Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 23-23 (más artículos en esta revista)

A principios de correlación de activación microglial con mayor factor de necrosis tumoral-alfa y monocitos chemoattractant proteína-1 de expresión específicamente dentro de la corteza entorrinal triple transgénico de la enfermedad de Alzheimer ratones

BioMed Central
Michelle C Janelsins (michelle_janelsins@urmc.rochester.edu) [2], Michael A Mastrangelo (michael_mastrangelo@urmc.rochester.edu) [3], Salvatore Oddo (soddo@uci.edu) [4], Frank LaFerla M (laferla @ Uci.edu) [4], Howard J Federoff (howard_federoff@urmc.rochester.edu) [1], William J Bowers (william_bowers@urmc.rochester.edu) [1]
[1] Department of Neurology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, New York 14642, USA
[2] Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, New York 14642, USA
[3] Center for Aging and Developmental Biology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, New York 14642, USA
[4] Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, California 92697, USA

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Resumen
Antecedentes

La enfermedad de Alzheimer es una compleja enfermedad neurodegenerativa caracterizada patológicamente por un temporal y espacial progresión de la beta-amiloide (A β) deposición, neurofibrilares enredo formación, y la degeneración sináptica. Procesos inflamatorios han estado implicados en la iniciación y / o propagación de AD-patología asociada en el cerebro, como expresión de citoquinas inflamatorias y otros marcadores de inflamación, se pronuncian en los individuos con AD patología. El estudio actual examina si los procesos inflamatorios son evidentes en una fase temprana del proceso de la enfermedad en la 3xTg-AD modelo de ratón, y si las diferencias regionales en los perfiles inflamatoria existen.

Métodos

Coronal cerebro secciones fueron utilizados para identificar en un β 2, 3, y 6 meses 3xTg-AD y no de control de ratones transgénicos. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó en microdissected hipocampo y corteza entorrinal tejido, de 2, 3 y 6 meses 3xTg-AD y no ratones transgénicos. Microglial / macrófagos se cuantificó el número de células usando imparcial estereología en 3xTg-AD y no transgénicos hipocampo y corteza entorrinal que contengan secciones.

Resultados

Observamos humanos β Un depósito a los 3 meses en 3xTg-AD ratones, que es mayor a los 6 meses de edad. Curiosamente, se observó un 14.8 veces sobre regulación de TNF-α y 10,8 veces sobre regulación de MCP-1 en la corteza entorrinal de 3xTg-AD ratones, pero no se detectó en el tiempo en el hipocampo o en cualquiera de la región No ratones transgénicos. Además, este aumento correlacionado con un aumento de los macrófagos y microglia F4/80-positive en 3xTg-AD corteza entorrinal.

Conclusión

Nuestros datos proporcionan pruebas para principios de la inducción de los procesos inflamatorios en que se desarrolla un modelo de amiloide y neurofibrilares enredo patología. Además, nuestros resultados vínculo procesos inflamatorios en la corteza entorrinal, que representa uno de los primeros afectados AD-regiones del cerebro.

Antecedentes

Enfermedad de Alzheimer (EA) es una relacionada con la edad, los trastornos neurodegenerativos asociados con la progresiva disminución funcional, la demencia y la pérdida neuronal. Demografía, evidencian que la prevalencia de la EA aumentarán sustancialmente en las próximas décadas. Los pacientes presentan inicialmente una incapacidad para asimilar nueva información y de la evolución de la enfermedad, tanto declarativo y nondeclarative memoria es cada vez más profundamente afectada [1]. El omnipresente carga económica y social creado por esta enfermedad debilitante debe proporcionar incentivos suficientes para el desarrollo de la nueva historia natural de la modificación de los enfoques terapéuticos. Sin embargo, debido a que la mecánica de AD son bases no del todo comprendidas, el amplio espectro de la enfermedad clínica, y los rasgos neuropatológicos de su iniciación y progresión limitada, el desarrollo de este tipo de terapias potenciales modificadores de la enfermedad ha sido relativamente limitado.

