Particle and Fibre Toxicology, 2005; 2: 9-9 (más artículos en esta revista)

ROS mediada genotoxicidad de asbesto-cemento en el pulmón de células de mamíferos in vitro

BioMed Central
Elke Dopp (elke.dopp @ uni-essen.de) [1], Santosh Yadav (santyadava2002@yahoo.co.in) [2], Furquan Ahmad Ansari (ansari@yahoo.co.in) [2], Kunal Bhattacharya (Kbmail1@rediffmail.com) [1], Ursula von Recklinghausen (ursula.von.recklinghausen @ uni-essen.de) [1], Ursula Rauen (ursula.rauen @ uni-essen.de) [3], Klaus Rödelsperger (Klaus.Roedelsperger @ arbmed.med.uni-giessen.de) [4], Behnaz Shokouhi (nazsh76@yahoo.com) [1], Stefan Geh (StefanGeh@web.de) [1], Qamar Rahman (qamar_15 @ Sify.com) [2]
[1] Instituto de Higiene y Medicina del Trabajo, Hospital de la Universidad de Essen, Alemania
[2] Fibre División de Toxicología, Centro de Investigación de Toxicología Industrial, Lucknow, India
[3] Instituto de Química Fisiológica, Hospital de la Universidad de Essen, Alemania
[4] Instituto de Medicina Ocupacional, Hospital de la Universidad de Giessen, Alemania

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Resumen

El amianto es un agente carcinógeno conocido y co-cancerígeno. Es un riesgo que persiste en nuestra vida cotidiana debido a su uso en materiales de construcción como el amianto-cemento en polvo. El presente estudio realizado sobre V79-células (células pulmonares de hámster chino) demuestra el potencial genotóxico y citotóxico de asbesto-cemento en polvo (ACP) en comparación con el amianto crisotilo. Un co-exposición de crisotilo y de los países ACP fue probada usando la prueba de la viabilidad celular y el ensayo de micronúcleos. Kinetochore El análisis se ha utilizado para analizar la vía de causar tales efectos genotóxicos. Ácido tiobarbitúrico sustancias de reacción se determinaron como prueba para la producción de especies reactivas del oxígeno. Ambos, cemento amianto crisotilo, así como formó y micronúcleos inducidos por la pérdida de viabilidad celular en una concentración-y tiempo-dependiente. Resultados de análisis y TBARS quelante del hierro experimentos mostraron la inducción de radicales libres en ACP-crisotilo expuestos y culturas. CaSO 4 que parecía ser una entidad insignificante en el aumento de la toxicidad potencial de los países ACP. La exposición de los compañeros de ambos, los países ACP y el crisotilo, mostró un efecto aditivo en el aumento de la toxicidad. El estudio sugiere que el amianto-cemento es citotóxica, así como genotóxico in vitro. En comparación con el crisotilo la magnitud de la toxicidad fue menor, pero el aumento de la exposición conjunta de la toxicidad de ambos.

Antecedentes

El amianto ha sido bien documentada a ser un agente carcinógeno y co-carcinógeno asociado con la inducción de mesotelioma, cáncer de pulmón y otras enfermedades pulmonares benignos [1, 2]. 'Asbestos' es un término genérico para un grupo de seis natural de silicatos fibrosos. Se agrupan en dos grandes clases: Serpentine, que contiene un silicato de magnesio y anfíbola llamado crisotilo, que incluye la crocidolita, amosita, antofilita, actinolita y tremolita [3]. El asbesto se ha utilizado en más de 3000 productos, debido a su alta resistencia a la tracción, resistencia a la acidez relativa y la temperatura, variando las texturas y grados de flexibilidad. No evaporar, disolver, quemar, o someterse a importantes reacciones con otros productos químicos, que hacen que el amianto no biodegradables y ambiental acumulativo. Más del 95% del total de uso comercial de amianto en todo el mundo es amianto crisotilo [4]. El crisotilo tiene la morfología de ser rizado y flexible [5]. Tamaño, la geometría, la composición química y de superficie cargo de los diversos tipos de amianto desempeñar un papel importante en la interacción con las células que conducen a la lesión celular y la enfermedad [6, 7]. Alteración respiratoria, asma bronquial, la bronquitis crónica se observó en la fábrica de asbesto cemento trabajadores [8]. Sin embargo, en el caso del amianto crisotilo, su carga superficial positiva es más importante que su morfología en la prestación de un tóxico y potencial lítico [9]. El contenido de hierro en el crisotilo, principalmente presente como contaminante de superficie [7] es baja (~ 1-6%), pero ha de tenerse en cuenta en su toxicidad.

