), una soluble en agua congelada sección media. Usando el criostato, 30 μ m secciones fueron cortados y trasladados a las diapositivas de cristal donde se seca en cuestión de segundos a temperatura ambiente.

Por microdissection, la PALM Microbeam Sistema Láser (Bernried, Alemania) era empleada. Este sistema consiste en un fuego lento UV (337 nm de nitrógeno) y un láser de microscopio invertido. Las células fueron seleccionados utilizando herramientas de los gráficos de la PALM RoboSoftware. Después de la selección, los haces vasculares fueron aislados por el láser microbeam y después recogidos por láser catapultarlas presión en la tapa de un tubo de 0,5 ml de reacción (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) lleno de 50 μ l de etanol (Merck, Darmstadt, Alemania), situado en un Titular de cerca por encima de la diapositiva. Después de la recogida de los haces vasculares, las secciones restantes se desprendieron las diapositivas utilizando un bisturí en etanol (posteriormente denominado secciones sin haces vasculares). El número de células se calcula por el número de haces vasculares recogidas y el número de células contadas en un representante paquete vascular.

Ambos tipos de muestras se vortex y centrifugar 5 min a 14,000 rpm. Sobrenadantes se recogieron 0,2 ml en viales de vidrio (Chromacol, Herts, Reino Unido) y el secado al vacío. Todos utilizan tubos de reacción, incluyendo sus tapas, se lavaron dos veces con agua destilada y secarse antes de usar. Más detalles de los procedimientos de control de calidad durante la preparación de la muestra se presentan en el texto principal. Cinco plantas paralelas estaban empleados. De cada planta, cinco réplicas de 100 haces vasculares y 5 secciones sin haces vasculares se utilizaron para el análisis de metabolitos. Como controles negativos, el etanol sin microdissected material se procesó en paralelo a las muestras.

Metabolito de perfiles

Para GC-TOF MS (Leco Pegasus II GC-TOF espectrómetro de masa; Leco, San José, MI, EE.UU.) el análisis, el secado al vacío muestras fueron disueltos en 1 μ l metoxamina clorhidrato (20 mg / ml de piridina) y se incuba a 30 ° C durante 90 min con agitación continua. Luego 9 μ l de N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamid (MSTFA) se han añadido a derivatize grupos funcionales polares a 37 ° C durante 30 min. El derivatizado muestras fueron almacenadas a temperatura ambiente durante 120 minutos antes de la inyección. GC-TOF MS análisis se realizó en un cromatógrafo de gases HP 5890 con cónico, desactivado split / splitless la línea que contiene la lana de vidrio (Agilent, Böblingen, Alemania) y el 1,5 μ l de inyección splitless a 230 ° C de temperatura del inyector. Antes de cada inyección, la camisa se enjuaga con un puro MSTFA inyección (1 μ l). La inyección de la muestra se llevó a cabo sin medidas de muestra de lavado debido a la limitada cantidad de volumen total de la muestra. El GC fue operado en constante flujo de 2 ml / min de helio y un 30 m 0,32 mm id 0,25 μ m MDN35 columna (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). El gradiente de temperatura se inició a 80 ° C, se celebró isocratic de 2 min, y posteriormente ramped a 15 ° C / min, hasta una temperatura final de 330 ° C que se celebró durante 6 min. Veinte espectros por segundo se registraron entre m / z 85-500. Pico de la identificación y la cuantificación se realizó utilizando el paquete de software de Pegasus ChromaTOF 1,61 (Leco). Una referencia cromatograma se definió que había detectado un máximo de cimas de más de una señal / ruido umbral del 5 y utilizados para la identificación automatizada de pico de masa espectral basado en la comparación a un nivel de biblioteca NIST 98 y personalizados masa espectral bibliotecas. Automatizado de las cesiones de los fragmentos de iones únicos para cada metabolito se tomaron como por defecto como cuantificadores, y corregido manualmente en caso necesario. Todos los picos artefacto conocido columna causados por la hemorragia o phtalates y polysiloxanes derivados de la hidrólisis se MSTFA manualmente identificado y retirado de la tabla de resultados. Metabolito resto de los datos se normalizaron a la superficie total de todos los metabolitos detectados y log-transformado. Debido a la suma de los requisitos de bajos volúmenes de las muestras químicas y de fondo, no hay más internos se agregaron las normas. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Matlab versión 6.5 (The MathWorks, MA, EE.UU.).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MS lleva a cabo la optimización de la preparación de muestras para la GC-TOF MS mediciones, las muestras recogidas por LMPC, participó en la evaluación de datos y redactó el manuscrito. RM LMPC participó en la recogida de las muestras, GC-TOF MS mediciones y análisis de datos. DE participó en la GC-TOF MS optimización, la evaluación de datos, y el manuscrito de redacción. JK concebido del estudio, su diseño y organizó la coordinación y participó en la escritura manuscrita. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores gracias Carola Kuhn y el profesor Martin Steup de la Universidad de Potsdam para apoyar la labor criostato.