Las características patológicas de la AD cerebro proteínico incluyen depósitos extracelulares (placas), compuesto en gran medida de amiloide beta (A β) péptidos, y los ovillos neurofibrilares intraneuronal (NFTs), que se caracterizan por una excesiva fosforilación de la proteína tau. Otros relacionados con la AD histopatológico características incluyen, pero no están limitados a, astrogliosis, activación microglial, y la reducción de la integridad sináptica. Estas características parecen surgir en una región del tiempo y de forma dependiente (revisado en [2]]. Amiloide patología evoluciona por etapas: principios de participación es anatómicamente circunscrito a la basal neocortex, la mayoría de las veces dentro de poco mielinizadas temporal; progresión implica neocortical zonas adyacentes, la formación hipocámpica, perforant trayectoria que incluye su coursing a través de la subiculum y en la terminación de las capas moleculares El giro dentado, y, finalmente, el proceso incluye todas las áreas corticales [3]. Neurofibrilares enredo patología es también progresista: Inicialmente, la participación de las neuronas de proyección con somata en la región transentorhinal, enredos luego extenderse a la región entorrinal adecuada normalmente en ausencia de la deposición amiloide. Con posterioridad a la progresión de la proneocortex hipocampo y temporal, y luego asociación neocortex, seguido por superiolateral propagación y, en definitiva, se extiende a las zonas primarias neocortical [4 - 6]. Además, las personas con diagnóstico de deterioro cognitivo leve, un forme fruste de AD, mostrar entorrinal y disminuyó el volumen del hipocampo, principalmente asociados con la disminución de las neuronas en comparación con el número de no deterioro cognitivo controles [7 - 10]. Estos datos sugieren que la corteza entorrinal y el hipocampo son vulnerables a principios selectivamente durante el proceso de enfermedad.

Lograr una mejor comprensión de por qué estas regiones del cerebro son especialmente susceptibles a la neurodegeneración en el contexto de la AD y elucidar los mecanismos subyacentes a estos procesos de la enfermedad ha sido objeto de intensa investigación en los últimos decenios. La atención se ha concentrado en la disfunción sináptica, debido a la disminución observada anteriormente colinérgica de la sinapsis y la densidad global de los números de la sinapsis durante las primeras etapas de la EA [11, 12]. Además, los modelos de ratones overexpressing humanos de la proteína precursora amiloide (APP), la proteína patógena A partir de la cual se proteolytically β péptidos derivados, la exposición disminuyó función sináptica antecedente a la deposición de la placa [13], con lo que además implican a la función sináptica perturbado en las primeras etapas de la patogénesis AD.

Procesos inflamatorios, marcado activado por astrocitos y microglia, en el post-mortem de cerebros AD algunos de los cuales co-localizar a placas y enredos, han sido desde hace tiempo la hipótesis de contribuir a la patogénesis AD [14]. El papel que desempeña esta respuesta en el proceso de la enfermedad, especialmente durante las etapas pre-sintomático, no está bien definida. Existen varios medios por los cuales los procesos inflamatorios pueden afectar a las neuronas y posiblemente en la función sináptica AD. Citocinas han demostrado que se expresa en respuesta a un β y la generación de un subconjunto de estas moléculas han demostrado neurotóxicos actividades [15 - 17]. Estas observaciones implican estas moléculas inflamatorias pueden servir para la elaboración mecánica vínculo de características patológicas y disfunción sináptica. La hipótesis de que la inflamación juega un papel temprano durante el proceso de enfermedad, en un momento en que la disfunción sináptica y principios de los déficit cognitivos primero se hacen evidentes. Enfermedades inflamatorias relacionadas con los contribuyentes a la disfunción sináptica encontrado a principios de AD han sido objeto de debate largo, pero este tipo de estudios se han visto obstaculizados por la falta de emparejados por edad, el principio de su carrera humanos post mortem muestras de tejidos, así como AD-modelos animales pertinentes. En el presente estudio, hemos tratado de determinar el temporal específicos de la región y la expresión de moléculas inflamatorias, previamente implicado en la fase tardía de la AD, en el contexto de un modelo de ratón que desarrolla la patología amiloide y tau. Un triple transgénico modelo de AD (3xTg-AD) se ha creado recientemente, que alberga tres de las enfermedades relevantes alteraciones genéticas: un humano Presenilin M146V knock-en mutación (PS1M146V), la proteína precursora amiloide mutación sueca (APPswe), y los humanos TauP301L mutación. Estos ratones desarrollan placas y enredos en un espacio y tiempo que dependen de manera similar a la observada características patológicas en el cerebro de las personas afectadas por AD [18, 19]. En particular, este es el primer modelo animal desarrollado hasta la fecha que facilita el estudio de la inflamación en el contexto de la patología amiloide y tau. Se realizó cuantitativos específicos de la región transcripción y análisis imparcial estereológicos contando para correlacionar regional y temporal de los cambios en los perfiles de expresión de moléculas inflamatorias a alteraciones en el número de células inflamatorias y de las patologías relacionadas con el AD. Nuestros resultados implican procesos inflamatorios además de jugar un papel temprano durante el proceso de enfermedad, y que existen diferencias regionales que pueden elucidar por qué regiones cerebrales son más susceptibles a las enfermedades relacionadas con el AD mecanismos.