Fibras de amianto en el medio ambiente puede ser el resultado de la minería, la molienda y la erosión de las rocas con el amianto, y de la fabricación, el desgaste, y la eliminación de productos que contienen amianto [10]. Debido a la extensión del uso del asbesto, sus fibras son omnipresentes en el medio ambiente. Salas de aire puede contaminarse con fibras liberadas de los materiales de construcción, especialmente si están dañados o derrumbando. Común de las fuentes de asbesto en los hogares son los techos, aislamiento de tuberías, cubiertas de calderas, pared, piso, techo de tejas, hojas, tubos y jointings, etc productos de asbesto-cemento, por ejemplo, tejas, contienen hasta un 11-12% del amianto crisotilo . Como resultado de la continua exposición a la intemperie y de la lluvia ácida, la superficie de productos de asbesto-cemento se convierte en corroídos y degradado. Partículas de cemento, las fibras de amianto y los aglomerados de partículas y de fibras, por lo tanto, son liberados de la superficie y pueden ser dispersos en el aire y el agua en grandes cantidades [11].

La toxicidad del amianto se caracteriza por una serie de procesos, entre los cuales la producción de reactivos de oxígeno y nitrógeno especies reactivas (ROS y RNS) se consideran las más importantes. Altamente especies reactivas del oxígeno, como el radical hidroxilo pueden ser producidos a través de Fenton-tipo de reacción catalizada por impurezas de hierro presente en la superficie. ROS / RNS también se produce en los pulmones por la reacción inflamatoria crónica producida por la prolongada actividad fagocitaria de los macrófagos contra el bio-fibras persistentes [12]. ROS / RNS puede causar distintos tipos de daños del ADN. Los más ampliamente estudiados son la lesión de 8-oxodeoxyguanosine (8-oxodGuo) o la correspondiente base (8-oxoGua). Esta variación de los nucleótidos puede ser detectado en el ADN de las líneas celulares de origen humano o animal después del tratamiento con las fibras de amianto [13, 14].

Smailyte et al. [15] analiza el riesgo de cáncer en trabajadores de la producción de cemento lituano y encontró que la exposición al polvo de cemento puede aumentar el cáncer de pulmón y vejiga. Él informó, además, una dosis de riesgo relacionados con el cáncer de estómago. Fátima et al. [16] han informado de anomalías cromosómicas en trabajadores de la fábrica de asbesto cemento. Rahman et al. [17] encontraron aberraciones cromosómicas, intercambio de cromátidas hermanas y la formación de micronúcleos en los linfocitos de sangre de los trabajadores de la fábrica de cemento de amianto en comparación con sus controles. Dušinská et al. [12] investigó el daño cromosómico y de ADN amianto en la antigua fábrica de cemento de los trabajadores. Como se ha señalado anteriormente el crisotilo es el más explotado comercialmente variedad de amianto y utilizan principalmente como amianto-cemento para la construcción de material. No son muchos los estudios que evalúan la cito-y genotoxicidad de fibrocemento in vitro utilizando líneas celulares. En el presente estudio, hemos investigado si asbesto-cemento provoca efectos similares en relación con los sistemas celulares citotoxicidad y la genotoxicidad de amianto crisotilo. El ensayo de micronúcleos, se aplicó la prueba de los efectos genotóxicos de asbesto cemento en V79-células (células pulmonares de hámster chino), un modelo de cultivo celular establecida. Aplicación de kinetochore análisis, mediciones y radical quelante del hierro experimentos dieron más información acerca de la mecánica de fondo, que parece estar basado en la formación de radicales libres.

