BMC Infectious Diseases, 2005; 5: 13-13 (más artículos en esta revista)

Un doble fluorescente multiprobe ensayo para la proteína prión de los ovinos de genotipos

BioMed Central
Mario Van Poucke (Mario.VanPoucke @ UGent.be) [1], Jo Vandesompele (Joke.Vandesompele @ UGent.be) [2], Marc Mattheeuws (Marc.Mattheeuws @ UGent.be) [1], Alex Van Zeveren ( Alex.VanZeveren @ UGent.be) [1], Luc J Peelman (Luc.Peelman @ UGent.be) [1]
[1] Department of Animal Genetics and Breeding, Faculty of Veterinary Medicine, Ghent University, Heidestraat 19, B-9820 Merelbeke, Belgium
[2] Center for Medical Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University Hospital, De Pintelaan 185, B-9000 Ghent, Belgium

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Resumen
Antecedentes

Tembladera y la EEB pertenece a un grupo de mortales, transmisibles, las enfermedades neurodegenerativas llamado TSE. Con el fin de minimizar el riesgo natural de la tembladera y la EEB presume natural en el ganado ovino, los programas de cría para la resistencia a las EET se llevan a cabo en muchos países sobre la base de la resistencia a la prestación PRNP polimorfismos en los codones 136 (A / V), 154 (R / T) y 171 ( R / H / Q). Por lo tanto, fiable, rápido y rentable método de rutina en los ovinos de genotipos PRNP, la norma aplicable en los laboratorios de genética molecular equipado, será un instrumento esencial para cumplir con la necesidad de genotipos de cientos o miles de ovejas.

Métodos

Un doble fluorescente multiprobe ensayo que consta de 2 tubo cerrado reacciones de PCR que contienen, respectivamente, 4 y 3 de doble etiquetado ASO sondas fluorescentes para la detección en tiempo real de las 7 variantes alélicas de ovejas PRNP antes mencionados.

Resultados

El ensayo se realizó con éxito unpurified usando ADN como plantilla para PCR, sin ningún tipo de manipulación posterior a la PCR y semi-automático con determinación de los genotipos PRNP. La realización del ensayo fue confirmado a través de PCR-RFLP y la secuencia en un estudio de validación cruzada con 50 ovejas.

Conclusiones

Se presenta el desarrollo y validación de un sólido, confiable y reproducible para el método de genotipos PRNP de unos pocos a muchos ovejas muestras de forma rápida, sencilla y rentable, la norma aplicable en los laboratorios de genética molecular equipado. El primer tipo descrito / sonda diseño de la estrategia también se puede aplicar para la detección de otros polimorfismos o mutaciones causantes de las enfermedades.

Antecedentes

TSE o las enfermedades causadas por priones son un grupo de mortales, transmisibles, las enfermedades neurodegenerativas que ocurren en humanos (por ejemplo, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y la nv-ECJ) y los animales (por ejemplo, la tembladera y la EEB en ovinos en el ganado bovino). Estas enfermedades complejas (para ver comentarios [1]] se caracteriza por una acumulación en el sistema nervioso central de la PrP Sc, una enfermedad que causa isoforma de los receptores codificados proteína priónica celular, denominada PrP C [2]. En ovinos, se sabe que los polimorfismos en los codones 136 (A / V), 154 (R / T) y 171 (R / H / Q), de PRNP, gen que codifica la PrP C, se asocian con la resistencia a las EET / susceptibilidad [3 ].

En base a evidencias epidemiológicas, es casi seguro que la tembladera no es transmisible a los humanos, en contraste con la EEB, donde hay una fuerte evidencia de que causa nv-ECJ en humanos [4]. Por otra parte, también puede ser de ovejas infectadas por la EEB a través de la transmisión experimental, aunque la ARR / ARR PRNP genotipo parece que preste el más alto grado de resistencia a la vez la EEB y la tembladera clásica [5]. Porque hay una gran preocupación por la posibilidad de que las ovejas están también infectados por la EEB en la naturaleza, la UE obliga a todos los países de la UE para llevar a cabo programas de cría con el fin de seleccionar para la mayoría de los ovinos con genotipos resistentes a las EET para minimizar el riesgo de EET, o en última instancia, erradicar La enfermedad de las poblaciones de ovejas [6].