Materiales y métodos
Cepas de ratones

Triple transgénicos (3xTg-AD) se crearon ratones que se describió anteriormente [18, 19]. Emparejados por edad 2, 3, y 6 meses de edad, se utilizaron ratones machos en todos los estudios (n = 6 por grupo experimental para ensayos bioquímicos, n = 4 por grupo experimental de los estudios cuantitativos estereológicos). Emparejados por edad masculino C57BL / 6 ratones fueron utilizados como controles no transgénicos en todos los experimentos. Todos los animales y los procedimientos se realizaron en cumplimiento de las directrices establecidas por el Comité de la Universidad de Recursos Animales de la Universidad de Rochester.

Cuantitativo PCR en tiempo real el análisis de moléculas pro-inflamatorias del cerebro derivados de ARN

RNA se aisló de microdissected hipocampo o la corteza entorrinal-enriquecido tejido del 2, 3 y 6 meses de edad 3xTg-AD y no ratones transgénicos con TRIzol solución (Invitrogen, Carlsbad, CA). ARN fue tratado con RQ DNAse I (Promega, Madison, WI) a degradar selectivamente cualquier contaminación de ADN genómico, seguido de fenol: cloroformo extracción de etanol y la precipitación. Un total de microgramos de ARN transcrito fue inversa usando Applied Biosystems de alta capacidad de cDNA Archivo Kit. Una parte alícuota de cDNA (100 ng) fue utilizado para evaluar la presencia de 23 inflamatoria objetivos por ratón, y fue analizado en un nivel PE7900HT reacción de PCR cuantitativa mediante un ensayo sobre la demanda Taqman primer sonda fija en Microfluidic tarjetas (Applied Biosystems, Foster City, CA ) Y 100 μ l MasterMix contengan HotStart ADN polimerasa (Eurogentec, Bélgica). 18s ARN sirvió de control para que todas las muestras se normalizaron (Applied Biosystems, Foster City, CA). Asimismo, analizaron los datos utilizando el método ΔΔ C T, la normalización de los 3 y 6 meses de edad 3xTg-AD y el control del ratón muestras a los 2 meses de edad 3xTg-AD y no transgénicos muestras, respectivamente.

Histoquímicas análisis cuantitativo de los macrófagos y microglia en el cerebro de 3xTg-AD y no ratones transgénicos

Emparejados por edad 3xTg-AD y no ratones transgénicos fueron sacrificados y procesados con el 4% paraformaldehido (PFA) / PB transeuropeas de la perfusión cardiaca; cerebros fueron removidos y de la noche a la mañana después de los fijos con 4% PFA / PB. Secuencialmente, los cerebros fueron transferidos a un 20% de sacarosa en PBS la noche a la mañana y, a continuación, el 30% de sacarosa, donde permanecieron hasta la sección. Brains se seccionaron coronally (30 μ m), en un micrótomo de deslizamiento, y se almacena hasta que en crioprotectores utilizados para inmunohistoquímica.