Resultados

Microscopía de luz reveló el porcentaje medio de los tamaños de fibra de asbesto-cemento en las muestras a ser el 50,3% (<5 - 10 μ m), 31,2% (11-20 μ m) y el 18,5% (21 - 30 μ m) y el 49,7% en el crisotilo ( <5 - 10 μ m), 30,7% (11 - 20 μ m) y el 19,5% (21 - 30 μ m) (Tabla 1]. El potencial citotóxico de asbesto cemento, amianto crisotilo y CaSO 4 (control negativo) fue determinada después de un tiempo de exposición de 24, 48 y 72 hrs. Los resultados muestran una disminución de la viabilidad celular y de la ACP-el crisotilo-V79-células expuestas al aumentar la fibra y las concentraciones de polvo y tiempos de exposición. Los resultados mostraron crisotilo a ser más citotóxica que la ACP después de 24, 48 y 72 horas de exposición (Figura 2]. CaSO 4 se consideró insignificante citotóxicos hasta la concentración más alta (20 μ g / cm 2), y tampoco tiene ningún efecto en tiempos de exposición más.

La Figura 3 muestra el nivel de indujo micronúcleos (MN) de la ACP en las células V79-a los 24, 48 y 72 horas consecutivamente a una concentración de 1, 3, 5 y 10 μ g / cm 2 de la ACP. ACP inducida por un número significativo de células en todos los micronucleated concentraciones aplicadas después de 24 horas y 48 horas de exposición con la más alta inducción a 5 μ g / cm 2 después de 24 hrs. El reducido número de MN después de 72 horas de exposición se puede explicar por el aumento de efectos citotóxicos en la aplica-ACP concentraciones. Al comparar la ACP al crisotilo inducida por este último a una concentración de 1 μ g / cm 2 en casi igual número de MN ACP como a una concentración de 3 μ g / cm 2 (p <0,01). Los resultados de un co-exposición de los países ACP (3 μ g / cm 2) y el crisotilo (1 μ g / cm 2) se muestran en la figura 4. Efectos aditivos puede verse a través de un aumento de formación de MN en comparación con la inducción de los países ACP (3 μ g / cm 2) o crisotilo (1 μ g / cm 2) por sí sola. La diferencia entre los países ACP o crisotilo por sí solo y co-V79-células expuestas es estadísticamente no significativo.

Kinetochore El análisis reveló un leve aumento en kinetochore-negativos micronúcleos en las células expuestas a los países ACP (3 μ g / cm 2), el crisotilo (3 μ g / cm 2) y co-exposición de los países ACP (3 μ g / cm 2) y el crisotilo (1 Μ g / cm 2), indicando clastogénico eventos (p <0,05). Sin embargo, las diferencias en comparación con el control sin tratar son estadísticamente no significativos. CaSO 4 inducida por una cantidad insignificante de micronúcleos kinetochore-negativos, que es casi igual a los controles. Co-exposición de los países ACP y de crisotilo indujo micronúcleos kinetochore-negativos casi igual a la inducida por el crisotilo (1 μ g / cm 2) solo (cuadro 3].

Además de los quelantes del hierro 2,2 '-DPD y desferal reducido el número de micronúcleos inducidos (véase la Fig. 4] para el nivel de control o incluso inferior (Figura 5]. Los quelantes del hierro 2, 2 'DPD desferal y son capaces de prevenir la formación de radicales en los sistemas celulares gratis por complejación de los iones de metal y de hierro. Un fuerte efecto en la reducción de MN-formación se puede observar en el crisotilo-V79 células expuestas al amianto cemento en comparación expuestos células (Fig. 5A]. Sin embargo, la aplicación de desferal inducida más fuerte en la reducción de los efectos expuestos ACP-V79-células (Fig. 5B]. Esta reducción es estadísticamente significativa (p <0,05).

