AIDS Research and Therapy, 2005; 2: 8-8 (más artículos en esta revista)

VIH-1 transcriptasa inversa mutaciones que confieren disminución de la susceptibilidad in vitro a anti-RT DNA aptamer RT1t49 confieren resistencia cruzada a otros anti-RT aptamers estándar, pero no a inhibidores de RT

BioMed Central
Timothy S Fisher (timothy_fisher@merck.com) [1], Pheroze Joshi (pjoshi@aecom.yu.edu) [1], Vinayaka Prasad R (prasad@aecom.yu.edu) [1]
[1] Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Albert Einstein, Bronx, Nueva York, EE.UU.
[2] Division of Cardiovascular Diseases, Merck Research Laboratories, Rahway, New Jersey 07065, USA

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Resumen

ARN y ADN aptamers específicos para el VIH-1, la transcriptasa inversa (RT) puede inhibir la transcripción reversa in vitro. Aptamers ARN se ha demostrado que potencialmente bloquear la replicación del VIH-1 en la cultura. Nos informó anteriormente mutantes del VIH-1 RT N255D con sustituciones o N265D que muestran resistencia a la DNA aptamer RT1t49. Variante de virus que incluye estas mutaciones por separado o combinados fueron comprometidos para la replicación. Con el fin de abordar la más amplia aplicabilidad de tales aptamers, el VIH-1, que contiene las variantes RT N255D, N265D o ambos (Dbl) se realizarán las pruebas de la magnitud de su resistencia cruzada a otros ADN / ARN aptamers, así como a otros inhibidores de RT. Ambos N265D y Dbl RTs fueron resistentes a la mayoría de aptamers probado. Mutante N255D mostradas leve resistencia a dos de la DNA aptamers, pocos cambios en la sensibilidad y la hipersensibilidad a tres a uno. Aunque todos los mutantes de tipo silvestre está representada como ribonucleasas H actividad, su actividad está en entredicho en las condiciones que impidan volver a vinculantes. Esto sugiere que la procesividad defecto causado por estas mutaciones también pueden afectar la función RNasa H contribuyendo así aún más a los defectos en la replicación de virus mutantes. Estos resultados indican que los mutantes que confieren resistencia a los anti-RT aptamers significativamente afectan a muchas RT del VIH-1 en la actividad enzimática, lo que podría contribuir a prevenir el desarrollo de resistencia in vivo. Si esas mutaciones fueron a surgir en vivo, nuestros resultados sugieren que la variante de los virus que siguen siendo susceptibles a muchas de las actuales inhibidores anti-RT. Este resultado fue moderado por la observación de que INTI-mutaciones de resistencia como K65R puede conferir resistencia a algunos anti-RT aptamers.

Antecedentes

La transcriptasa inversa (RT) del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es una enzima multifuncional, capaz de varios discretas actividades necesarias para la replicación viral [1]. Estos incluyen actividades esenciales de ADN y ARN-dependiente de la DNA polimerasa (DDDP y RDDP), ribonucleasas H (RNasa H), el capítulo y el capítulo de transferencia de las actividades de desplazamiento. Nativo RT del VIH-1 es un heterodimer de las subunidades p66 y p51, p66 de la subunidad que contiene tanto la polimerasa y RNasa H dominios. La subunidad p51 se obtiene de la división proteolítica subunidad p66 y se cree que desempeñan una función arquitectónica en el contexto de la p66/p51 heterodimer así como facilitar plantilla primer vinculantes [2].

Debido a su papel esencial en la síntesis de la doble-stranded DNA proviral de un solo varados VIH-1 ARN del genoma, la RT del VIH-1 es un importante objetivo de las terapias antirretrovirales actuales contra el VIH-1. Actualidad anti-VIH regímenes farmacológicos, denominada terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA), que suele consistir en una combinación de al menos tres fármacos antirretrovirales, con dos o más nucleótidos inhibidores de la transcriptasa inversa (INTI) es un alimento básico de la mayoría de los regímenes [3, 4] . Además de INTI, que son ambos inhibidores competitivos y terminadores de la cadena, los no análogos de nucleósidos inhibidores de la transcriptasa inversa (NNRTIs) consisten en compuestos estructuralmente disímiles hidrofóbico que unen a un bolsillo hidrofóbico en la adyacente a RT, pero se diferencia, el sitio activo , Que da cabida a dNTPs y INTI. Si bien los regímenes TARGA han disminuido tanto la mortalidad y la morbilidad de las personas infectadas con el VIH, hay varios factores que contribuyen al fracaso de drogas. El muy propenso a errores de la naturaleza del VIH-1 RT [5, 6] en combinación con una sólida tasa de replicación viral [7, 8], prevé el virus con un contexto ideal para la aparición de variantes resistentes. Además, la importante toxicidad asociada a la generación actual de los fármacos anti-VIH a menudo conduce al incumplimiento, que a su vez se traduce en el fracaso del tratamiento [9]. Por estas razones, existe un alto nivel de interés en el desarrollo de los más potentes inhibidores anti-VIH que son a la vez menos probabilidades de conducir a la aparición de variantes resistentes y mostrar menor toxicidad en los pacientes.