Las secciones se lavaron cuatro veces por 3 min. Cada uno en PB para eliminar cyroprotectant. Para la amortiguación actividad peroxidasa endógena, las secciones se incubaron durante 25 min. Con el 3% de H 2 O 2 (Sigma). Las secciones fueron montadas en láminas y se deja secar. Las láminas fueron incubadas en 0,15 M PB + 0,4% Triton-X100 por 5 min. A temperatura ambiente (RT; 22 ° C) a permeabilize el tejido. Luego se incubaron con diapositivas bloqueo solución que contenga un 3% de suero normal de cabra, el 3% de albúmina sérica bovina, y el 0,4% Tritón X-100 en 0,15 M PB de 1 hr. Las láminas fueron incubadas con anti-F4/80 anticuerpo monoclonal de rata (Serotec, 1:100) en la noche a la mañana el bloqueo de la solución. A continuación, se lavaron las diapositivas ocho veces durante 3 min. Cada uno con 0,15 M PB antes de la incubación con biotina Vectastain cabra anti-inmunoglobulina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para 2 hrs. En la RT. El exceso de secundaria de anticuerpos fue lavada con 0,15 M PB y se incubaron con los reactivos AyB (Vector Laboratories, Burlingame, CA) conjugada a HRP. Las láminas fueron desarrollados utilizando un kit de peroxidasa DAB, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la mejora de níquel (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Positivamente manchadas F4/80-expressing células se visualizaron utilizando una Olympus AX-70 equipado con un microscopio motorizado etapa (Olympus, Melville, NY) y el MCID 6,0 Elite Imaging Software (Imaging Research, Inc). Secciones de azulejos fueron menores de 4 × magnificación. Cinco igualdad de los sectores de la corteza entorrinal y siete secciones de la igualdad de hipocampo de cada ratón (4 ratones total) fueron analizados por timepoint. El cincuenta por ciento de la región de interés definida en la corteza entorrinal o hipocampo se evaluó, en 60 × magnificación. Las coordenadas de las secciones que fueron elegidos para la corteza entorrinal fueron 2,92 mm a 4,04 mm de Bregma posterior. Las secciones contados en el hipocampo fueron de 1,70 mm hasta 3,40 mm posterior de Bregma.

Inmunohistoquímica análisis cualitativo de la deposición amiloide en 3xTg-AD y no ratones transgénicos

Las secciones fueron lavadas tres veces por 5 min. Cada uno, y luego dos veces durante 30 min. En PBS para eliminar crioprotector. Para la amortiguación actividad peroxidasa endógena, las secciones fueron incubadas con el 3% de H 2 O 2 y el 3% de metanol durante 25 min. Secciones luego fueron lavados dos veces por 5 min. Cada uno con PBS, seguido de la recuperación epítopo tratamiento con ácido fórmico al 90% por 5 min. En la RT. A continuación, las secciones se lavaron dos veces durante 5 min. Cada uno con PBS. Tejido se permeabilized con PBS + 0,1% PBS / Triton X-100. Las secciones fueron incubadas durante 1 hora a TA con PBS + 0,1% PBS / Triton X-100 + 10% de suero normal de cabra. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario 6E10 (Signet, 1:1000) en el 0,1% PBS PBS / Triton X-100 + 1% suero normal de cabra. Las muestras se lavaron dos veces durante 10 min. Cada uno con PBS + 0,1% Tritón X-100 + 1% suero normal de cabra antes de la adición de secundaria de anticuerpos. El ratón HRP ABC kit se utiliza de acuerdo con el protocolo del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, CA). El exceso de secundaria de anticuerpos fue lavada con PBS y desarrollado utilizando un kit de peroxidasa DAB, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la mejora de níquel (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y montadas sobre portaobjetos.

Resultados
Temporal progresión de la acumulación intracelular de A β-AD 3xTg en ratones

Procesos inflamatorios han sido íntimamente asociada a la patología clásica AD, en el post-mortem del cerebro humano, en donde la prueba de astrogliosis y microglia activada en la vecindad de las placas amiloide se ha observado fácilmente [20]. Implicación de los mediadores de la inflamación a principios de los acontecimientos patógenos durante las etapas pre-sintomático de la EA, sin embargo, no se ha definido claramente en la actualidad debido a la limitada disponibilidad de las primeras etapas humanos muestras clínicas y la falta de modelos animales que fielmente recapitular la enfermedad humana. El recientemente caracterizado triple-AD ratón transgénico (3xTg-AD) que actualmente representa la más avanzada disponible en el modelo animal que alberga tres AD-las alteraciones genéticas, que dan lugar a la distribución espacial y la progresión de la patología amiloide y tau sorprendentemente similares a los humanos AD [ 18, 19]. Para aclarar el papel de los procesos inflamatorios en la progresión de la enfermedad temprana, que inicialmente se evaluó la acumulación dependiente de la edad de un humano β en la corteza entorrinal y el hipocampo de ratones 3xTg-AD, ya que muchos sitúan acumulando un β actúa como un probable desencadenante de principios relacionados con el AD - Procesos inflamatorios [21]. La corteza entorrinal hipocampo y las regiones fueron elegidos debido a la abundancia de pruebas que implican a estas regiones en las primeras fases de la enfermedad [6, 7, 10, 22]. Coronal de las secciones 2, 3, y 6 meses de edad 3xTg-AD y no immunohistochemically ratones transgénicos fueron teñidas con anticuerpos 6E10 para evaluar el alcance de intracelular y extracelular humanos β Una deposición. Análisis inmunohistoquímico reveló intracelular A β humanos en la tinción de 3 meses de duración β Un punto que no es detectable a los 2 meses de edad. El número de A β células inmuno-positivo aumentó a los 6 meses de edad y la intensidad de la tinción de células individuales fue significativamente mayor en los ratones 3xTg-AD (Fig. 1A]. Extracelular o la acumulación de placa amiloide-al igual que los depósitos no se observaron en ninguna de estas edades tempranas. No ratones transgénicos no exhibió un β manchas, además de confirmar que el 6E10 de anticuerpos específicos para el humano es una β-AD 3xTg en ratones (Figura 1B].