La formación de TBARS se detectó en los países ACP, el crisotilo y co-expuestos (ACP y crisotilo) V79-células (Figura 6]. Fe/8HQ (1,6 μ l / ml) se utilizó como control positivo y TBARS inducida por la formación de hasta 0,25 nmol / mg de proteína. Después de 24 horas de exposición a la ACP o el crisotilo, V79-células comenzaron a liberar los bajos niveles de TBARS, en la que una mayor cantidad de tiempos de exposición más de 36 h (0,063 nmol / mg, ACP) y 48 h (0,089 nmol / mg, el crisotilo), Respectivamente. Se observó un retraso en la formación de TBARS después de co-V79-exposición de las células a los países ACP y el crisotilo a las 72 h el tiempo de exposición (0,089 nmol / mg) (Figura 6].

Discusión

El presente estudio demuestra un tiempo-dependiente de la concentración y la pérdida de la viabilidad celular en el crisotilo-V79-células expuestas. Estos resultados están de acuerdo a las que se encuentran y por Choi Hong [18] en las células-V79. El análisis de genotoxicidad utilizando micronúcleos (MN) como bioindicador demostrado que el crisotilo dio un máximo daño a las células en concentraciones relativamente bajas. Observaciones similares se encuentran también en nuestros estudios anteriores realizados con humanos células mesoteliales (HMC) [19 - 21] y humanos de linfocitos de sangre periférica [22]. Los estudios sugieren que clastogénico factores son responsables del efecto genotóxico se muestra como negativo kinetochore-MN. En el pasado Dopp et al. [23], y Dopp Schiffmann [24], Rahman et al. [3] y Poser et al. [21] han demostrado que clastogénico eventos causados por el crisotilo son responsables de la formación de micronúcleos en diferentes tipos de células. Los resultados de los análisis de TBARS en el presente estudio fortalecerse aún más crisotilo clastogénica inducida por los acontecimientos que sugiere la liberación de radicales libres. El presente estudio mostró AC inducida por la liberación de TBARS (pruebas de la peroxidación lipídica) después de 24 - 48 horas de exposición. La mayor cantidad de MN en la inducción de las células V79-se encuentran también en este período que demuestra una interrelación entre estas dos características. En el caso del amianto crisotilo, el retraso en la liberación de TBARS (> 24 horas de exposición), también se observa. Estos resultados están en concordancia con los resultados de Burmeister et al. [25]. Estos autores no observaron un aumento de Fpg-sensetive indicativo de los sitios oxidativo del ADN-base en la modificación de amianto tratado con células mesoteliales humanos hasta un tiempo de exposición de 24 horas. Abidi et al. [26] Afaq y et al. [27] informó acerca de la producción de grandes cantidades de TBARS y alteración de la GSH redox sistema de las fibras de crisotilo. Kopnin et al. [28] demostraron que los fibroblastos, así como las células mesoteliales son capaces de generar especies reactivas de oxígeno (ROS) en respuesta a la exposición al amianto mientras que los fibroblastos tienen una menor capacidad de producción de ROS en comparación con las células mesoteliales.

ACP citotoxicidad inducida pronunciada y genotoxicidad en células V79-, a pesar de sus efectos tóxicos son más bajo que el del crisotilo, tanto en la dosis de inducción y de los niveles. Tilkes y Beck [29] informó de conclusiones similares sobre los macrófagos en la que el asbesto cemento causado baja citotoxicidad de la UICC-crisotilo. La exposición a concentraciones de los diferentes países ACP mostró una mayor formación de micronúcleos en las células-V79.

El co-V79-exposición de las células a los países ACP y el crisotilo dado lugar a un débil efecto aditivo. Sin embargo, la cantidad de negativos inducidos kinetochore-MN no varió mucho de que los inducidos por el crisotilo. En resumen, se puede afirmar que tanto los países ACP y el crisotilo tienen propiedades citotóxicas y genotóxicas. Sin embargo, la toxicidad de crisotilo es más pronunciada que la de los países ACP. El co-exposición (ACP y crisotilo) de las células V79-mostró débil aditivo efectos genotóxicos. La liberación de TBARS en ACP-crisotilo y células expuestas V79-sugiere la participación de los radicales libres en las fibras del polvo de la toxicidad inducida.

