Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 22-22 (más artículos en esta revista)

Focal gliales activación coincide con el aumento de la activación y la BACE1 precede a la deposición de la placa amiloide en APP [V717I] ratones transgénicos

BioMed Central
Michael T Heneka (heneka@uni-muenster.de) [1], Magdalena Sastre (magdalena.sastre @ ukb.uni-bonn.de) [2], Lucía Dumitrescu-Ozimek (Lucia.dumitrescu @ ukb.uni-bonn. De) [2], Ilse Dewachter (Ilse.Dewachter @ med.kuleuven.ac.be) [3], Jochen Walter (Jochen.Walter @ ukb.uni-bonn.de) [2], Thomas Klockgether (klockgether @ uni - Bonn.de) [2], Fred Van Leuven (fredVL@med.kuleuven.ac.be) [3]
[1] Department of Neurology, University of Münster, 48149 Münster, Germany
[2] Department of Neurology, University of Bonn, 53127 Bonn, Germany
[3-3000 Leuven, Bélgica

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Resumen
Antecedentes

La inflamación es sospechosa de contribuir a la progresión y la gravedad de la neurodegeneración en la enfermedad de Alzheimer (EA). Ratones transgénicos overexpressing la london mutante de la proteína precursora amiloide, APP [V717I], recapitular enérgicamente la patología amiloide de la EA.

Métodos

Principios y finales, temporales y espaciales características de la inflamación se estudiaron en APP [V717I] ratones a los 3 y 16 meses de edad. Gliales activación y expresión de marcadores inflamatorios fueron determinados por inmunohistoquímica y RT-PCR. Deposición amiloide fue evaluada por inmunohistoquímica, thioflavine S tinción y occidental mancha experimentos. BACE1 actividad se detectó en el cerebro y en lisados situ utilizando el kit de BACE1 actividad de R & D Systems, Wiesbaden, Alemania.

Resultados

Focos de activar las microempresas y astroglia se detectó ya a la edad de 3 meses, antes de que la deposición amiloide. La inflamación comprende el aumento de los parámetros de codificación de los niveles de mRNA de β interleucina-1, interleucina-6, el complejo principal de histocompatibilidad II y macrófagos-estimulantes de las colonias-factor-receptor. Focos de CD11b-positivas microglia expresó estas citocinas y neighbored fueron activados por astrocitos. Sorprendentemente, β-secretase (BACE1) mRNA, proteína neuronal BACE1, en los sitios de inflamación focal y el total de actividad de la enzima BACE1 se incrementaron en 3 meses ratones transgénicos APP, relativa a la edad no coincide con ratones transgénicos. En ratones transgénicos APP años de edad, el ARNm de todos los marcadores de inflamación analizados se aumentó, acompañado por astroglial iNOS expresión y NO dependiente de peroxinitrito en libertad, y con la activación glial cerca de casi todos los difusa y senil A β depósitos.

Conclusión

Los principios de coordinación y activación glial, en relación con el upregulated BACE1 ARNm, proteínas y actividad en presencia de su sustrato APP, es propuesto para representar a los primeros sitios de la deposición amiloide, que en la evolución de las placas amiloides.

Antecedentes

Enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo que se caracteriza por la progresiva pérdida de la memoria y disminución de las funciones cognitivas. Histopatológicas características incluyen extracelular péptido amiloide (A β) en la deposición neuritic placas, y de los depósitos intracelulares hyperphosphorylated Tau, causando la formación de los ovillos neurofibrilares y finalmente la muerte neuronal. A β péptidos se generan a partir de la proteína precursora amiloide (APP) por las acciones secuencial de dos enzimas proteolíticas, es decir, el sitio β-APP división enzima (BACE1) y el γ-secretase [1, 2]. Su formación y posterior deposición representa un elemento clave y, posiblemente, el mecanismo de activación de la EA. La importancia de una formación de β fue instigada por dominantemente heredadas formas familiares de AD que están relacionados con mutaciones en el APP o cerca de la β-y γ-secretase división lugares [3]. Esto hizo posible para generar modelos de ratones transgénicos de amiloidosis cerebral y AD-como histopatología, es decir, las placas amiloides y angiopathy cerebral amiloide (CAA) [4 - 6] (3-8) [7, 8].

La deposición de un eventual β neurofibrilares enredo y la formación puede no cuenta para todos y, en particular, no para la mayoría de los principios de los síntomas clínicos en AD. Se observan cambios inflamatorios en el cerebro AD general, y en particular en los depósitos de amiloide, que comprende invariablemente activado microglia [9, 10]. Una vez estimulado el comienzo de la degeneración neuronal, microglia versiones, una amplia variedad de mediadores pro-inflamatorios incluyendo citoquinas, componentes del complemento, radicales libres y diversas óxido nítrico (NO), que además contribuyen a la disfunción neuronal y, finalmente, la muerte. Estos crear y alimentar un círculo vicioso que podría ser esencial en la progresión patológica de la EA [11]. Aparte de los efectos directos de cualquier microglial inflamación, la contratación de astrocitos que reúnen alrededor de las placas amiloides y en es probable que prolongar el curso inflamación.