Con el fin de lograr este objetivo, fiable, rápido y rentable para el método de genotipos PRNP en el ganado ovino es indispensable. Hasta la fecha, una serie de métodos se utilizan, incluida la secuencia [7], PCR-RFLP [8], DGGE análisis [9], primer ensayo de extensión [10], [11] ARMAS, TaqMan-MGB de ensayo [12] y revertir Hibridación (Stefan Roels, comunicación personal). Aquí mostramos el desarrollo y la validación de un nuevo, la doble fluorescente multiprobe ensayo, que consta de 2 tubo cerrado reacciones de PCR que contienen, respectivamente, 4 y 3 de doble etiquetado ASO sondas fluorescentes para la detección en tiempo real de las 7 variantes alélicas de ovejas PRNP mencionado Supra.

Es importante señalar que en los últimos años hay más y más informes de las ovejas que están infectados con la tembladera atípicos, incluyendo ovejas con el ARR / ARR. Nuevas ideas en esta nueva forma de la tembladera, que parece estar asociada con PRNP codones 141 y 154 [13], probablemente tendrá un impacto importante en los programas de cría en curso para reducir la susceptibilidad de las EET y probablemente resultado en el desarrollo de métodos de genotipos adaptados .

Métodos
Preparación de ADN de muestras de sangre

Muestras de sangre total de 58 ovejas belgas (Texel, Suffolk, el más rápido, Bleu du Maine, Ardense Voskop, Vlaams Schaap, Lakens Schaap, Belgisch Melkschaap) se recolectaron en tubos que contienen anti-coagulantes y almacenados a -20 ° C. Doscientos μ l de sangre se lavó 3 veces con 500 μ l de TE (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8) a la limpieza de alrededor de los glóbulos blancos. El pellet se resuspendió en 100 μ l de tampón de lisis de K (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM KCl, 0,5% de Tween 20) suplementado con 100 μ g / ml de proteinasa K (Roche Diagnostics, Bélgica) y se incubaron durante 45 'a los 56 ° C para liberar el ADN. El lisado se incubó durante 10 'a 95 ° C para inactivar la proteinasa K y centrifugated a 16,100 g de × 1' bolita abajo a la celda de desechos. Esta solución unpurified ADN tiene una concentración media de 50 ng / μ l.

PCR primer tipo y diseño de la sonda

Primers y de doble etiquetado ASO sondas fueron diseñadas con el software Primer Express versión 2.0 (Applied Biosystems, EE.UU.) y sintetizados por Sigma-Genosys (Reino Unido). Sus secuencias y T m (calculado a través de T m de utilidad [14]] se enumeran en el cuadro 1.

Los primers generar una amplificación de 180 pb de PRNP exón 3 en los que figuran los codones 136, 154 y 171. El ejemplo descrito no contienen secuencias de SNPs, aumentar al máximo la gama de animales que pueden ser probados, y no contener más de 2 Cs Gs o en los últimos 5 pb y no más de 3 consecutivos Gs, minimizando la libre complementariedad y la formación de-primer Dímeros y estructuras de horquilla.

Un doble etiquetado ASO sonda fue diseñada para cada una de las 7 variantes alélicas, en la que el SNP está localizada aproximadamente a la mitad de la secuencia. La sonda de la secuencia no se inicia con una G, la prevención de la refrescante fluoróforo, y no contiene más de 3 consecutivos Gs. Para todas las sondas de posibles candidatos de cada SNP, la temperatura de fusión se calculó para la pareja perfecta (T m) y para el único desajuste (av T m) con la otra variante alélica. Esas sondas que fueron seleccionados para la T m, con la pareja perfecta es superior a la T m de los primers y para el cual la av T m, con el único desajuste fue inferior a la T m de los primers (véase el cuadro 1].

