Plant Methods, 2005; 1: 3-3 (más artículos en esta revista)

Alto rendimiento, alta resolución selección de los loci microsatélites polimórficos para análisis multiplex

BioMed Central
Nicholas C Cryer (nccryer@reading.ac.uk) [1], David Butler R (d.butler @ tstt.net.tt) [2], Mike J. Wilkinson (mjwilkinson@reading.ac.uk) [1]
[1] Escuela de Ciencias Biológicas, Universidad de Reading, Reading, Berkshire, RG6 6AS, Reino Unido
[2] Unidad de Investigación del Cacao, La Universidad de las Antillas, San Agustín, Trinidad y Tabago

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Resumen
Antecedentes

En gran escala de perfiles genéticos, la cartografía y estudios de asociación genética requieren el acceso a una serie de bien caracterizado y con marcadores de microsatélites polimórficos distintos y amplios rangos de alelo. Selección de los marcadores de microsatélites complementarios con la no superposición de gamas alelo históricamente ha demostrado ser un cuello de botella en el desarrollo de ensayos de múltiplex de microsatélites. El proceso de caracterización para cada locus microsatélite puede ser laboriosos y costosos, dada la necesidad de que numerosas, locus específicos de los primers fluorescentes.

Resultados

En este sentido, la designación de un enfoque sencillo y barato, útil para seleccionar marcadores de microsatélites. El sistema se basa en la puesta en común de los amplificados de PCR múltiple no etiquetados, y de su posterior ligadura en un vector de clonación. Una segunda ronda de amplificación de la utilización de genéricos etiquetados primers dirigidos a los vectores y no etiquetados locus primers específicos dirigidos a la región microsatélite de acompañamiento alélica perfiles de rendimiento que son representativos de todas las personas que figuran dentro de la piscina. Adecuación de los distintos tamaños de ADN piscina fue probado para este fin. ADN plantilla de las piscinas que contienen entre 8 y 96 personas fueron evaluados para la determinación de los alelos de cada uno de los rangos de marcadores de microsatélites en una amplia población. Esto ayudó a resolver el equilibrio entre medio de grupos que son lo suficientemente grandes como para permitir la detección de muchos alelos contra el riesgo de la inclusión de demasiadas personas en la piscina de manera que rara alelos están excesivamente diluida y por lo que no aparecen en el perfil de microsatélites combinados. Piscinas de ADN de 12 personas permite la detección fiable de todos los alelos presentes en la piscina.

Conclusión

El uso de genéricos de vectores específicos de los primers fluorescentes y etiquetados locus primers específicos ofrece una alta resolución, rápidas y de bajo costo criterio para la selección de loci microsatélite sumamente polimórfico que poseen no superpuestas alelo rangos para su uso en gran escala de ensayos de múltiplex.

Antecedentes

Análisis de microsatélites mediante fluorescently etiquetados primers y capilar fraccionamiento es la principal método para el análisis genético de los organismos eucarióticos. El enfoque es habitualmente utilizado para muchas aplicaciones, incluido el análisis forense [1], la vinculación de cartografía y de asociación genética [2], la genética de poblaciones [3, 4], y el análisis de la diversidad genética [5]. La necesidad de pantalla loci microsatélites para polimorfismo entre los genotipos en el organismo objetivo, y por su idoneidad en el múltiplex de análisis, es una parte inevitable de tales esfuerzos. El alto costo de la etiqueta fluorescently primers ha significado que la selección de marcadores de microsatélites ha invocado normalmente inicial, pantallas de baja resolución de los cebos no etiquetados antes de alta resolución utilizando marcador de selección etiquetados primers. Sin embargo, el anteproyecto de pantalla es inevitablemente crudo e ineficiente, por lo que es bien propenso a error o depende de los más caros de alta resolución de selección. Existe por lo tanto la necesidad de un alto rendimiento y de alta resolución de un solo paso adecuado método de selección de marcadores de microsatélites para estudios genéticos [6].