Entre un número de agentes anti-VIH que se está desarrollando para su posible uso en el tratamiento del SIDA están basadas en ácidos nucleicos inhibidores que pueden servir como útil terapias complementarias [10]. De ellos, tres de ácidos nucleicos enfoques basados Recientemente se han demostrado tener potente influencia en la replicación del VIH. En una de ellas, usando un largo ARN antisentido env enfoque, la fuerte inhibición de la replicación del VIH se observó en las células T en cultivo [11]. Este enfoque combinado con un vector lentiviral completado la fase I de ensayos clínicos y está a punto de iniciar la fase II de ensayos clínicos [12]. El segundo enfoque, la interferencia del ARN (RNAi), utiliza un celular vía natural para silenciar genes mediante ARN interferentes pequeños [13 - 16]. El tercer enfoque se basa en el ADN y el ARN aptamers que se obtienen por el proceso iterativo de SELEX, de obligar a la proteína a determinados objetivos [17] y recientemente se ha demostrado la eficacia en el bloqueo de la replicación del VIH [18 - 20].

Tuerk y Oro por primera vez el aislamiento de ARN aptamers orientación RT del VIH-1 mediante un proceso iterativo de selección de carácter vinculante, el lavado y el ARN de elución de una biblioteca aleatoria de las secuencias de ARN [21]. Informes posteriores mostraron que tanto ADN y ARN aptamers generados contra el VIH-1 RT [22, 23] son muy específicos (no vinculan a la FIV o MuLV RTs), se unen fuertemente a la RT del VIH-1 (Kd en el rango de 0,05 a 50 NM) y inhiben competitivamente su actividad de la polimerasa. La estructura cristalina de un RT del VIH-1 con un complejo anti-RT aptamer confirmó que el RNA aptamer está obligado por la plantilla primer fisura RT del VIH [24]. Dado que el aptamers competir con cartilla plantilla para la plantilla fisura vinculantes, que han sido denominados inhibidores de la plantilla analógico RT (TRTIs) [25]. Con el fin de probar la utilidad de los anti-RT aptamers como inhibidores de la replicación del VIH, hemos expresado anteriormente aptamers específicas de ARN del VIH-1 RT en células Jurkat T y puso de manifiesto que el espacio más reducido vinculante aptamers potentemente fueron capaces de bloquear la infección y la posterior propagación De VIH-1 en cultivo de células [19]. Además, cinco de las nueve diferentes clados del VIH-1 a prueba y todos los de la PI-RTI y aislados resistentes a prueba también fueron severamente inhibidas [19]. El bloque se encontró en los primeros pasos de la transcripción reversa. Un informe posterior, utilizando solo ciclo de experimentos con una infección RNA aptamer (1,1), ha confirmado la fuerte inhibición de la replicación del VIH-1 por anti-RT aptamers [18].