Además de los datos histopatológicos y bioquímicos, proinflamatorias varios genes se han vinculado a un mayor riesgo para la AD, incluidos interleukin1 (Il-1) [12], interleucina 6 (IL-6) [13] y factor de necrosis tumoral alfa (TNF α) [14]. La hipótesis de que los cambios inflamatorios contribuir activamente a AD patogénesis está respaldada por los datos epidemiológicos, es decir, la medicación de largo plazo con antiinflamatorios no esteroideos (AINES) parece reducir el riesgo, retrasar la aparición y disminuir el deterioro cognitivo de los pacientes AD [ 15 - 17].

El descubrimiento de que las citoquinas son capaces de transcriptionally upregulate BACE1 mRNA, proteína y los niveles de actividad de la enzima y por lo tanto, aumentar y fibrillogenic Un total de péptidos en las células β-modelos biológicos [18], nos llevó a probar la hipótesis de que está relacionado con BACE1 dependiente de la edad en los parámetros de inflamación In vivo, es decir, en el cerebro de la APP [V717I] ratones transgénicos. Los datos presentados son una importante ampliación de la caracterización fenotípica de la APP [V717I] recapitular los ratones que no sólo el amiloide [6] y cerebrovasculares angiopathy [7], pero los diversos aspectos de neuroinflammation. Además, indican que a principios de coordinación y estimular la inflamación Mayo comentarios local APP BACE1 y procesamiento a través de estos sitios, por lo tanto, posiblemente representan los lugares de origen de las placas.

Métodos
Animales

Expresando ratones transgénicos APP [V717I] en el marco del ratón thy1 promotor del gen de la FVB / N antecedentes genéticos [6] de 3 años y 16 meses fueron utilizados en este estudio con ratones transgénicos no de la misma base genética, el sexo y la edad como controles. En el momento del sacrificio, los animales fueron perfundidos anesthetised y transcardially con heparinized cloruro de sodio (0,9%), los cerebros fueron removidos y varias regiones incluyendo la corteza frontal y el cerebelo disecado de un hemisferio cerebral con el ratón atlas coordenadas [19]. Secciones fueron disecados broche de congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta el análisis. El resto del hemisferio se fijó bien en paraformaldehído al 4% seguida de la incrustación o parafina cryofixation sufrió bajo la protección del tejido con tejido frezzing medio (Leica Instruments, Nussloch, Alemania) de acuerdo a protocolos estándar, antes de la sección de inmunohistoquímica. Cuidado de los animales y el manejo se realizó de acuerdo a la declaración de Helsinki y aprobados por comités de ética locales (# 50.203.2BN aprobación 33,34 / 00).

Inmunohistoquímica

Serial sagital se cortaron secciones (7 μ m) de los tejidos incrustados parrafin (Leica RM2155 micrótomo) y montado (Histobond adhesión diapositivas, Marienfeld, Alemania). Recuperación de sitios de antígeno, el bloqueo de la peroxidasa endógena y el bloqueo de la actividad no específica sitios de unión se realizó de acuerdo a los protocolos estándar. Por inmunoticción de tejidos embebidos en parafina-, las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: 1) ratón mAb contra GFAP, # MAB360 (1:800, Chemicon, Hofheim, Alemania). 2) contra la iNOS pAb conejo, 32030 (1:150, Transduction Laboratories, Heidelberg, Alemania). 3) Un conejo pAb contra β1-42, # 44-344 (1:40, Biosource International, EE.UU..). Inmunohistoquímica localización se realizó a través de avidina-biotina peroxidasa método (ABC-Kit, Vector Laboratories, Burlingame, EE.UU.) con 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride como cromógeno. Por costaining en parafina de tejidos de GFAP y β1 A-42, las diapositivas se lavaron dos veces en PBS y bloqueado en el 20% de suero normal de cabra. Después de la incubación con el anticuerpo primario durante 20 h diapositivas se lavaron y se incubaron con biotina de cabra anti IgG de conejo. Localización inmunohistoquímica se detectó como se ha descrito anteriormente usando Vector-azul como sustrato (Vector-azul sustrato kit, Vector Laboratories, Burlingame, EE.UU.).