Pro-inflamatorios transcripción de perfiles de 3xTg-AD y no de ratones transgénicos hipocampo y corteza entorrinal revela temporal y espacial de la expresión de TNF-α y de MCP-1

Tenemos previsto que, si la inflamación ha participado en las primeras etapas del proceso de la enfermedad, queremos observar coordinar la expresión de moléculas inmunomoduladoras entre 3 y 6 meses de edad, cuando un intracelular β comienza a acumularse en la corteza entorrinal y el hipocampo de ratones 3xTg-AD . Con este fin, se seleccionaron un conjunto de moléculas inflamatorias objetivo que se han implicado en las respuestas inflamatorias en el sistema nervioso central, incluyendo citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión, y marcadores de células T inmunes relacionados con enzimas (Tabla 1]. Muchos de estos marcadores han sido implicados en la fase tardía de la AD y poseen el potencial de influir en los procesos de principios de patógenos dentro de las regiones afectadas a principios de AD. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó para determinar los niveles de estas metas en microdissected hipocampo y corteza entorrinal tejido, de 2, 3 y 6 meses de edad 3xTg-AD ratones. Emparejados por edad no ratón transgénico derivadas de las muestras idénticas regiones fueron empleados como controles (n = 6 por genotipo tiempo por punto). Sorprendentemente, hemos detectado un 14.8 veces sobre regulación de TNF-α, un modulador de pro-inflamatorias, y 10,8 veces más de las quimiocinas MCP-1 mRNA en la corteza entorrinal, de 6 meses de edad 3xTg-AD ratones frente a los 2 Meses de edad los animales (cuadro 2]. Los niveles de ambas moléculas pro-inflamatorias también son ligeramente más elevados en los 3 meses 3xTg-AD corteza entorrinal, aunque no alcanza significación estadística en comparación con los 2 meses de edad homólogos. Esto se manifiesta como aumento de TNF-α y MCP-1 en los niveles de transcripción de 3 meses de edad se correlaciona con la comparecencia inicial de los derivados de un transgén en 3xTg β-AD ratones. Por el contrario, no se observaron cambios detectables en ninguna de las metas evaluadas transcripcional en piscinas de cDNA generados a partir de muestras de ARN del hipocampo en cualquiera de los puntos del tiempo (Tabla 3], a pesar de un humano intracelular β fue fácilmente detectables dentro de esta región cerebral (fig. 1A ). Es notable que el TNF-α y de MCP-1 transcripción respuesta es específica de las células residentes de la corteza entorrinal, lo que sugiere que los aspectos del medio ambiente celular puede ser responsable de los resultados diferencial inflamatoria en la enfermedad de estas dos regiones cerebrales afectadas.

Mayor microglial / macrófagos números en la corteza entorrinal se correlaciona con una mejora de TNF-α y la expresión de MCP-1