Para el análisis multiplex, mayor eficiencia se alcanza cuando la utilización de muchos loci polimórficos que poseen poco espaciados, la no superposición de gamas alélica. Inesperado alélica gama superposición entre multiplexadas loci microsatélite rendimientos alelos ambigua que puede ser mal a un lugar inadecuado, comprometer la integridad del conjunto de datos. Una inevitable problema radica en la posibilidad de que la pantalla no abarca todos los alelos presentes en la población en estudio. La confianza en la definición de los límites es alélica invariablemente una función de la cantidad y diversidad de genotipos seleccionados. Hay, por tanto, un equilibrio entre el deseo de examinar muchas personas y el costo de hacerlo utilizando fluorescently etiquetados primers. Así, la selección siempre sale caro ya que el número de genotipos probados crece, y como el número de marcadores descartan aumentos. Enfoques comunes para la selección de marcadores de microsatélites para Multiplex uso incluyen montaje de los paneles de fluorescently previamente caracterizado marcadores individuales [7, 8], y los marcadores de selección previa en la utilización de geles de poliacrilamida radioactivite etiquetado de los productos PCR [9]. Varios autores han propuesto alternativas de bajo costo para el uso de pantallas preliminar directa de ADN después de la tinción de electroforesis en gel de poliacrilamida [10 - 13]. Esas estrategias tienen méritos, pero son intensivas en mano de obra, no puede asignar rangos de tamaño real y, en general, carecen de la resolución necesaria para predecir con precisión el polimorfismo en dinucleotide marcadores [10 - 13]. Una metodología que es capaz de generar alélica escaleras de alta resolución en forma similar al método informó de que en este caso es de Oetting [14]. Este método emplea el uso de la legitimación de cola con primers específicos secuencia genérica que permite una segunda ronda de etiquetados PCR y posterior fraccionamiento capilar. Este método sin embargo adolece de una serie de posibles inconvenientes en relación con la aplicación de este método. El uso de oligonucleótidos para PCR largo de los genomas en las plantillas por debajo de la temperatura óptima de recocido permite un aumento de la frecuencia en la producción de productos no específicos de amplificación. Las condiciones de amplificación de PCR para la amplificación del locus específico de cola utilizando oligonucleótidos son a menudo diferentes de las condiciones óptimas para la amplificación con la misma longitud de 20 mer de oligonucleótidos. El método de Oetting no es el adecuado para el análisis del genotipo dinucleotide repetir marcadores debido a la posibilidad de una amplia tartamudean perfiles generados por la segunda ronda de PCR que complica la alélica perfiles y tan sólo es considerado marcador de mérito para la selección.

En este sentido, proponemos un sencillo pero novedoso en el que microsatélite amplicones generados a partir de ADN genómico agrupados plantillas son ligated en un estándar de la clonación de vectores, re-amplificado mediante un etiquetado universal cartilla de orientación insertar el plásmido de acompañamiento región, y una etiqueta específica primer lugar. El resultado representa perfiles alélicos escaleras derivados de la componente alelos contenidos agrupados por el ADN. Este procedimiento lo ofrece un único ensayo, de alta resolución y de bajo costo medio de la detección de loci microsatélite para polimorfismo alélica tamaño y gama. El perfil cualitativo también ofrece una indicación de la legitimación con respecto a tartamudear, un problema a menudo asociado con el uso de marcadores para dinucleotide repetir el análisis genético, pero también de interés para la utilización de laboratorios y tri-tetranucletide repetir marcadores.

Resultados

Al emplear una estrategia de puesta en común, hay un equilibrio entre la toma de muestras amplia para abarcar toda la gama de variación, y la dilución de las personas dentro de la piscina, tales alelos raros que no son detectadas. ADN piscinas fueron creadas por la combinación de cantidades iguales de las distintas muestras de ADN antes de nano-dilución con agua pura a 5 ng μ L -1. Para seleccionar el más adecuado tamaño de la piscina, al tiempo que permite la detección de alelos raros, el ADN piscinas, de 8, 12, 16, 24, 32, y 48 personas fueron comparados. Mediante amplificación por PCR de la utilización combinada de ADN no etiquetados primer pares específicos de loci microsatélite único [15] se realizó la incorporación de 5 ng de DNA plantilla con AccuPrime Taq ADN polimerasa en supermix I, utilizando la mitad de los volúmenes recomendados (Invitrogen Ltd). Los ciclos térmicos protocolo fue de 96 ° C durante 2 min, 35 ciclos de 96 ° C durante 30 s, 51 º C o 46 º C durante 30 s dependientes de la cartilla características recocido, 72 ° C por 2 min, seguido de 72 ° C Durante 10 min, en una MJ Research PTC-100 termociclador (la investigación genética Instrumentación Ltd). El éxito de la PCR se confirmó en un 1,5% (w / v), electroforesis en gel de agarosa [16]. PCR múltiple para productos individuales loci microsatélites, amplificado de alícuotas de la misma plantilla de ADN piscina, se combinaron entonces purificado utilizando PCR NucleoFast 96 placas de limpieza (Macherey-Nagel GmbH & Co KG), antes de la ligadura en pUnidad vector (Qiagen Ltd). Ligadura de los productos fueron diluidos 1 / 10 con agua grado HPLC y utilizados como plantilla para una segunda ronda de PCR utilizando el 'invertir' microsatélite específico básico y una etiqueta genérica fluorescently ejemplo, M13 (-40), la orientación por plásmido. Etiquetados amplicones fueron diluidos 1 / 100 en agua grado HPLC y fraccionado por electroforesis capilar en un ABI 3100 y vistos con genotyper 3,7 software (Applied Biosystems UK Ltd). El alelo tamaño informó por este método es que se esperan de los cebadores de microsatélites, además de un adicional de 150 bases de la secuencia de vectores. Comparación de los perfiles agrupados de amplificaciones y las de los miembros constituyentes de las piscinas demostrado que los individuos homocigotos que poseen una rara alelo podría ser detectado con fiabilidad en piscinas de 12 personas o menos. Por lo tanto, una estrategia sería la de reunir varias pequeñas piscinas, que permite variación alélica en los límites que se describen, de selección y continuar hasta la adición de más piscinas ya no aumenta el alelo gama. En la práctica, sin embargo, puede ser preferible utilizar mucho mayor para acomodar piscinas y la incertidumbre sobre alelos raros mediante la imposición de zonas de amortiguación alrededor de las gamas alélica detectado antes de multiplexación. Hemos probado empíricamente este enfoque. Plantilla de ADN de 96 genotipos diferentes de Theobroma cacao, se ajustó a 5 ng uL -1, individualmente y agrupados amplificado por PCR para 84 marcadores de microsatélites dinucleotide cacao descrito por Pugh et al [15]. El complejo de los perfiles generados (Figura 1] en términos generales representan el conjunto de alelos genotipos presentes cuando se analizaron por separado. Por lo tanto, la generación de marcadores seleccionados 36 la más amplia gama de picos homogéneos para un estudio más a fondo. El pico alélica gama de tamaños se toma como indicativo de la variedad alélica en el gen unsampled piscina. En general, los loci generar un gran número de picos con aproximadamente incluso altura (Figura 1B, C] fueron altamente informativos que los que producen algunos picos (Figura 1A] o perfiles dominada por un pico (Figura 1D] tienen menos utilidad para el análisis genético.