Todos los demás simple o doble inmunomarcación se realizó en cryofixed secciones cortadas (6 μ m) y el monte como se ha descrito anteriormente. Secciones se secan a RT de 1 h y luego fija en el 4% PFA o metanol durante 15 min a TA. Después de un lavado con PBS la doble tinción se realizó mediante la adición al mismo tiempo tanto de primer anticuerpos y la noche a la mañana seguido de la incubación a 4 ° C. Además de lo anterior se describen los siguientes anticuerpos anticuerpos fueron utilizados: 4) rata mAb # 711 MCA contra murino CD11b (CD11b, 1:250, Serotec Düsseldorf, Alemania). 5) rata mAb contra Il-1 β, MAB401 (1:50, R & D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemania). 6) cabra pAb contra la IL 6, M12 sc1265 (1:200, Santa Cruz, Inc Biotecnología, Heidelberg, Alemania). 7) 7520 conejo pAb contra el dominio C-terminal de BACE1 (regalo del doctor Christian Haass, Adolf-Butenandt-Instituto de la Universidad de Munich). 8) ratón mAb anti nitrotirosina # 05-233 (1:40, Upstate Inc, Biomol, Hamburgo) 9) conejo pAb GFAP, Z334 contra la proteína ácida glial fibrilar (1:800, DAKO, Hamburgo, Alemania). 10) ratón mAb MAB # 377 en contra de los núcleos neuronales (neuN, 1:500, Chemicon, Hofheim, Alemania). La cabra secundaria anticuerpos (fluoresceína DTAF conjugadas anti conejo 1:150, Texas Red conjugado anti ratón 1:80, Texas Red conjugadas anti rata 1:80, Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, EE.UU.) se aplicaron secuencialmente después de un lavado en PBS. Incluyeron controles negativos no específicos IgG en lugar de anticuerpos primarios; antes de la absorción respectiva afines con péptidos (150-200 μ g de péptido / ml de solución de trabajo de anticuerpos), la omisión de la secundaria de anticuerpos y la ausencia de inmunoreactividad en la no-transgénicos de los controles Respectivos edad.

Microscopía de escaneo láser confocal

Doble etiquetado se analizaron con un microscopio de escaneo láser confocal (Multiprobe 2001; Molecular Probes, Inc, Eugene, OR) equipado con un Ar / Kr equilibrada con láser de emisión en 488, 568, y 647 nm. Las imágenes fueron adquiridas en un 40 × magnificación para asegurar una alta calidad de resolución de microglial células. Para lograr una óptima señal-ruido para cada fluoróforo, el escaneo secuencial con 568 y 488 nm se utilizó. Las imágenes digitalizadas fueron procesados con software ImageSpace 3,10 (Molecular Probes, Inc), en un Silicon Graphics (Mountain View, CA) de potencia serie 310GTX estación de trabajo. Original sección de la serie fueron sometidos a gaussiana de filtración para reducir el ruido y mejorar débilmente, pero específicamente etiquetados partes. Original y filtrada secciones se proyectaron en un avión utilizando un algoritmo de máxima intensidad y, en algunos casos, utilizando un código de fondo y de superficie de algoritmos de representación.

Thioflavine-S tinción

Thioflavine-S tinción de reaccionar sección consistió en 0,015% acuosa thioflavine-S durante 10 minutos, seguida de diferenciación en el 50% de etanol, lavado en agua, el aire y la aclaración de drenaje en xileno. Posteriormente diapositivas fueron cubiertos y evaluados bajo las lámparas fluorescentes UV utilizando un nivel de filtración y microscopio (Nikon, Eclipse E-800).

Cuantificación de inmunohistoquímica

Por cuantitativos de análisis de imágenes de hipocampo y corteza inmunoticción, sagital de serie tomados de las secciones laterales (+0,5 - 2.25) fueron examinados. INOS, GFAP y CD11b tinción de las células, así como un β1-42-positivas neuritic placas se cuenta con las secciones de 6 animales por grupo. Los antígenos se detectaron en 10 secciones paralelas definen con distancia de 70 μ m mostrando tanto el hipocampo y corteza. En cada sección, 20 campos elegidos al azar fueron evaluados. Número de células se determinó mediante un recuento en cuadrícula de 20 × magnificación y dado que los cálculos de milímetros cuadrados. Las imágenes fueron adquiridas mediante un estándar de la luz y el microscopio de inmunofluorescencia (Nikon, Eclipse E-800) conectado a una cámara digital (Sony, modelo DXC-9100P, Köln, Alemania) y el sistema a un PC con software de imágenes LUCIA (LUCIA 32G, versión 4,11 ; Laboratorio de la Imagen, Düsseldorf, Alemania). Los datos fueron analizados por ANOVA con post test de Tukey utilizando SYSTAT (Systat, Evanston, EE.UU.).