Los hallazgos específicos que TNF-α y de MCP-1 transcripción de expresión dentro de la corteza entorrinal de 3xTg-AD ratones indica que a nivel regional existe una diferencia entre el hipocampo y corteza entorrinal que elaborar un tiempo-dependiente aumento de la intensidad de los procesos inflamatorios. Esta diferencia parece ser independiente de los humanos únicamente intracelular β acumulación desde una expresión de los transgenes es existentes en ambas regiones a los 3 y 6 meses. Dado que los macrófagos y microglia representan probable candidato (s) de TNF-α y de la producción de MCP-1 [23, 24], evaluamos el número total de células en el hipocampo y corteza entorrinal de transgénicos y no ratones transgénicos para determinar si existen diferencias Que pueden explicar las diferencias regionales de los perfiles de expresión de citoquinas inflamatorias. Coronal secciones que contiene la corteza entorrinal y el hipocampo, de 2 y 6 meses 3xTg-AD y control de los ratones fueron immunohistochemically manchadas de anti-F4/80 de anticuerpos para identificar residente microglia y macrófagos. El análisis microscópico reveló que el fenotipo microglial en la corteza entorrinal de 3xTg-AD ratones fue la de un estado altamente activada, como se muestra por una mayor tinción y morfología celular a los 6 meses de edad (Figura 2A]. Minimal diferencias en la activación microglial en aparente estado fueron idénticos en las regiones no transgénico de control de los animales (Figura 2A]. Para cuantificar el número de células en esta región, se realizó en estereología imparcial 3xTg-AD y control corteza entorrinal secciones. Hemos detectado un aumento significativo del número total de F4/80-positive células de la corteza entorrinal, de 6 meses de edad 3xTg-AD ratones en comparación con los 2 meses de edad homólogos (Figura 2B]. No ha habido cambios en el número de F4/80-positive células de la corteza entorrinal control de los ratones, lo que indica que el aumento de microglial número de células en ratones transgénicos no se debió a la normativa de envejecimiento. Evaluación de F4/80-positive células en el hipocampo no revelaron alteración detectable entre los 2 y 6 meses de edad 3xTg-AD y control de los ratones, en términos de estado de activación microglial (Fig. 3A]. Cuantificación mediante estereología imparcial indica que no existen diferencias significativas en el número de células F4/80-positive entre los 2 y 6 meses de duración de puntos (Fig. 3B].

Discusión

Disecar el papel que desempeña la inflamación en los principios de EA es difícil, ya que AD es un complejo desorden crónico con diferentes secuelas patológicas de las que se desconocen los mecanismos causales. La activación de astrocitos y microglia, y la presencia de muchos mediadores de la inflamación, incluyendo citocinas, quimiocinas y complementar las proteínas sólo se han identificado en el post-mortem de cerebros AD en la vecindad de las placas seniles y NFTs [20, 25]. Esta observación nos lleva a la pregunta si la inflamación está implicada temprana en el curso de AD y, de ser así, ¿cómo contribuyen a la patogénesis? La comprensión de los primeros eventos es de la mayor importancia, como la inflamación puede representar un objetivo viable terapéutica de la EA. Curiosamente, estudios retrospectivos evaluación de los efectos de los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) en nondemented personas han mostrado disminución en el riesgo de desarrollo de AD cuando estas personas utilizan los AINE durante largos períodos de tiempo [26, 27]. Nuestros estudios encaminados a identificar las primeras período en el que iniciar los procesos inflamatorios en la 3xTg-AD modelo de ratón [19]. Nuestros resultados ilustran 3 puntos principales: 1) los procesos inflamatorios preceder importante depósito extracelular de la placa amiloide en el cerebro 3xTg-AD, justificado por el aumento de TNF-α y de MCP-1 transcripción niveles, coincidiendo temporalmente con la producción de β Una acumulación intracelular. 2) La expresión de estas moléculas es espacialmente localizado en la corteza entorrinal hipocampo, pero no en el tiempo-principios de los puntos evaluados. 3) Hay un marcado aumento en el número de macrófagos y microglia en la corteza entorrinal que cuando se correlaciona con el TNF-α y de MCP-1 son significativamente los niveles de transcripción hasta reguladas.

En la fase tardía de la AD cerebro, se ha demostrado que las moléculas inflamatorias se producen principalmente por astrocitos y microglia, ya que responder a las placas y daño neuronal [17]. Los hallazgos del aumento de TNF-α y de MCP-1 antes de la expresión significativa en la deposición de la placa 3xTg-AD ratones, que se produce en gran medida a los 12 meses [19], puede representar un papel de aportación entre los procesos inflamatorios y principios de AD patogénesis. Precisamente cómo estas moléculas impartir efectos en 3xTg-AD ratones en esta primera vez-el punto no es cierto, sin embargo, evidencia reciente ha sugerido que el TNF-α y de MCP-1, así como otras moléculas pro-inflamatorias pueden desempeñar un papel en la inhibición Microglial fagocitosis fibrilar de un β in vitro [28]. Asimismo, el aumento de las respuestas inflamatorias y la posterior secreción de citocinas, en particular, la IL-1 β, pueden desempeñar un papel importante en la fosforilación de tau en la 3xTg-AD modelo [29]. En este estudio, la activación de la microglia por LPS sólo afectó a la patología tau cdk5/p25 través de la activación, pero no la patología amiloide, destacando además los posibles cambios fisiopatológicos que pueden ser inducidas por la inflamación en AD. Sin duda, los mediadores de la inflamación han sido implicados como los de protección y exacerbando, en función del modelo de sistema y los niveles de citoquinas presentes [30].