Se ha sugerido que la resistencia a aptamers in vivo puede ser difícil debido a la presunta necesidad de múltiples mutaciones necesarias para la separación de las interacciones a través de la interfaz entre el gran inhibidor del VIH-1 y RT [19]. Para hacer frente a esta noción, anteriormente utilizado un fenotípica pantalla basado en la detección in situ de RNA-dependiente de la actividad de la polimerasa de ADN del VIH-1 RT expresado en colonias de bacterias, y dos variantes de los aislados de VIH-1 recombinante RT teniendo las suplencias N255D O N265D, que muestran resistencia in vitro al DNA aptamer RT1t49 [25]. El mecanismo de resistencia a estos aptamers parece basarse en la pérdida de afinidad por el aptamer y el nivel de resistencia aumentó de un rango de 2 - a 11 veces por solo mutaciones a ~ 150 veces cuando las dos mutaciones se combinaron. Cuando el mutante RT secuencias se incorporaron en clones molecular del VIH-1, el resultado viriones de VIH fueron comprometidos para la infecciosidad de ciclo único y ensayos de la infección por el virus de la replicación de varios días en cultivo de células de replicación experimentos [25]. Así, a pesar de la sólida bioquímicamente actividad enzimática que permite que una droga para medir los niveles de susceptibilidad de las RTs mutante, parecía que el aptamer de mutaciones de resistencia tienden a meta crucial sitios biológicamente. En apoyo de este punto de vista, hemos demostrado además que los tres mutantes (la N255D, N265D y el doble mutante (Dbl) RTs que incluya a los dos mutaciones) son defectuosas para processive ADN dependientes de la actividad de ADN polimerasa (DDDP), aunque N265D mantenerse processive polimerización La actividad en las plantillas de RNA [26].

Los datos disponibles demuestran la utilidad de aptamers en la inhibición de la replicación del VIH-1. Además de su exquisita especificidad, alto nivel de resistencia a los anti-RT aptamers parece requerir múltiples mutaciones, que afectan a la actividad de la polimerasa de la enzima. Aunque las partículas de virus resistentes podrían ser producidos a partir de clones moleculares con RTs mutantes, el virus mutante de la reducción de la replicación exhibidas competencia y, por tanto, carece de una ventaja competitiva en la presencia de una gran complejidad de los virus de la población. Es importante saber si el aptamer resistentes RTs conservar su sensibilidad a otras clases de fármacos anti-RT. En la presente comunicación, hemos evaluado la más enzimática de las propiedades aptamer resistentes RTs. En primer lugar, medir la amplitud de resistencia cruzada a otros inhibidores anti-RT, incluidos varios estándar INTI y NNRTIs y otherDNA y ARN aptamers específicas de VIH-1 RT. En segundo lugar, hemos investigado los defectos bioquímicos que pueden ser responsables de la reducción de la replicación de su aptitud. Estas son preguntas importantes acerca de la posibilidad de anti-RT aptamers como una opción de tratamiento viable. Nos parece que esos mutantes son resistentes a varios aptamers adicionales de ADN, lo que sugiere un punto de contacto sobre el VIH-1 RT a esta nueva clase de ácidos nucleicos anti-inhibidores de RT. Es importante destacar que nos encontramos con que la aptamer mutaciones resistentes a retener susceptibilidades de tipo salvaje a todos los NNRTIs INTI y probado. Además, entre una serie de INTI-VIH-1 resistente a RT variantes, sólo la K65R RT mutantes mostraron una significante (5 veces) nivel de resistencia a la RT1t49. Nuestros resultados, junto con los informes anteriores, demuestran que las mutaciones que confieren resistencia a la DNA aptamer, RT1t49 in vitro afectar a la RNasa H de dominio además de los anteriormente demostrado efecto sobre la polimerasa de dominio, que son esenciales para la replicación del ADN viral eficiente.

Resultados
La resistencia cruzada de la DNA aptamer RT1t49 mutantes resistentes de VIH-1 a otros inhibidores de RT

Hemos investigado si la aptamer de mutaciones de resistencia, N255D y N265D, que afecta a la sensibilidad de la RT del VIH-1 a otros ADN y ARN aptamers dirigido a RT del VIH-1 [21, 23]. RT1t49 y otros 5 de ADN aptamers que representan cada una de las seis clases de ADN aptamers descrito por Schneider et al. [23] y un solo RNA aptamer 1.1 (denominado aquí Rknot 1,1) fueron seleccionados. Utilizando un estado de equilibrio de nucleótidos incorporación de ensayo, un patrón similar de la resistencia a RT1t49 de que se observó con el ADN aptamers RT26, RT4, y RT6 (Tabla 1]. En cada uno de estos casos, la mutación N265D confiere un mayor grado de resistencia frente a la mutación N255D. Además, la presencia de ambas mutaciones dado lugar a un mayor grado de resistencia (6 - a 27 veces) a aptamers en este grupo. Por el contrario, tanto Dbl mutante N255D y RTs se hipersensible (10 veces) al DNA aptamer RT8, mientras que el mutante N265D mostradas tipo salvaje niveles de sensibilidad (Tabla 1]. Sin embargo, con respecto a la DNA aptamer RT10 y la única prueba RNA aptamer (Rknot1.1), la mutante N255D fue similar a su forma natural, mientras que N265D y ambos fueron significativamente Dbl mutantes resistentes. La similitud entre los perfiles de resistencia N255D y N265D mutante RTs a ambos ADN aptamers (RT1t49, RT26, RT4, RT6) sugieren que los residuos de N255 y N265 son importantes contactos para varias clases de ADN aptamers.