En PCR 1, el 4 variantes alélicas de los codones 136 (A / V) y 154 (R / T) de forma simultánea con 4 sondas alelo-específicas, cada uno con un fluoróforo. Una combinación de los fluoróforos FAM/HEX/TexasRed/Cy5 fue escogido como el descrito por Ugozzoli et al. [15]. En PCR 2, el 3 variantes alélicas del codón 171 (R / H / Q) se determinan simultáneamente con 3 sondas alelo-específicas, que contienen, respectivamente. FAM / HEX / TexasRed como fluoróforo. El fluoróforos FAM / HEX se apagará con BHQ1, y TexasRed/Cy5 con BHQ2.

Calidad de los ensayos de doble etiquetado sondas ASO

Con el fin de comprobar la calidad de las sondas, 1 μ l 10 μ M sonda fue digerida con 1 U de RQ1 DNasa (Promega, EE.UU.) de 30 'a 37 ° C en un volumen final de 10 μ l. Después de añadir 40 μ l de 10 mM Tris-HCl pH 8, la fluorescencia se midió mediante el uso de imágenes de los Servicios de la iCycler iQ Real-Time PCR sistema de detección (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.) con 50 μ l de la Bio-Rad calibración tinte Como referencia en un tubo separado.

Multiprobe ensayo doble fluorescente

Tanto el ensayo de PCR se realizaron en el iCycler iQ Real-Time PCR sistema de detección (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.), utilizando tubos de PCR normal (ABgene, Reino Unido), en un volumen total de 15 μ l que contenga iQ Supermix (50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,4, 0,8 mM dNTPs, 0,375 U iTaq ADN polimerasa, 3 mM MgCl 2 y estabilizantes; Bio-Rad Laboratories, EE.UU.), 400 nM de cada cebador y la sonda, y de aproximadamente 150 ng de ADN. La PCR en tiempo real para las dos reacciones programa consiste en un iTaq DNA polimerasa del ADN y la activación de desnaturalización paso (3 'a 95 ° C), seguido por 40 ciclos de amplificación (desnaturalización de 20 "a 95 ° C y la elongación de recocido-40" A 62 ° C). Las señales fluorescentes, generada por la división de los productos de doble etiquetado sondas ASO, se detectaron en tiempo real durante el recocido-alargamiento paso.

Los datos fueron analizados por el iCycler iQ Real-Time PCR versión de software de sistema de detección de 3.0a (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.). Por cada sonda, RFU-valores se midieron cada ciclo y después de la normalización de antecedentes conspiraron contra el número de ciclos. Sobre la base de estos en tiempo real la amplificación parcelas, Ct-se calcularon los valores de PCR en la cuantificación de la ficha de análisis de datos definidos por el usuario del módulo de asignación de los ciclos de referencia y la posición de Umbral. Los datos obtenidos, Ct-valores para la detección y 'N / A' para la no detección, fue copiada a una hoja de cálculo de Microsoft Excel [véase la archivo adicional 1] semi-automática para determinar el genotipo PRNP. Como controles positivos, el 8 de las muestras conocidas de genotipos que representan todas las combinaciones probadas de las variantes polimórficas de cada locus y el 1 de NTC, deben incluirse en cada ensayo. Sólo si todas esas muestras están correctamente genotipo, la de los genotipos desconocidos muestras deben ser considerados como fiables.

Electroforesis en gel y elución

La amplificación de 180 pb de productos de los ovinos con genotipos se visualizan conocido por el 2% de agarosa de fines múltiples molecular grado (Bioline, Reino Unido), electroforesis en gel, eluyen en 20 μ l con el kit Geneclean II (Bio101, EE.UU.), 1000 veces diluida con un 10 MM Tris-HCl pH 8 y se utiliza como plantilla durante el optimalization de la genotipificación de ensayo. Estos productos de PCR purificada también se utilizaron como controles positivos en ensayos posteriores. Para evitar la posible contaminación de las muestras de PCR con estos controles, el control de la configuración de la PCR se realizó después de la configuración de la muestra de PCR, con la misma mezcla de PCR, mientras que después de procedimientos estándar para la buena práctica de laboratorio.