TNF-α puede ser expresada por astrocitos, microglia y neuronas en respuesta a diversos estímulos en el SNC [17]. Inicialmente, el TNF-α es un mediador innata, la promoción de la expresión de citoquinas y quimioquinas y extravasación de otras células inmunes. Un mecanismo posible que puede implicar TNF-α en contribuir a la patogénesis AD evidencias de que pueden aumentar la producción de un péptido β [31]. Además, la molécula de señalización inflamatoria puede causar aumento de la división de la PAA por γ-secretase complejo, en virtud del cual el TNF-α, IL-1 β, y de IFN-γ se ha demostrado que aumentar la producción de péptidos β A través de una γ-secretase-dependiente mecanismo in vitro . Además, antagonizar TNFR1 señalización puede conducir a una disminución de γ-secretase actividad [32]. Otra prueba de apoyo patógenos efectos de TNF-α de señalización mediada es TNFR1 y TRADD, TNF receptor adaptador que permite la proteína NF-κ B, y la activación de JNK, son a la vez el aumento de AD en el tejido y APPswe ratones. Este aumento es correlativo a TUNEL-positivos en las neuronas del hipocampo primaria de las culturas [33]. En conjunto, estas observaciones sugieren TNF-α contribuye a la aberrante política de asociación activa y el inicio del procesamiento de pro-apoptóticos vías.

MCP-1 es una de quimioquinas, que se expresa por astrocitos y microglia que facilita la extravasación de las células inmunes que expresan sus afines receptor, CCR2, que atraviesa la barrera hematoencefálica y los orientan al sitio de los daños. Al igual que con el TNF-α, la función de MCP-1 en AD fisiopatología es incierta. Un estudio reciente de APPswe/CCL2 (MCP-1) bigenic ratones mostraron un aumento difuso β deposición, en comparación con APPswe ratones a los 14 meses de edad. Dado que no se observaron cambios en el procesamiento de APP, los autores concluyeron que MCP-1 sobreexpresión en ratones APPswe correlaciona con una disminución de la liquidación de β [34]. En general, es interesante que de los 23 inmunomoduladores marcadores evaluados en nuestro estudio, TNF-α y de MCP-1 fueron las dos únicas que ha cambiado significativamente con el tiempo, posiblemente significando su importancia durante las etapas incipientes patogénesis de la EA. Tal vez, los demás objetivos inflamatoria se activan en etapas posteriores de la enfermedad en respuesta a los acontecimientos más neurodegenerativas.

Una exógena aplicada β pueden activar la expresión de citocinas in vitro y cuando se inyecta directamente en el cerebro de ratón [24, 35]. Sin embargo, el resultado fascinante en nuestro estudio es que la expresión de TNF-α y de MCP-1 se detectó específicamente dentro de la corteza entorrinal y el hipocampo no, a pesar de que immunocytochemically detectables intraneuronal A β aumentado con el tiempo en ambas regiones del cerebro. Además, aunque no estadísticamente significativo, TNF-α y de MCP-1 se encontraron elevados niveles de transcripción a los 3 meses de edad en 3xTg-AD ratón corteza entorrinal, y se incrementaron a la significación estadística de los 6 meses de edad que sugiere un estado de crónica sobre regulación Y de la retroalimentación positiva de la expresión de estas dos moléculas inflamatorias. Por lo tanto, no podemos concluir, detectada por la metodología empleada en este estudio, que la acumulación intracelular de A β es el único factor que contribuye a la promoción de TNF-α y de MCP-1 transcripción expresión específicamente en la corteza entorrinal. Es posible que estas moléculas son neuronally expresado en la corteza entorrinal porque son intrínsecamente más sensibles a la acumulación de un β, como otras neuronas, se mostró previamente a la vez de expresar estas moléculas en momentos de estrés [17]. Otra posibilidad es que la corteza entorrinal elabora expresión de moléculas inflamatorias debido a la estructura de A β elaborado. Por ejemplo, oligomeric A β se postula a ser la más tóxica estructurales intermedias que se planteen durante un fibrilogénesis β, y de esta forma se ha demostrado que fácilmente inducir la expresión de citoquinas in vitro [36]. Las diferencias regionales en el intracelular y extracelular oligomeric A β perfiles in vivo puede, por lo tanto, tener en cuenta la especificidad regional de citoquinas y quimioquinas expresión y de la activación microglial que observamos en los 3xTg-AD ratones. Por el contrario, la elaboración regional de TNF-α y de MCP-1 pueden producirse a través de un β-Un mecanismo independiente y causada por un estímulo ambiental, como región selectivo estrés oxidativo. Practico y colegas demostraron que la peroxidación lipídica en el cerebro APPswe puede ocurrir antes de la deposición de un β APPswe en ratones [37], lo que sugiere que los trastornos de la homeostasis celular membrana también podría contribuir a la inducción de moléculas inflamatorias, y tal vez, las diferencias regionales en la peroxidación lipídica perfiles son responsables Para nuestra región observaciones específicas en 3xTg-AD ratones.