ARN preparación y RT-PCR

Brain secciones de la corteza frontal y el cerebelo fueron disecados y ARN extraído de la utilización de reactivos Trizol a lo recomendado por el fabricante (Sigma, St Louis, MO), seguida de RT-PCR. Los cebos fueron: 5'-iNOS adelante TGGGAGCCACAGCAATATAG-3 'y 5'-iNOS invertir ACAGTTTGGTGTGGTGTAGG-3', 5'-GFA adelante TCCGCGGCACGAACGAGTC-3 'y 5'-GFA invertir CACCATCCCGCATCTCCACAGTCT-3'; MCSF-R adelante 5 ' - GACCTGCTCCACTTCTCCAG-3 'y MCSF-R revertir 5'-GGGTTC AGACCAAGCGAGAAG-3'; MHCII adelante 5'-CTGATGGCTGCTCATCCTGTGC-3 'y MHCII revertir 5'-TTCTGTTTTCTGTATGCTGTCC-3'; IL-1 β adelante 5'-CCTGTGTAATGAAAGACGGC-3 ' Y la IL-1 β revertir 5'-AAGGGA GCTCCTTCACA TGC-3 '; GAPDH adelante 5'-TCACCAGGGCTGCCATTTGC-3' y GAPDH revertir 5'-GACTCCACGACATACTCAGC-3 '; IL-6 con interés 5'-CAGAAA CCGCTATGAAGT TCC-3' y la IL -6 Revertir 5'-TGTACTCCAGGTAGCTATGG-3 '. TGF-β1 adelante 5'-CAAGTGTGGAGCAACATGTG-3 'y TGF β-1 revertir 5'-CACAGCAGTTCTTCTCT GTG-3', BACE1 adelante 5'-CCGGCG GGAGTGG TATTATGAAGT-3 'y BACE1 invertir 5'GATGGTGATGCGGAAGGACTGATT-3'. ITP se llevaron a cabo sobre el RNA de n = 6 animales en cada grupo, y el representante de geles de 2 animales por grupo se muestran. Condiciones de PCR fueron 35 ciclos (iNOS, GFAP, IL-1 β, TGF-β1, IL-6, MHCII, MCSF-R, BACE1) y 24 cyles (GAPDH), de la desnaturalización a 95 ° C durante 30 años; recocido a 63 ° C De 45 años, y la extensión a 72 ° C durante 45 años utilizando un PX2 (ThermoHybaid, Ulm, Alemania). Productos de PCR se separaron por electroforesis a través de un 2% de agarosa al 0,5 μ g / ml de bromuro de etidio y AlphaInotech imágenes utilizando un sistema de procesamiento de imágenes (Temeculah, EE.UU.).

Determinación de A β

La corteza frontal de ratones transgénicos fueron homogeneizados RIPA buffer (1% Triton, deoxycholate de sodio al 1%, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2) usando un Ultraturrax T25 (Janke y Kunkel, IKA-Labortechnik). A β immunoprecipitated fue de 100 μ g de proteína, utilizando anticuerpos 2964 y perlas de una proteína (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania), separados en el 10-20% Tris tricine geles (Anamed, Darmstadt, Alemania) y trasladado a la membrana de nitrocelulosa. A β se detectó por inmunoblotting con anticuerpos 6E10 (laboratorios Signet Inc, Dedham, MA).

Determinación de la actividad de BACE

La actividad enzimática de la BACE1 se midió en la membrana extractos de la corteza frontal fluorimétrica por reacción a lo sugerido por el proveedor (BACE kit FP002 actividad, la I + D de Sistemas, Wiesbaden, Alemania). Además, la actividad de BACE1 in situ se determinó utilizando cryosections de serie. Secciones se almacenaron a -70 ° C inmediatamente antes del análisis y mantenerse a -20 ° C durante 15 min y 4 ° C por 10 min. Posteriormente, las secciones se incubaron a 4 ° C en PBS más 0,4% TritonX durante 30 min. Después de la adición de 5 μ l de sustrato fluorgenic BACE1 y 100 μ l de buffer 1x sustrato, las secciones fueron incubadas a 37 ° C durante 1 hora. A continuación, las secciones fueron lavadas en PBS y montadas con Mowiol4-88 (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.). BACE1 actividad fue visualizado utilizando un filtro establecido DAPI (Éxodo 340-380, Emis :435-485) y un nivel de luz y microscopio de inmunofluorescencia (Nikon, Eclipse E-800) conectado a una cámara digital (Sony, modelo DXC-9100P, Köln, Alemania) y el sistema a un PC con software de imágenes LUCIA (LUCIA 32G, versión 4,11; Laboratorio de la Imagen, Düsseldorf, Alemania). Adición de un inhibidor de BACE1 sirvió como control a lo descrito previamente [20]. Secciones paralelas se utilizaron para detectar GFAP inmunoticción como se ha descrito anteriormente. Análisis computacional de superposición fue empleada para estimar el colocalisation actividad de BACE1 / GFAP expresión.