Estamos próximos a prueba la resistencia cruzada de estas variante RTs a convencionales tales como los inhibidores de RT INTI y NNRTIs. Cada uno de los mutantes individuales, N255D y N265D, y el doble mutante RTs se les realizó pruebas de su sensibilidad a un conjunto seleccionado de INTI (AZTTP, ddATP, ddCTP, d4TTP y 3TCTP) o los NNRTIs (nevirapina y delavirdina). Curiosamente, ni el único ni el doble de mutaciones mutantes alterado la susceptibilidad del VIH-1 RT a cualquiera de estos inhibidores de RT (Tabla 2].

Algunos INTI-resistentes RTs pantalla de bajo nivel de resistencia a la DNA aptamer, RT1t49

Similares experimentos se realizaron para determinar la eficacia de la DNA aptamer, RT1t49 en la inhibición de la polimerasa en las actividades de varios INTI-mutantes resistentes de VIH-1 RT. Las variantes del VIH-1 RT demostrado que confieren resistencia a AZT (T215Y/M41L) y ddI y ddC (L74V) fueron sensibles a la inhibición por RT1t49 (Tabla 3]. En cambio, las mutaciones que confieren resistencia se muestra a varios INTI, incluyendo E89G, K65R y M184V muestran bajos niveles de resistencia a la RT1t49 (2-5 veces), con K65R mostrando el más alto nivel de resistencia (5 veces). K65R se sabe que causan resistencia a todos clínicamente aprobado INTI excepto AZT en los pacientes. Sin embargo, los experimentos in vitro bioquímicos muestran cierta resistencia a AZTTP y se ha sugerido este K65R se debe a la disminución de la tasa de AZTMP escisión. Los residuos E89 y K65 se encuentran en plantilla agarre región de la palma y β3-β4 horquilla bucle dedos de las regiones respectivamente. Ambas regiones se sabe que en contacto con las diferentes partes de la plantilla primer molécula. Por lo tanto, estos resultados sugieren que la RT1t49 aptamer puede hacer contacto con varias de las regiones clave de la teoría de que participan en la plantilla primer contacto.

Lucha contra el VIH aptamer RT-RT mutantes resistentes son defectuosos para RNasa H-mediada división

Estamos próximos a prueba los efectos de las mutaciones de resistencia en aptamer RNasa H actividad asociado con el VIH-1 RT. Estudios anteriores han demostrado que la alanina sustituciones en varios residuos en el surco menor vinculante pista (MGBT) [27] no sólo afectan RT procesividad, pero también la especificidad de RNasa H-catalizada polypurine la eliminación de las vías (PPT), primer [28]. Tanto N255 y N265 se encuentra en la hélice α H del VIH-1 RT, y son por lo tanto muy cerca de la MGBT. Tanto la polimerasa RNA-dependiente y 5'-final-dirigida RNasa H actividad de tipo salvaje y aptamer resistentes RTs se probaron. En las condiciones que impiden que la RT de rebinding el sustrato RNA.DNA duplex, la aptamer resistentes RTs resultaron ser deficientes en ambos polimerasa RNA-dependiente y 5'-final-RNasa H actividades dirigidas (Figura 1A y 1B]. En este caso, antes de la RT fue obligado a la DNA.RNA sustrato antes de las reacciones se iniciaron mediante la adición de ambos MgCl 2 y heparina como una trampa de la competencia. Por lo tanto cualquier formado productos son el resultado de un solo evento vinculante.

Polimerasa dependiente de RNasa H división por tipo salvaje RT resultados en la formación de un 102-nt producto (Figura 1A, carril 1). El menor de 94 nt producto es el resultado de posteriores 3 '→ 5' direccional nucleolytic actividad del VIH-1 RT RNasa H [29, 30]. En condiciones idénticas, cada una de las aptamer resistentes RTs no producen cantidades significativas de una de las 102-nt o 94-nt productos (Figura 1A, carriles 2-4). Si bien parecía haber una división limitada y por tanto N255D Dbl mutantes, los productos formados fueron alteradas en tamaño en comparación con los productos de tipo salvaje (Figura 1A, carril 1 vs carriles 2 y 4). Estos resultados indican que aunque el mutante N255D y Dbl RTs poseen residual polimerasa dependiente de la actividad en virtud de RNasa H único ciclo de división condiciones, la especificidad de la división en tales condiciones no se ha aceptado.