Luego se examinó la relación entre el alelo rango previsto en mezcla perfiles y observó que después de más amplio genotipo de muestreo. Para ello, hemos empleado multiplex PCR de microsatélites análisis realizados sobre los 672 genotipos de cacao (Cuadro 1]. Dos loci predijo a dar unos alelos sobre la base de la muestra piscina (mTcCIR080 y mTcCIR155) produce el mismo número de alelos cuando la muestra gama se amplió para incluir los 672 genotipos de cacao. Sin embargo, el número de alelos en más variable loci (mTcCIR131 y mTcCIR190) aumentó de 9 a 12, cuando la muestra se amplió la gama, con el rango de tamaño cada vez mayor en un 67% y 62%, respectivamente. Habida cuenta de un modesto aumento de la gama alélica cuando el tamaño de la muestra se incrementó seis veces, uno sería para acomodar alelos detectados mediante la imposición de un buffer de los márgenes de loci vecinos antes de multiplexación. En este caso, un espaciamiento de 1 × predijo gama ambos lados de la media alelo tamaño parece adecuada. En general, la adopción de este protocolo permite mejorar la selección de marcadores de microsatélites polimórficos compatible, con una reducción de la probabilidad de producir la superposición de los perfiles de reacciones multiplex de microsatélites.

Conclusión

La adopción de esta metodología permite tanto una cualitativa y semi cuantitativa caracterización de polimorfismo en los distintos loci microsatélites. Cuando usando mezcla de las muestras, la combinación de ADN de hasta 12 personas para permitir la detección fiable de los alelos solo ejemplar, que dentro de la muestra. Si la caracterización de microsatélites de ADN utilizando loci piscinas de más de 12 personas la incorporación de una zona de amortiguación en la final de genotipos de ensayo, sobre la base de observar la gama de tamaños de los alelos, puede permitir la variabilidad probablemente se encuentran en un mayor tamaño de la muestra. La metodología es adecuada para aplicaciones de alto rendimiento de la combinación de diferentes tintes fluorescentes en asociación con el conveniente manejo de los formatos de líquido. Este protocolo se beneficia de la utilización inicialmente etiquetados primers idénticos a los utilizados en el ensayo final de genotipos, la reducción de las posibilidades de los patrones de bandas inesperada debido a cambios en la secuencia de primer o condiciones de ensayo. El ADN de alta resolución de tamaño hace que la medición de este protocolo adecuado para caracterizar dinucleotide loci microsatélites.

Lista de abreviaturas

PCR, reacción en cadena de polimerasa, ADN, ácido desoxirribonucleico, ng, 10 -9 gramos

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

NCC concebido y elaborado el protocolo de selección de microsatélites y redactó el manuscrito. El proyecto fue concebido por DRB. MJW ayudado el diseño experimental y desempeñó un papel importante en el desarrollo del manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Olivier Sounigo, y Claire Lanaud de proporcionar el ADN, Didier Clement, como para proporcionar información entonces inéditos microsatélite (Pugh et al., 2004) y Steve Brown, de proporcionar un vínculo de ruta de cacao marcadores de microsatélites. Este trabajo forma parte de una colaboración entre la Universidad de Reading y de la Unidad de Investigación del Cacao, de la Universidad de West Indies, Trinidad y Tobago, financiado por La Biscuit, Cake, Chocolate y Confitería Association, Reino Unido.