Métodos
Fibras y muestras de polvo

Polvo de asbesto cemento (ACP) ha sido preparado de hoja de asbesto cemento por molienda con mortero y pestle (Centro de Investigación de Toxicología Industrial, Lucknow, India). El principal tipo de fibras de amianto en el Consejo de Ministros ACP-muestra es el amianto crisotilo (12,8% fibras / muestra, Tab. 1]. La muestra fue tamizada a través de un 30 μ m latón tamiz. La esterilización se llevó a cabo a 120 ° C por 2 horas (h.), y las muestras se suspendieron en PBS estéril de amortiguación. Las suspensiones se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (Hitachi H600) según fibrosas y no fibrosas material y el número de fibras / ml se calcularon de acuerdo con las normas de 3492 de VDI (Richtlinie VDI, 1994) (Tab. 2]. Además de fibras y de partículas de los análisis se realizaron utilizando microscopio de luz [30] y el microscopio electrónico de transmisión (TEM, Phillips). TEM fotos de asbesto-cemento crisotilo y las muestras se muestra en la Fig. 1 (magnificación: 2000 ×). El gran conglomerado no fibrosas material en la Fig. 1A representa aglomerados de partículas de cemento.

Una última concentración de polvo de asbesto cemento (ACP) en PBS (buffer fosfato salino), de 1,1 mg / ml fue utilizado. El crisotilo (UICC) y disponible en el comercio CaSO 4 (Sigma, Taufkirchen, Alemania) se aplicaron como controles positivos y negativos, respectivamente.

Cultivo de células

V79-células (fibroblastos de hámster chino de pulmón de células) se obtuvieron a partir de ECC (European Collection of Cell Cultures, CEC N º: 86041102). Las células fueron cultivadas en RPMI-1640 (Gibco) con Becerro de suero fetal (10%) (Gibco), L-glutamina (1%) (Gibco) y antibióticos (100 U / ml penicilina y 100 μ g / ml estreptomicina) (Gibco) A 37 ° Cy 5% de CO 2.

Citotoxicidad de prueba

V79-células (estado de confluencia: máx. 70%) fueron tratados con los países ACP, CaSO 4 y el crisotilo, respectivamente, en diferentes dosis (1 μ g / cm 2 - 10 μ g / cm 2) durante 24 horas, 48 horas y 72 horas . Viabilidad celular fue evaluado inmediatamente después de la exposición. Con y sin células fueron cosechadas por tratamiento de tripsina (Sigma). Se realizó el recuento de células después de la tinción de azul de tripan. La suspensión celular fue mezclado con un volumen equivalente de 0,4% azul de tripan solución (Sigma) y posteriormente evaluados bajo el microscopio de luz. La membrana de las células muertas es permeable al azul de tripan (células teñidas de color azul), mientras que las células vivas permanecen unstained. Viabilidad celular se expresa como porcentaje de células supervivientes en comparación con el número total de células. Una sustancia se considera citotóxica si la disminución de la viabilidad celular es ≤ 50%.

Ensayo de micronúcleos y análisis kinetochore

Por micronúcleo (MN) el análisis, 2 × 10 5 células V79-Se sembró en cada uno de los pocillos de Quadriperm-platos (Viva-Ciencia, sartorio, Göttingen, Alemania) y cultivadas de la noche a la mañana. Luego, la fibra y el polvo se aplicaron las muestras de 24 horas, 48 horas o 72 horas en diferentes concentraciones. Al final de los tiempos de exposición y las células fueron fijadas metanol almacenado en frío (-20 ° C) durante al menos 30 minutos antes de la tinción. Para el ensayo de micronúcleos de las células fueron lavadas con PBS / CMF (calcio y magnesio, fosfato libre salina tamponada) y los núcleos se tiñeron con bisbenzimide (Hoechst 33258, concentración: 5 μ g / ml, 4 minutos). Las diapositivas fueron montadas para microscopía de fluorescencia y examinados para detectar la presencia de micronúcleos. Cada punto de datos representa el promedio de 3 tratarse de culturas diferentes experimentos con 2000 núcleos evaluados en cada caso. La significación fue probada usando la prueba de Chi 2.