Cuantificación de RT-PCR y el inmunoblot resultados

RT-PCR se cuantificó por densitometría de por lo menos 6 animales por edad. Banda intensidades se determinó utilizando el software Image-J (NIH). Los datos fueron analizados por ANOVA con post test de Tukey (Systat, Evanston, EE.UU.).

Resultados

Brain carga de la placa amiloide se determinó en APP [V717I] ratones y totalmente en línea con anteriores estudios [6, 7]. Placas amiloides son indetectables por Thioflavin-S o un β inmunoticción en cerebros de APP [V717I] ratones a los 3 meses de edad, pero eran muy presente en 16 meses de edad ratones transgénicos (Fig. 1A]. Por el Western Blot, péptidos amiloide evidentemente fueron detectados en cerebros de APP [717I] ratones, tanto en las edades (Fig. 1B]. En paralelo, dependiente de la edad se evaluaron cambios inflamatorios en la corteza frontal y el hipocampo por inmunohistoquímica para CD11b y GFA, de marcadores de activación microglial y astrocytic, respectivamente. En 3 meses de edad, los controles de tipo salvaje, agrupadas CD11b indetectable, pero se distribuye de manera uniforme etiquetados ramificado microglia (Figura 1A]. Por el contrario, los cerebros de la APP [V717I] ratones mostraron una focally activado CD11b inmunoticción ya a los 3 meses. Microglial morfología identificado diferentes estados de activación, pero sólo de forma ovalada o redonda que aparecen células fueron cuantificados y que se cuentan como "activado" en el hipocampo y la corteza frontal (Figura 1A, véase el recuadro). En APP [V717I], de 16 meses, aún más pronunciada exceso de microglia activada era evidente en ambas áreas cerebrales (Figura 1B]. En consonancia con la activación microglial, cortical GFA-inmunomarcación fue prácticamente ausentes en los no transgénicos ratones control a los 3 meses (datos no presentados), mientras que APP [V717I] ratones transgénicos han distribuidos al azar focos de astrocitos GFAP expresar firmemente dentro de la corteza y el hipocampo en De esa edad. Aunque la mayoría de los focos positivos para GFAP parecía ser distribuidos al azar dentro de la corteza y el hipocampo, algunos de estos GFAP postive focos se encontraron en torno a los vasos cerebrales. Cuantificación de células GFAP-positivas (Figura 1B] demostró un mayor aumento en el número de astrocitos activados a los 16 meses, en comparación a la edad-no coincide con ratones transgénicos.

Confocal análisis inmunoticción para CD11b en combinación con Il-1 β (Figura 2A] o Il-6 en (Figura 2A] a los 3 meses ya demostró que microglia citocinas producidas tanto en jóvenes APP [V717I] transgénicos. Similares resultados fueron obtenidos por doble tinción para CD11b y MHCII o MCSF-R (no se muestra). En los cerebros de 16 meses de edad APP [V717I] ratones transgénicos, Cd11b positiva y se activan las células microglia predominantemente asociados con placas amiloides como revelado por la co-tinción con un β1-42 (Figura 2B]. Nuevos análisis demuestran que estas células también expresaron microglial Il β-1, IL-6 (Figura 2B], MCSF-R y MHC II (no se muestra). El ARNm que codifica la β Il-1, Il-6, MHC II y MCSF-R ya eran detectables en la corteza frontal del cerebro lisados de 3 meses de edad APP [V717I] ratones transgénicos, mientras que en ausencia de no transgénicos (datos no presentados) y la mayoría Aumentó significativamente en el cerebro de la antigua PAA [V717I] ratones transgénicos a los 16 meses (Figura 2C]. Varias otras citoquinas, es decir, el factor de necrosis tumoral alfa, el interferón gamma, interleucina-10 y la interleucina-4 fueron indetectables en cualquiera de edad (no se muestran los resultados). En contraste, el TGF β-1 los niveles de mRNA mostró un patrón invertido con signifcantly disminución de los niveles en el cerebro de 16 meses de edad, en relación a los jóvenes APP [V717I] ratones transgénicos (Figura 2C].