PCR-RFLP

El ensayo de PCR-RFLP es descrito por Peelman & Van Poucke [16], validado a través de un anillo a la prueba organizada por la Sociedad Internacional de Genética Animal en el período 2003-2004, y ya se utiliza para el genotipo más de 3000 ovejas belga [17].

Secuenciación directa

Un PRNP de amplificación de 315 pb, que contiene los codones 136, 154 y 171, se amplificó con PCR primers OariPRNPseqF 5'-GGAGGCTGGGGTCAAGGT-3 'y OariPRNPseqR 5'-GGTGGTGGTGACTGTGTGTTG-3'. PCR se realizó en la T3 Thermocycler (Biometra, Alemania) en un volumen total de 10 μ l que contenga aproximadamente 150 ng de DNA, 500 nM de cada cebador, 0,8 mM dNTPs, 2 mM de MgCl 2, BioTaq de amortiguación y 0,5 U BioTaq polimerasa (Bioline, Reino Unido). PCR El programa consiste en un paso de desnaturalización del ADN (5 'a 95 ° C), seguido de 30 ciclos de amplificación (desnaturalización de 30 "a 95 ° C, recocido de 30" a 63 ° C y la elongación de 1' a 72 ° C ), Y un último paso para la elongación de 10 'a 72 ° C. Productos de amplificación se visualizaron en un 2% de agarosa de fines múltiples molecular grado (Bioline, Reino Unido) y la electroforesis en gel de eluyen en 20 μ l con el kit Geneclean II (Bio101, EE.UU.). Aproximadamente 200 ng de este producto purificado de PCR se utilizó en combinación con 2 pmol OariPRNPseqR primer secuenciación directa de la reacción con Thermo Sequenase Cy5 Dye Terminator Kit de Secuenciación de acuerdo a la las instrucciones de los fabricantes (Amersham Biosciences, Dinamarca). La reacción, que consta de 30 ciclos (30 "a 95 ° C, 30" a 58 ° C y 1'20 "a 72 ° C), se realizó en la T3 Thermocycler (Biometra, Alemania) y analizado en el sistema de secuenciador ALFexpress (Amersham Biosciences, Dinamarca).

Resultados
Doble fluorescente multiprobe ensayo optimalization

ADN fue liberado de 8 muestras de sangre de ovejas con genotipos PRNP conocido (VRQ / VRQ, VRQ / ARR, ARR / ARR, ARR / ARH, ARH / ARH, ARH / ARQ, AHQ / AHQ y ARR / AHQ), en representación de todas las combinaciones de Prueba variantes polimórficas de cada locus.

Con estas muestras de ADN como plantilla, la gama de temperatura de hibridación de los primers fue determinado en el que sólo la correcta fragmento de la PCR se amplificó por un gradiente de temperatura en el experimento iCycler iQ Real-Time PCR sistema de detección (datos no presentados). Este experimento se realizó con iQ Supermix, unpurified ~ 150 ng de ADN y 200 nM primers en un volumen total de 15 μ l.

Después de sonda de prueba de calidad, el rango de temperatura de hibridación se determinó para cada una sonda por separado, en el que se produjo hibridación muy específicos sin desajuste hibridación, en el rango de temperatura óptimo recocido de los primers. Esto se realizó con un tiempo real de gradiente de temperatura en el experimento iCycler iQ Real-Time PCR sistema de detección (datos no presentados). El experimento se realizó en un volumen total de 15 μ l con iQ Supermix, 200 nM primers y sondas, y de aproximadamente 150 ng de producto de PCR purificada para 3 muestras diferentes (+/+, + / - y - / -) y el H 2 O como NTC.