Reacciones similares se llevaron a cabo para determinar el efecto de aptamer mutaciones de resistencia en el VIH-1 RNA RT-5'-end dirigidas actividad RNasa H (Figura 1B]. Tras la conclusión de menos el capítulo de síntesis de ADN, ARN fragmentos dejados atrás se eliminan por esta actividad, a fin de facilitar más el capítulo de la síntesis de ADN. Tanto de tipo salvaje y aptamer resistentes RTs se incubaron con el ARN: ADN sustrato antes de las reacciones se iniciaron mediante la adición de MgCl 2 y heparina trampa. Wild tipo RT eficiente cleaved la ARN: ADN sustrato, por lo que la espera de 18 nt división de productos además de varios más pequeños productos que son el resultado de processive división. En cambio, las reacciones en las que aptamer resistentes RTs se incluyeron dado lugar a productos de mínimos (Figura 1B, carriles 2-4). En conjunto, estos resultados indican que ambos aptamer mutaciones de resistencia N255D y N265D resultado en una severa reducción de la RT del VIH-1 mediada RNasa H división impugnada en virtud de las condiciones.

El defecto observado en la Figura 1 que parece ser debido a una pérdida en la afinidad de sustrato y no se debe a defectos en la RNasa H actividad catalítica de estos mutantes RTs. Para determinar si estos mutantes RTs mantenerse RNasa H actividad catalítica, que mide la polimerasa dependiente de RNasa H división por tipo silvestre y mutante RTs en ausencia de una trampa. Como se muestra en la Figura 2, a 5 min de tiempo de reacción, de tipo salvaje hizo la espera RT 102 - y 94-nt productos. A diferencia de las anteriores reacciones impugnada RNasa H (Figura 1], N255D, N265D, y Dbl mutante RTs fueron capaces de hacer comparables los importes de la polimerasa dependiente de productos de RNasa H (Figura 2]. Tanto la cantidad total y la distribución de tamaños de los productos son similares entre tipo silvestre y mutante RTs en estas condiciones. Así, el aptamer de mutaciones de resistencia afectan RNasa H en condiciones que requieren la re-vinculante.

Discusión

Nuestros resultados destacan algunas características claves del aptamer resistentes RTs teniendo las mutaciones N255D, N265D o ambos (Dbl). En primer lugar, cada mutante muestran resistencia cruzada a tres de los 7 contra la RT aptamers prueba (Tabla 1]. Curiosamente, con tres de los aptamers (RT26, RT4 y RT6), el patrón de resistencia es muy similar a la observada con RT1t49 en que la reducción en la susceptibilidad es pequeña en el caso de que contenga solo RTs mutaciones, y es mayor para las Dbl mutante. Como se indica anteriormente, el nivel de resistencia de cada uno de los RTs a RT1t49 directamente correlacionado con las constantes de disociación para este aptamer. En ausencia de cambios en la afinidad a la normalidad plantilla primer sustrato, esto sugiere que la afinidad de la aptamer a la RT determina el grado de inhibición logrado [25]. Por lo tanto, nuestros resultados indican que la N255 y N265 son importantes puntos de contacto por la que el VIH-1 RT interactúa con cada uno de estos aptamers. En trabajos anteriores, Schneider et al. [23] clasifican los 30 diferentes de ADN obtenidos por aptamers que SELEX en seis familias sobre la base de la secuencia principal y la presencia de estructuras secundarias específicas (por ejemplo, los tallos, los bucles, etc) [23]. A pesar de la diferencia en la enseñanza primaria y secundaria de las diferentes estructuras de RT-vinculante aptamers, se piensa que todos ellos generan muy similares 3 dimensiones de estructuras que les permite interactuar con una superficie similar vinculante sobre la RT proteína. Pruebas adicionales en apoyo de ello es la presencia de la característica interrumpido hélices presente en todos RT-aptamers vinculante. La observación de que N255D y N265D mutaciones confieren resistencia a múltiples clases en aptamers sugiere que estos aptamers obligará a todos los VIH-1 RT de una manera similar.