Análisis de la activación astroglial por doble tinción para β1 A-42 y GFAP demostrado que las células GFAP-positivas eran en su mayoría situados alrededor de las placas amiloides en el cerebro de ratones transgénicos de edad (Figura 3A]. A esta edad un subconjunto de la placa asociada a astrocitos se immunopositive para iNOS en el hipocampo y la corteza frontal (Figura 3B, C]. Confocal de tinción para GFAP y iNOS confirmado que las células fueron positivas iNOS astrocitos (no se muestra), y demostró su estrecha relación espacial de las placas amiloide (Figura 3A]. Además, co-tinción de nitrotirosina y un β reveló un incremento de NO dependiente de la generación de peroxinitrito en las inmediaciones de las placas de amiloide (Figura 3A]. Este resultado fue acompañado de una mayor iNOS mRNA y los niveles de GFAP en el cerebro, de 16 meses de edad APP [V717I] ratones (Figura 3 B, D]. En los cerebros de los ratones transgénicos no, la iNOS mRNA no era detectable (datos no presentados). Remarkebly, activado microglial y astrocytic células fueron colocalized como lo demuestra la doble tinción para CD11b y GFAP, ya en el cerebro de los jóvenes APP [V717I] ratones, lo que sugiere la formación de focos inflamatorios en ambas regiones cerebrales evaluados (no se muestra).

Desde que se demostró que las células neuronales de citoquinas estimulado el aumento de la producción de A β por transcripcional BACE1 sobre regulación in vitro [18], y el segundo citoquinas eran detectables en los sitios de inflamación temprana en jóvenes APP [V717I] ratones, el próximo analizó si temprana focos inflamatorios Iría acompañado de BACE1 expresión. Co-tinción de BACE1 y neuN demostrado que las neuronas expresó BACE1 en los 3 meses de edad APP [V717I] ratones en toda la corteza y el hipocampo, confirmando una observación anterior, en otro modelo de ratón transgénico [21] (datos no presentados). A pesar de que BACE1 se expresó ampliamente, de forma clara y focal neuronal upregulation de BACE1 inmunoticción se observó en el cerebro de la APP [V717I] ratones transgénicos a los 3 meses de edad. Costaining para CD11b y BACE1 o para GFAP y BACE1 mostró que el upregulation se limita principalmente a las neuronas que se encuentran cerca de las CD11b positivas microglia (Fig. 4A]. La naturaleza neuronal de las células que expresan BACE fue confirmado por inmunoticción confocal para el marcador neuronal neuN y BACE 1 (Figura 5]. Posterior cuantificación de las neuronas que expresan BACE1 confirmó que el mayor número de BACE1 células fueron positivas en estrecha distancia a ambos CD11b y GFAP activado micro y astroglial células (Figura 4B].

In situ por fluorescencia de detección de la actividad de BACE1 reveló que el aumento de sitios de BACE1 activación colocalised a GFAP positivos y astrocitos activados (Figura 4C]. Adición de un inhibidor de BACE1 descritas previamente sirvió como control [20] y derogó la señal (datos no presentados). Determinación cuantitativa de la actividad de BACE1 cortical lisados mostraron actividad de la enzima BACE1 que fue significativamente mayor en el cerebro, de 3 meses de edad APP [V717I] ratones en comparación con los controles y que no siga aumentando a los 16 meses (Figura 4D]. Este fenómeno fue acompañado de aumento de los niveles de mRNA BACE1 en la corteza frontal, mientras que al mismo tiempo los niveles de mRNA cerebelosa BACE1 no reveló ninguna regulación significativa (Figura 4E, F]. Combinados, estos datos indican la inflamación asociada a BACE1 aumento de los niveles en el cerebro de los jóvenes, 3 meses de edad APP [V717I] ratones en comparación con la edad no coincide con ratones transgénicos.

Discusión

En AD, la deposición de péptidos amiloides y los ovillos neurofibrilares son invariablemente asociados con un componente inflamatorio, caracterizado principalmente por la activación microglial astrocitos y células. A β péptidos y secretada PFA son potentes activadores de las células de la neuroglia [22]. Una vez activado, las microempresas y astroglia liberar una variedad de citocinas, quimiocinas y de las especies de radicales libres de oxígeno, que pueden contribuir a la disfunción neuronal y la muerte. Además, algunos derivados de neuroglia especificado citocinas también puede aumentar la generación de un β [23]. El descubrimiento de que varias citocinas y aumentar el total de fibrillogenic A β por transcripcional upregulation de BACE1 mRNA, proteína y los niveles de actividad [18] sugiere un mecanismo de retroalimentación por morboso que neurodegenerativas y neuroinflammatory mecanismos de interacción. Activado microglia puede, sin embargo, desempeñan una doble función en la AD, ya que la limpieza de A β a través de la fagocitosis [24] puede ser una ventaja. Para definir la contribución activa de la inflamación en AD, modelos animales experimentales que se necesitan tanto la recapitular neurodegenerativas y los componentes inflamatorios de la enfermedad.