Por último, teniendo en cuenta el rango de temperatura óptima de hibridación de todas las sondas, la temperatura óptima de hibridación y de la cartilla y de la sonda Se determinaron las concentraciones para los 2 fluorescentes multiprobe ITP. Por tanto un tubo cerrado ITP recocido / temperatura de hibridación de 62 ° C en combinación con 400 nM primers y sondas dado lugar a un ensayo de genotipos precisa, incluso con unpurified ADN como plantilla. Las curvas obtenidas de amplificación de unpurified muestras de ADN con todos los resultados posibles para cada sonda se muestran en la Figura 1.

Semi-automático PRNP determinación genotipo

Con el fin de acelerar los datos analiza una hoja de cálculo de Microsoft Excel fue desarrollado para semi-automático PRNP genotipo determinación [ver archivo adicional 1]. Ct-valores (en el caso de detección) o 'N / A' (en el caso de la no detección), obtenidos con la iCycler iQ Real-Time PCR versión de software de sistema de detección de 3.0a (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.), tiene que Se entró (copiar y pegar) en el campo 'Ct-valores muestras' de la hoja de cálculo para todas las sondas de todas las muestras de ensayo, junto con su "Run ID" y "Ejemplos de ID", con el fin de generar el genotipo correspondiente. Una combinación imposible resultará en una celda en blanco. Lo mismo debe hacerse para las muestras de control en la 'Ct-Controles de valores'. El programa determina automáticamente si el control de las muestras se genotipo correctamente. Desde el 'Resultados',' Muestra ID »y el genotipo de cada muestra se puede copiar y pegar a otros programas de software, con un recordatorio de todas las muestras de control si se genotipo correctamente o no.

Cruz-estudio de validación

Para evaluar el desempeño de la doble fluorescente multiprobe ensayo para PRNP genotipo de las ovejas, un total de 50 muestras de ADN que habían sido previamente genotipo a través de PCR-RFLP [16, 17], se pusieron a prueba en una forma ciega. Por cada variante alélica genotipos homocigotos y heterocigotos fueron incluidos por lo menos 3 veces. Concordante resultados se obtuvieron muestras de los 50. Gráficos de dispersión de la discriminación alélica de las dos variantes de los codones 136 y 154, obtenidos a través de la Discriminación Allelic característica de los módulos de análisis de datos en el Umbral del Ciclo de visualización, se muestran en la Figura 2. Dado que el software no es capaz de distinguir más de 2 variantes alélicas, las parcelas no se muestran para el codón 171. Estos resultados también fueron confirmadas por secuenciación directa. Además, el ensayo se utilizó para el genotipo más de 600 belga ovejas resistentes a las EET en el marco del programa de cría. No hay discrepancias con las reglas de la herencia mendeliana se observaron.

Discusión

Para minimizar el riesgo ofTSE, los programas de cría de ovinos para seleccionar genotipos resistentes se pondrá en práctica en un futuro próximo en todos los países de la UE [6]. Un ensayo como se ha descrito anteriormente, por lo tanto, ser un instrumento vital para muchos de los laboratorios de genética molecular para satisfacer la necesidad de genotipos de cientos o miles de ovejas. Sin embargo, los más resistentes ARR / ARR ovejas no son 100% resistentes a la EEB y la tembladera clásica, y además son sensibles a la tembladera atípico [3, 5, 13]. Dado que los científicos están buscando nuevos marcadores de resistencia, es probable que, en base a nuevos resultados, los futuros programas de cría se adaptará. Como consecuencia de ello, también el genotipo métodos tendrán que ser adaptados, que se puede hacer fácilmente con este ensayo.