La resistencia cruzada sugieren algunas pautas claras diferencias entre los anti-RT aptamers. Por ejemplo, la falta de cambio en la sensibilidad del mutante N265D a aptamer RT8 (Tabla 1] sugiere que el residuo N265 no podrá desempeñar un papel clave en la unión a RT8. También es interesante el hecho de que N255D mutante muestra una 10 veces hipersensibilidad a RT8. Suponemos que N255 residuos pueden participar en la unión a RT8 - sin embargo, la derogación de esta interacción por la sustitución N255D puede dar lugar a un cambio conformacional en la RT8 o RT, que pueden llevar a una mejor interacción con otra parte de RT aumentando así su afinidad A la mutante RT. Nuestro trabajo anterior muestra que los cambios en la sensibilidad a la inhibición por aptamers para N255D y N265D mutante RTs correlaciona directamente con sus afinidades vinculante a la aptamer [25]. El mismo 10 veces hipersensibilidad de los mutantes a Dbl RT8 parece reflejar la observación de que el efecto de N255D es el que predomina sobre la de N265D, en el contexto de las dos mutaciones.

Un objetivo a largo plazo de las pruebas anti-RT aptamers es el desarrollo de ellos como agentes anti-VIH que se administra a las personas que han de drogas debido a la falta crónica de la terapia antirretroviral o para los menores de tratamiento supervisado interrupción [10]. Por ello, es muy conveniente que aptamers son capaces de reprimir incluso los virus resistentes a los medicamentos. Aptamers clínicamente relevante puede ser introducido a través de la terapia génica en células hematopoyéticas de pacientes infectados por el VIH sometidos a terapia antiviral. Por lo tanto, estos anti-VIH aptamers se expresó intracelularmente como ARN. En este informe, hemos utilizado un DNA aptamer (RT1t49) como un modelo para probar esta idea. Nuestros resultados muestran que la mayoría de INTI-resistentes RTs mostrar sólo una leve resistencia a la aptamers (1 a 2 veces) (Tabla 3]. Sin embargo, ambos E89G [31], lo que rara vez ocurre entre los aislados clínicos como principal y la mutación más frecuente K65R, tanto mostrar un modesto nivel de la resistencia a RT1t49 (3 - a 5 veces). Sin embargo, ambas enzimas mutante Se ha demostrado que las propiedades han modificado con respecto a su interacción con la plantilla básica. La K65R y E89G mutantes se han comunicado para mostrar reducciones de 50% y 32% en sus constantes de disociación [[32, 33], 196215]. Por lo tanto, es probable que el aumento de la IC 50 de estas enzimas a la inhibición por el aptamer RT1t49 es un resultado indirecto de disminución de la disociación de su primer plantilla. Los resultados de las pruebas de sensibilidad RT1t49 (Cuadro 3], con el ddI / ddC resistentes L74V, resistentes a 3TC y el AZT M184V resistentes T215Y/M41L RTs están de acuerdo con nuestros ensayos de eficacia publicados anteriormente utilizando líneas de células Jurkat T que expresan cada una de las Tres seleccionados anti-RT RNA aptamers, en el que todos los ARN aptamers pudieron reprimir eficazmente la replicación del VIH resistentes a los medicamentos [19].

Prueba de la naturaleza y el tipo aptamer mutantes resistentes de VIH-1 RT para la inhibición de una variedad de INTI NNRTIs y reveló que, incluso si se aptamer-resistencia a surgir en vivo, por ejemplo, los virus pueden ser reprimidas de manera eficiente por los antirretrovirales convencionales (Tabla 2] . Estos resultados serían de interés para un escenario aptamers cuando se administra a las personas infectadas con el VIH, posiblemente a través de la terapia con células madre hematopoyéticas seguida de trasplante de médula ósea. En el caso de que aptamer resistentes variantes que se plantean en estos pacientes, LAT estándar puede ser usada para el tratamiento de estos pacientes.

La anterior observación, sin embargo, fue moderado por el hecho de que algunos de los INTI-mutaciones de resistencia, como E89G y K65R confiere un grado significativo de la resistencia a RT1t49 (3 a 5 veces). Por una parte, estos resultados sugieren que la pre-existentes INTI-mutaciones de resistencia, debido a la alteración de afinidades primer plantilla puede conferir resistencia a la co-aptamers o que las mutaciones K65R, como podría surgir en respuesta a la terapia aptamer. Por otro lado, la resistencia de datos proporciona información detallada sobre por medios indirectos que aptamer-RT interacciones pueden ser alterados. Aptamer resistencia puede ser el resultado de la perturbación, ya sea directamente de contacto de los residuos con la mutación de la aptamer o de un efecto indirecto sobre la conformación de un vecino de residuos de aminoácidos, el aumento de la plantilla de primer afinidad así indirectamente conduzca a alterado a la sensibilidad aptamer.