Considerando que modelos de ratones transgénicos son ampliamente utilizados para el estudio de procesamiento de APP, sólo un número limitado de estudios ha abordado neuroinflammation en estos animales, produciendo resultados, en parte, polémico. Así, APP695 ratones transgénicos entre 2 a 14 meses no revelaron ARNm de varias citocinas incluyendo Il-1 α y β, Il-6, Il-10, Il-12 e IFN γ por ribonucleasas protección de ensayo [25]. En el mismo estudio, no obstante, Il-1 β-astrocitos positivos se detectaron en las proximidades de los depósitos amiloides en ratones de más edad, mientras que para inmunohistoquímica TNF α, α Il-1, Il-6, MCP-1 y fue negativo. En cambio, TNF α mRNA se hizo evidente tan pronto como 6 meses [26] y IFN γ e Il-12 ARNm y proteínas fue detectado por hibridación in situ e inmunohistoquímica en 9 meses de edad APP695 ratones transgénicos [27]. Además, Il-1 β, TNF α y Il-10 fue detectada por inmunohistoquímica en animales a los 12 y 13 meses de edad [28, 29]. Las diferencias se informó en la misma cepa de ratones transgénicos APP pueden ser causadas por diferentes técnicas empleadas y demuestran las dificultades encontradas en la evaluación de los cambios inflamatorios en el cerebro de este modelo de ratón.

En contraste con estos estudios, el presente trabajo reveló un aumento significativo en focally activado microglia células que expresan citocinas como Il-1 y β-6 Il ya a los 3 meses, que fue acompañado de los niveles de mRNA de β Il-1, Il-6, MHC II y MCSF-R. A esta edad, estos APP [V717I] ratones aún no depósito amyloidogenic A β péptidos que se han verificado por la completa ausencia de immunopositive y Thioflavin-S-placas positiva, lo que confirma los resultados previos [6, 7]. Microglial focos parecían estar distribuidos al azar en la corteza y el hipocampo, de 3 meses de edad ratones transgénicos APP. Sin embargo, desde un total de los niveles de β ya eran detectables a esta edad y fragmentos solubles actúan también como potentes estimuladores de la secreción de citoquinas microglial [30], un solubles secretadas β junto con APP [22] puede causar esta primera activación microglial mucho antes de amyloidogenic fragmentos depósito.

Es sumamente interesante observar que la política de asociación activa [V717I] ratones transgénicos desarrollar deterioro cognitivo, disminución de la potenciación a largo plazo (LTP) y neophobia ya a los 3 meses de edad [6]. Es importante señalar que este fenómeno no se correlaciona con la APP isoforma expresada ni con los niveles de un solo metabolito APP [6]. Porque citoquinas incluyendo Il-1 y β-6 Il directamente afectar la función neuronal y reprimir el hipocampo LTP [31, 32] los datos actuales nos permiten proponer que la pronta y coordinadores de eventos inflamatorios contribuyen a la disfunción neuronal en esta edad. Los focos además contienen todos los ingredientes necesarios para generar péptidos amiloide y de manera provisional se identificó como "el nacimiento de los lugares" de placas amiloides, como consecuencia de un círculo viscious inculcado por péptidos amiloides y los factores inmuno-modulador.

Coordinadora de microglia activación fue rodeada por astrocitos GFAP-positivas en los ratones jóvenes, pero los niveles de ARNm de GFAP fueron casi indetectable a los 3 meses [33]. Sin embargo, GFAP y iNOS mRNA niveles detectables convirtió en ratones transgénicos a los 16 meses indicando astrocytic fuerte activación. El aumento de los niveles de ARNm de GFAP fueron acompañadas de un aumento del número de GFAP-positivas y expresar iNOS astrocitos. Es importante destacar que, iNOS mRNA y los niveles de proteína son detectables en los controles no transgénicos y jóvenes en APP [V717I] ratones. Además, la expresión de la iNOS en una placa β-astrocitos se asocia acompañado de un aumento de la tinción de nitrotirosina que indica una mayor generación de NO dependiente peroxinitrito. Porque iNOS expresión y el aumento de la tinción de nitrotirosina se ha atribuido a la AD antes de [34, 35], APP [V717I] ratones también se asemejan a este aspecto de la neurodegeneración inducida por inflamación gliales. En contraste con otras citocinas, TGF β-1 disminuyó los niveles de mRNA en el envejecimiento APP [V717I] cerebro de ratón. Porque TGF β-1 actúa principalmente como un anti-inflamatorio de citoquinas, la pérdida relacionada con la edad, puede facilitar la observada neuroinflammation.