El ensayo puede realizarse sobre la iCycler iQ Real-Time PCR sistema de detección (Bio-Rad) o en el desempeño de las máquinas por igual. Dispone de 2 tubo cerrado reacciones de PCR con la misma PCR primers, que abarca los codones 136, 154 y 171 de ovino PRNP. En PCR 1, polimorfismos en los codones 136 (A / V) y 154 (R / H) simultáneamente se detectó en tiempo real con 4 diferentes productos de doble etiquetado ASO sondas fluorescentes. En PCR 2, polimorfismos en el codón 171 (R / H / Q) se detectó simultáneamente en tiempo real con 3 tipos de productos de doble etiquetado ASO sondas fluorescentes. Aunque no es el propósito de este ensayo, es posible distinguir homocigotos de heterocigotos, basándose en la forma de las parcelas de amplificación (Figura 1]. Estos no sólo pueden servir como controles internos, pero también puede identificar 'complejo' genotipos PRNP [18].

Una sonda para la detección de la variante K 171 no se incluyó en el ensayo, ya que se sabe poco acerca de su asociación con la resistencia a las EET / susceptibilidad [19]. Si recomendado, la sonda puede ser incluido en la PCR 2. El ensayo no ha sido probado en ovejas que contiene el alelo K 171, pero debido a la baja de la T m R 171, H 171 y Q 171 con sondas de la serie K 171, K 171 alelo no se detectó con el actual ensayo . En caso de un alelo homocigota no se detectó en 2 y PCR en el caso de un heterocigoto sólo el otro alelo para que se detecte en la PCR 2. Sin embargo, la forma de la parcela de amplificación revelará que sólo se detectó alelo 1. Este será también el caso para todos los demás mutación en la secuencia de la sonda, en función de la T m de las sondas con la mutación de la secuencia, que es inherente a una cartilla / sonda de la base técnica. Hasta ahora, ninguno de esos problemas se observó durante la rutina de genotipos de más de 600 ovejas belga.

Aunque el método de secuenciación sigue siendo el estándar de oro para la detección de todos los posibles polimorfismos, se trata de un muy largo y costoso procedimiento no es adecuado para la técnica de rutina de escribir de grandes números de muestras en los laboratorios más pequeños de servicio. El ensayo se describe aquí es un método alternativo para escribir la rutina de un número definido de polimorfismos. La capacidad de la iCycler excitar a la vez detectar y 4 diferentes fluoróforos, permite el uso de 4 diferentes sondas en un único PCR. Sólo el 2 PCR reacciones, cada una con un volumen total de 15 μ l, son necesarios para una adecuada genotipo convocatorias de los 15 posibles genotipos. Desde las variantes alélicas se detectan en tiempo real, no después de la PCR manipulaciones son necesarias, como la restricción de resúmenes y / o electroforesis, la reducción de tiempo, costos y posible traspaso de la contaminación. Se pueden copiar datos a una hoja de cálculo de Microsoft Excel para la determinación semi-automática de la genotipo [véase la archivo adicional 1]. Las muestras de control, que sirven como controles externos, se analizaron con éxito para muchas veces durante la rutina de genotipos, demostrando la reproducibilidad del ensayo.

Teniendo en cuenta las 9 muestras de control, tanto de PCR 1 y PCR 2 puede realizarse en 1 solo correr bien utilizando un factor de calibración de la placa de menos de 40 muestras. Para las 40 muestras o más (con un máximo de 87 muestras por ejecutar), el ensayo debe realizarse en 2 carreras (PCR 1 y PCR 2) usando la placa experimental para la calibración. Cada correr toma 1h25. Al utilizar múltiples robótico de trabajo y PCR en tiempo real sistemas de detección de este ensayo se puede usar fácilmente en los laboratorios se ocupan de un gran número de muestras.

El ensayo está sólido, ya que se pueden realizar con unpurified ADN como molde para la PCR, como se muestra en la Figura 1 y 2, a pesar de la amplificación de las parcelas por lo general tienen valores más bajos Ct-y superior-RFU con valores de PCR purificado productos (datos no presentados). Dado que el factor de la discriminación en la determinación de si es o no un valor Ct-se genera (el valor en sí no es importante), la concentración de ADN y la calidad no influir en el resultado de genotipos, mientras un producto de PCR se genera. Por lo tanto, un paso adicional de purificación del ADN se podrían incluir para mal conservado muestras de sangre.