Para mayor análisis de los micronúcleos inducidos de las células después del tratamiento con ACP o crisotilo, kinetochores se tiñeron al incubar los preparativos fijo de células con anticuerpos CREST (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.) por 1 hora en un humidificado cámara a 37 ° C. Después de enjuagar con PBS con 0,5% de Tween 20 (Sigma, Alemania), las células fueron incubadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugado IgG anti-humano (anticuerpos Incorporated, Davis, EE.UU.) durante 30 min antes de aplicar bisbenzimide. Al menos 200 micronúcleos fueron examinados para la presencia de kinetochores en cada caso. La significación fue probada usando la prueba de Chi 2.

Aplicación de quelantes del hierro

Los quelantes del hierro 2,2 '-dipyridyl (DPD) (Fluka, Alemania) y desferal (Novartis, Alemania) fueron utilizados para investigar la reducción de la partícula genómica inducida por efectos vinculantes para metal / iones de hierro. De esta forma, la formación de radicales libres puede reducirse. DPD (concentración final: 100 μ M) y desferal (concentración final: 10 mM) disueltos en ddH 2 O, y añadió que el medio de cultivo. El tratamiento de las células con DPD o desferal se realizó simultáneamente con la fibra / polvo de tratamiento (concentración: ACP 3 μ g / cm 2, el crisotilo 1 μ g / cm 2, CaSO 4 como control negativo 3 μ g / cm 2, el tiempo de exposición: 48 hrs ).

Radical medición

Ácido tiobarbitúrico sustancias de reacción (TBARS) se determinaron como indicación para la formación de especies reactivas del oxígeno. TBARS se determinó en el sobrenadante después de varios tiempos de incubación. V79-células fueron cultivadas en Ham's F12 medio de cultivo para las 24 horas. Las células fueron entonces expuestos al asbesto cemento (3 μ g / cm 2), el crisotilo (1 μ g / cm 2) o amianto crisotilo en el cemento y el co-exposición durante 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, y 72 h. Las células cultivadas en medio Ham's F12 se utilizaron como control negativo. Después de los diferentes tiempos de exposición, 1 ml de la sonda se mezclan con 200 μ l de ácido trichloracetic helado (30%) para precipitar la proteína y posteriormente se centrifuga a 10000 rpm durante 5 min. Además, el 1 ml de sobrenadante se incubó con 500 μ l de ácido tiobarbitúrico (1%) en un baño de agua a 95 ° C durante 10 min. Después de la centrifugación a 3000 rpm durante 5 min, la absorbancia del sobrenadante se midió en un espectro fotómetro de 532 nm. La cantidad de TBARS formado se expresó como malondialdehido (MDA) equivalentes en el sobrenadante. La concentración de la TBARS se calculó una curva de calibración (estándar de fondo: 1, 1, 3, 3-tetramethoxypropane, Sigma, Alemania). El estudio fue realizado en los duplicados.

Análisis estadístico

La prueba de chi-2 se utiliza para la comparación de los resultados de micronúcleos y kinetochore con el control sin tratar en cada conjunto de experimentos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

QR tuvo la idea inicial de realizar las investigaciones junto con ED, que había coordinado el experimento y ha editado la versión final del manuscrito. SY y SG han llevado a cabo los estudios de genotoxicidad. KB había redactado el manuscrito y BS había participado con él en los diferentes estudios de genotoxicidad con quelantes del hierro. UvR ha realizado estudios de la citotoxicidad y la TBARS de ensayo con la ayuda de la UR. FAA había hecho la luz estudio microscópico de las muestras. Por último, KR había hecho el estudio a través de microscopía electrónica de las muestras. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Gabriele Zimmer, Ute Zimmermann y Mohd. Ashquin por su excelente asistencia técnica. También damos las gracias al Director del Centro de Investigación de Toxicología Industrial, Lucknow, y Desarrollo de Recursos Humanos del Consejo de Investigación Científica e Industrial, la India, para el suministro de servicios. Los autores gracias Prof Dr Gerrit M. Alink (Universidad de Wageningen, Países Bajos) para la lectura crítica del manuscrito.