Desde que la más reciente mostró que varias citocinas, solo y potentemente en concierto, el aumento de un β40 y un β42 niveles transcripcional por upregulation de BACE1 [18], hemos probado y demostrado que la microglia derivados de la generación de citoquinas inflamatorias a principios de los focos estuvo acompañado por BACE1 upregulation en el cerebro De los jóvenes APP [V717I] ratones transgénicos. A los 3 meses de edad, BACE1 expresión se limita exclusivamente a las neuronas que confirma por estudios en sidad hibridación Tg2576 en ratones PDAPP y [36, 37]. Sin embargo, en las dos principales regiones del cerebro, es decir, el hipocampo y la corteza, el aumento neuronal BACE1 expresión parece ser agrupadas. Costaining con CD11b o GFAP y la posterior cuantificación demostrado que neuronal BACE1 expresión es upregulated muy cerca de astrocitos y microglia activada. Independientemente de si los mediadores de la inflamación o sitio β-APP-división productos derivados se producen en primer lugar, los principios de coordinación y presencia de immunoactive microglia, citoquinas y la expresión de las neuronas-BACE puntos firmemente a la interacción entre neurodegenerativas y neuroinflammatory eventos. En consonancia con este hallazgo, el hipocampo BACE1 niveles de mRNA fueron significativamente superiores en 3 meses APP [V717I] frente a los transgénicos no ratones transgénicos y este fenómeno fue acompañado de un fuerte incremento BACE1 actividad enzimática determinado a partir de lisados cerebro. En ratones de edad BACE1 expresión también fue detectado en astrocitos activados como Tg2576 observado en ratones, pero no diferentes de ratones transgénicos no [21]. Sin embargo, el hecho de que los cambios observados de los niveles de ARN BACE1 son más altos que los observados para la actividad; paralelos anteriores resultados in vitro [18] y puede indicar que BACE1 actividad está regulada no sólo por la transcripción de genes, sino en múltiples pasos de entonces. Curiosamente, los niveles de mRNA BACE1 no cambió de forma significativa entre los 3 y 16 meses de edad en APP [V717I] transgénicos. Si bien el presente estudio no se determinó la causa de este fenómeno, que puede ser la hipótesis, que irregardeless de mayores niveles de mediadores inflamatorios presentes en 16 meses, es posible que (i) el total de espectro en favor de los mediadores inflamatorios y antiinflamatorios es Más o igual de permisivo BACE 1 upregulation a una edad muy temprana, o (ii) el aumento de citoquinas pro-inflamatorias en edades más avanzadas se acompañan de contrarrestar las moléculas anti-inflamatorios, lo que arroja un neto similar inducción de la BACE1. Además, varios otros mecanismos puede dar cuenta de la casi igualdad de los niveles de la BACE1 mRNA a los 3 y 16 meses de edad, incluyendo una activación transcripcional insensibilizados, un nuevo equilibrio entre la producción y la degradación de la BACE1 transcripción una edad más avanzada o una menor contribución de la enfermedad afecta las neuronas En la proximidad a las placas amiloides.

Conclusión

APP [V717I] ratones transgénicos modelo no sólo los fines de la patología amiloide en parenchym y vasculatura como AD en los pacientes, pero también exhiben muchos parámetros inflamatorios atribuirse a la AD patología. La pronta y neuro-focal, se ponen de manifiesto los cambios inflamatorios aquí para ser parallelled de cerca por upregulated neuronal BACE1 ARNm y la expresión de la proteína y por el aumento de actividad de la enzima BACE1, ya en ratones transgénicos APP jóvenes, antes de que la deposición amiloide es evidente. El círculo vicioso de la APP división proteolítica dando lugar a soluble y amyloidogenic inmunitario, provocando la activación microglial, la generación de citoquinas, está cerrado por la upregulation de BACE1, en última instancia, aumentar aún más la tramitación APP. Este ciclo parece actuar localmente, en nidi focal de la enfermedad que podría representar los lugares de origen de las placas amiloides, ya presente a principios del proceso de la enfermedad en el cerebro de ratones transgénicos APP jóvenes.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Michael Heneka: concepción y diseño, inmunomarcación, adquisición de datos, la interpretación, el artículo escrito

Magdalena Sastre: concepción, BACE1 mediciones

Lucía Dumitrescu-Ozimek: Inmunomarcación, adquisición de datos

Ilse Dewachter: amiloide determinación

Jochen Walter: BACE1 mediciones in situ,

Thomas Klockgether: concepción y diseño,

Fred Van Leuven: concepción y diseño, análisis e interpretación de datos

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft de Investigación Grant (SFB 400, A8) y el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen (FWO-Vlaanderen), la KULeuven GOA-Fondo de Investigación y KULeuvenR & D. Damos las gracias a Christian Haass para generoso regalo de BACE-1 anticuerpo.