Cuando la aplicación de la propuesta de primer / sonda de diseño de estrategia, el T m de los primers se puede elegir al azar, siempre y cuando el T m de cada sonda con su pareja perfecta secuencia meta es mayor y su av T m con la otra variante alélica (desajuste ) Es inferior a la T m de los primers (véase el cuadro 1]. A Δ T m, de 2 ° C en ambas direcciones es suficiente para obtener el deseado sonda especificidad alélica de la discriminación (véase la figura 1 y 2], sin necesidad de costosos o LNA-MGB-sondas [20, 21]. Se recomienda, para comprobar la sonda para cada fluoróforo respuestas antes de iniciar cualquier optimización de la PCR.

La realización del ensayo se demostró a través de un estudio de validación cruzada. La correlación entre los genotipos de 50 ovejas generado con el doble fluorescente multiprobe ensayo y con PCR-RFLP y secuenciación directa como métodos de referencia fue de 100%. Además, no hay discrepancias en contra de las reglas de la herencia mendeliana se observaron durante la rutina de genotipos de más de 600 ovejas belga.

Conclusiones

Hemos desarrollado y validado un ensayo doble fluorescente para multiprobe robusto, fiable y reproducible genotipo de los pocos que muchas ovejas muestras de forma rápida, sencilla y rentable, viable estándar en la mayoría de los laboratorios de genética molecular equipado. El primer esbozó / sonda diseño de la estrategia también se puede aplicar para la detección de otros polimorfismos o mutaciones causantes de las enfermedades.

Lista de abreviaturas

+ / + Homocigótica positivo

+ / - Heterocigota

-- / - Homocigótica negativo

Un Alanine

Armas mutación sistema de amplificación refractaria

ASO oligonucleótidos específicos de alelo

Av T m cuando la temperatura de fusión recocidos a Allelic Variant

BHQ agujero negro Quencher

BP basepairs

EEB, encefalopatía espongiforme bovina

ECJ Enfermedad de Creutzfeldt-Jacob

Ct umbral ciclo

DGGE desnaturalización electroforesis en gel de gradiente

DNA ácido desoxirribonucleico

UE Unión Europea

H Histidina

LNA bloqueado ácido nucleico

MGB surco menor vinculante

N / A No disponible

NTC No plantilla de control

PCR reacción en cadena de polimerasa

PRNP gen que codifica PrP C

PrP C anfitrión codificada proteína priónica celular

PrP Sc enfermedad de las enfermedades que causan enfermedades que causan isoforma de la PrP C

Q Glutamina

R Arginina

RFLP longitud de los fragmentos de restricción polimorfismo

RFU fluorescencia relativa de las unidades

SNP único polimorfismo

T m temperatura de fusión

EET encefalopatía espongiforme transmisible

U Dependencia (s)

V valina

Nv-ECJ variante de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jacob

Frente a frente

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MVP diseñado el proyecto y protocolos involucrados, llevado a cabo los análisis y redactó este manuscrito. JV participó en el primer / diseño de la sonda y siempre PCR en tiempo real de apoyo. MM llevó a cabo la preparación de ADN. AVZ y LJP participado en el diseño del proyecto.

Historia previa a la publicación

La historia previa a la publicación de este documento puede accederse en:

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Una hoja de cálculo de Microsoft Excel para la determinación semi-automático de las ovejas PRNP genotipo (sobre la base de los codones 136, 154 y 171).
Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Dominique Vander Donckt y Linda Impe excelente para la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el FPS Salud, la Seguridad y la cadena alimentaria Medio ambiente (Proyecto S-6151). Jo Vandesompele cuenta con el apoyo de una subvención del Instituto Flamenco de Promoción de la Innovación de Ciencia y Tecnología en Flandes (IWT).