El aumento significativo del número de macrófagos y microglia en la corteza entorrinal de 2 a 6 meses de edad en 3xTg-AD ratones es coincidente con el aumento de TNF-α y de MCP-1. Creemos que esto podría ser debido a la proliferación microglial, la activación de la población residente de descanso de los macrófagos y microglia cerebral y / o contratación de periféricos como los macrófagos-células (F4/80-positive) desde fuera del cerebro. Los macrófagos expresan CCR2 y, por lo tanto, son capaces de responder a una corteza entorrinal comprometida a través de quimiotaxis. Si el aumento observado en el número de células F4/80 + indica una respuesta homeostática o patológico no está claro. APPswe/CCL2 ratones demuestran mayor microglial números que son concurrentes con el aumento de la deposición extracelular A β, los autores postulan que se debe a la incapacidad de una clara eficacia β [34]. Esto puede relacionarse en parte al aumento de los niveles de ApoE observado en ratones APPswe/CCL2 producido por los macrófagos y microglia. Si un mecanismo similar está en juego en la 3xTg-AD modelo de ratón, este hallazgo sugiere un papel patogénico de estas células en la iniciación de la degeneración en la corteza entorrinal.

En resumen, nuestros resultados indican un posible papel para principios de los procesos inflamatorios en la evolución temporal y espacial patogénesis de la EA. Dado que el TNF-α y de MCP-1 se producen específicamente en la corteza entorrinal AD humanos donde se ha demostrado que se plantean, estas moléculas pueden jugar un papel fundamental en la enfermedad de perpetuación. Este trabajo da una idea de la participación de TNF-α y de MCP-1 mediada por la inflamación en la progresión temporal y espacial de los primeros eventos AD patógena y es posible anunciar nuevas dianas terapéuticas. Nuestro uso de la 3xTg-AD modelo para evaluar estos primeros eventos es único, ya que todos los estudios anteriores han examinado los procesos inflamatorios en el contexto de cualquiera de amiloide o patología tau, pero no ambos. Este ratón transgénico nos permite examinar directamente la interacción dinámica de la inflamación, una patología β, y la tau disfunción. La modulación de TNF-α y MCP-1 en función de los futuros estudios de dilucidar la forma en que estos mediadores de la inflamación influencia de la gravedad y progresión de la EA relacionados con la patología y la disfunción sináptica.

Lista de abreviaturas

AD: Enfermedad de Alzheimer

APP: Amyloid precursor de proteínas

APPswe: Amyloid precursor de proteínas mutación sueca

PS1: Presenilin 1

A β: Beta-amiloide

TNF-α: factor de necrosis tumoral-alfa

MCP-1: proteína chemoattractant monocitos-1

Tg: Transgénicos

PBS: salina tamponada con fosfato

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MCJ llevó a cabo el cuantitativos PCR en tiempo real, 6E10 inmunohistoquímica, F4/80 inmunohistoquímica, estereología, experimental y análisis de interpretación de datos, y preparó el manuscrito. MAM realiza microdissection tejidos, el cerebro de secciones, y 6E10 inmunohistoquímica. SO y FML concebido el diseño de la 3xTg y generado-AD modelo murino. HJF y WJB concebido el diseño del estudio, con la ayuda en la preparación del manuscrito, y siempre y análisis crítico del manuscrito.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Linda Callahan para inmunohistoquímica, microscopía, y estereológicos asesoramiento. También damos las gracias a Landa Prifti para el cuidado y la cría de animales. Este trabajo fue apoyado por el NIH F31NS049995 a MCJ, NIH R01AG023593 a WJB y NIH R01AG020204 a HJF.