Aunque la resistencia a los aptamers pueden ser generados por las mutaciones específicas, nuestra labor anterior muestra que estas mutaciones por sí solo reducir la infectividad del virus en un 12 - 30 veces más de tipo salvaje en una sola ronda de la infección usando una LTR-reportero lacZ línea celular [25] . Además, durante una replicación de varios días experimento utilizando células T CD4 en la cultura, los tres virus son incapaces de reproducir y difundir a través de la cultura [25]. Tanto N255 y N265 son adyacentes a los residuos que forman la MGBT de VIH-1 RT. El MGBT ha demostrado ser crucial para la translocación de la enzima a lo largo de la plantilla durante la polimerización por ejemplo [27]. Además, como se indica por nuestros estudios anteriores, tanto N255D y N265D afectados mutaciones del ADN dependientes de la ADN polimerasa procesividad, mientras N255D también fue defectuosa de ADN dependientes de ARN-polimerasa procesividad [26]. Nuestros resultados actuales muestran que mientras que el bruto RNAse H actividad no se ve afectada, en condiciones que permitan re-vinculante (Figura 2], el processive RNAse H actividad (en las condiciones que impidan volver a vinculantes) se ve afectado por los tres mutantes (Figura 1]. Por lo tanto, estas mutaciones parecen disminuir la capacidad del VIH-1 a asociarse con RT y utilizar su ácido nucleico sustrato, por lo tanto, resulta en múltiples defectos funcionales que contribuyen a la pérdida de la aptitud para la replicación aptamer resistentes a los virus. Creemos que esto puede ayudar a explicar nuestra incapacidad para seleccionar variantes resistentes utilizando líneas celulares que expresan RNA aptamers (P. Joshi y V. Prasad, observaciones no publicadas).

Conclusión

Los resultados presentados en este informe intento de desentrañar el significado más amplio de los únicos dos mutaciones conocidas anteriormente específicamente a alterar la sensibilidad a la lucha contra el VIH-1 RT aptamers. Las mutaciones N255D y N265D confiere resistencia tanto a dos de los 5 nuevos ADN aptamers (con la excepción de RT8) y 1 RNA aptamer probado lo que sugiere que la N255 y N265 residuos probablemente servir como puntos de contacto para la mayoría de aptamers. Por lo tanto, es probable que la selección con los otros aptamers también pueden dar lugar a estas mismas mutaciones. Curiosamente, las mutaciones N255D o N265D no afectan a la sensibilidad a cualquiera de los NRTIs o NNRTIs probado que es una característica útil si la misma se analizaron a surgir en la respuesta al tratamiento con anti-RT aptamer ARN a través de la terapia génica en el futuro. Anteriores resultados mostraron que estas dos mutaciones, cuando se reconstituye en clones molecular del VIH, dar lugar a la replicación de virus defectuosos. Los efectos documentados aquí, en función de RNasa H, junto con processive defectos en la síntesis de ADN, anteriormente señaladas, proporcionar más razón de la pérdida de competencia para la replicación de los virus de este tipo.

Métodos
Polimerización ensayos
Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

TF de la droga llevadas a cabo estudios de sensibilidad para todos los aptamers utilizando recombinante purificada de tipo salvaje y mutante RTs que él previamente purificada, realizado RNasa H ensayos y preparó el primer borrador del manuscrito. RT PJ llevado a cabo estudios de inhibición con todos los NRTIs y NNRTIs. VP concibe el estudio, participaron en su diseño y coordinación y contribuyeron a generar el manuscrito final. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a WC Drosopoulos para leer el manuscrito, RA bambara de la prestación de los plásmidos para generar T7 RNA transcripciones utilizadas en RNasa H de ensayo y de la fallecida doctora Llegar a Lee de proporcionar la mutante E478Q purificado RT. La investigación se describe en este informe fue apoyado por un Servicio Público de subvención a VRP (NIH RO1 AI30861). TSF reconoce el apoyo de un marco institucional pre-doctoral de formación de subvención (NIH T32 GM07491).