Plant Methods, 2005; 1: 4-4 (más artículos en esta revista)

Una rápida y versátil combinado de ADN / ARN extracción de protocolo y su aplicación al análisis de un nuevo marcador de ADN polimórfico conjunto entre ecotipos de Arabidopsis thaliana Col-0 y Landsberg erecta

BioMed Central
Kenneth Berendzen (kenneth.berendzen @ zmbp.uni_tuebingen.de) [1], Iain Searle (searle@mpiz-koeln.mpg.de) [1], Dean Ravenscroft (ravenscr@mpiz-koeln.mpg.de) [1] , Csaba Koncz (koncz@mpiz-koeln.mpg.de) [1], Alfred Batschauer (batschau@staff.uni-marburg.de) [2], George Coupland (coupland@mpiz-koeln.mpg.de) [1 ], Imre E Somssich (somssich@mpiz-koeln.mpg.de) [3], Bekir Ülker (ulker@mpiz-koeln.mpg.de) [3]
[1] Max-Planck-Institute for Plant Breeding Research, Departamento de Biología del Desarrollo, de Carl von Linné-Weg 10, D-50829 Köln, Alemania
[2] Philipps-Universität, Biología-Fisiología Vegetal / Fotobiología, Karl-von-Frisch-Str. 8-35032 Marburg, Alemania
[3] Max-Planck Institute for Plant Breeding Research, Departamento de Plant-Microbe Interacciones, de Carl von Linné-Weg 10, D-50829 Köln, Alemania

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Resumen
Antecedentes

Muchos establecido PCR enfoques basados en la biología molecular de plantas dependen de largos y costosos métodos de aislamiento de los ácidos nucleicos. Aunque varios protocolos de aislamiento rápido de ADN se encuentran disponibles, no se han probado de traducción simultánea para el aislamiento de RNA RT-PCR aplicaciones. Además, el mapa tradicional basada en las tecnologías de clonación a menudo mal uso proporcional marcador regiones incluso cuando se trabaja con la planta modelo Arabidopsis thaliana, donde la disponibilidad de la secuencia completa del genoma puede ser explotado para la creación de una alta densidad de los sistemas marcador.

Resultados

Hemos diseñado una alta densidad de marcadores polimórficos conjunto entre dos ecotipos de uso frecuente. Este nuevo marcador polimórfico permite establecer el tamaño de la separación de los productos de PCR en geles de agarosa y ofrece una resolución inicial, de 10 cM vinculación en experimentos de mapeo, facilitado por la rápida extracción de las plantas de ácido nucleico protocolo utilizando cantidades mínimas de A. Thaliana tejido. El uso de este protocolo de extracción, también hemos caracterizado segregar inserción de T-ADN mutaciones. Además, hemos demostrado que nuestra rápida extracción de ácidos nucleicos de protocolo también se puede utilizar para la vigilancia de los niveles de transcripción por RT-PCR de amplificación. Finalmente hemos demostrado que nuestro método de aislamiento de ácidos nucleicos también es adecuado para otras especies de plantas, como el tabaco y la cebada.

Conclusión

Para facilitar la vinculación de alto rendimiento de mapas y otras aplicaciones genómicas, nuestro protocolo de aislamiento de ácidos nucleicos rendimientos suficiente calidad de las plantillas de DNA y RNA de PCR y RT-PCR reacciones, respectivamente. Esta nueva técnica requiere mucho menos tiempo en comparación con otros métodos de purificación, y en combinación con un nuevo conjunto marcador polimórfico PCR reduce drásticamente la carga de trabajo necesaria para la vinculación de mutaciones en la cartografía A. Thaliana utilizando cruces entre Col-0 y Landsberg erecta (Ler Ler) ecotipos.

Antecedentes

PCR y RT-PCR (transcriptasa inversa-PCR) son las más utilizadas en los métodos de análisis de plantas de genética y biología molecular, proporcionando herramientas sencillas para el estudio de la segregación de las mutaciones y el control de la transcripción de tipo salvaje y alelos mutantes de los genes en diferentes tejidos de las plantas . Al igual que varios otros métodos clásicos (por ejemplo, el sur y el norte de la hibridación de análisis de ácidos nucleicos), PCR y RT-PCR aplicaciones también requieren una suficiente cantidad y calidad de ácidos nucleicos adecuados para estos ensayos. Debido a que la mayoría bien establecido protocolos incluyen procedimientos basados en el uso de cualquiera de los productos químicos tóxicos o potencialmente costosos kits comerciales, numerosas rápido aislamiento de ADN se han desarrollado métodos para promover en gran escala genómica aplicaciones en los últimos años [1]. Una de las principales desventajas de estos métodos de aislamiento rápido es que no son adecuados para aplicaciones que requieren de amplificación de fragmentos de ADN de más de 2 kb de tamaño. Además, dispone de los métodos de purificación de ADN no se han combinado con el rápido aislamiento de ARN de tejidos vegetales.

Tras la terminación de la A. Thaliana secuencia del genoma, un objetivo de mayor importancia de la investigación post-genómica es comprender la función y la regulación de los más de 26000 genes de las especies en este modelo. Varios SEMA (ethylmethansulfonate) y T-ADN mutagenized poblaciones ofrecen valiosos recursos genéticos para la gran escala de estudios de genómica funcional en A. Thaliana [2 - 6]. Estos estudios requieren de alto rendimiento de ADN y ARN aislamiento de decenas de miles de plantas. Los avances en la caracterización molecular y genética de los SOMA y T-DNA de mutantes de inserción es, pues, depende en gran medida de la rapidez, la sencillez y la calidad de los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos. Mapa basado en la clonación de alelos mutantes generados por la radiación o EMS mutagénesis se ha simplificado mediante el desarrollo de diversas estrategias de puesta en común, que son ayudados por bien caracterizado marcadores moleculares. Muchos vínculos se basan las técnicas de cartografía, ya sea en la digestión enzimática de los productos de PCR [7], o sobre la utilización de los ensayos de tiros SNaP (SNP marcadores polimórficos; [8]], que puede requerir la separación en general, el trabajo intensivo de acrilamida geles y detección de plata Tinción o radiografía. Enlace en las estrategias de mapeo en A. Thaliana aún están restringidas por el número de polimorfismos conocidos disponibles entre los distintos ecotipos, como Col-0 y Ler Ler. El uso frecuente de derivados de la separación de las poblaciones Col-0 × Ler Ler cruces, especialmente en el estudio de la época de floración y desarrollo de las plantas, por lo tanto, beneficiarse en gran medida de un conjunto más amplio de bien caracterizado y probado marcadores. Por lo tanto, para elaborar un mapa de fácil enfoque basado en la clonación, que perfeccionó el diseño actual de los marcadores polimórficos de tal manera que todos los marcadores polimórficos ahora pueden ser resueltas, el 3% (w / v) de geles de agarosa y detectados por tinción de bromuro de etidio.

Para facilitar la aplicación de alto rendimiento de nuestros nuevos marcadores polimórficos, así como PCR basada en la identificación y caracterización de mutantes de inserción, hemos desarrollado una técnica sencilla para el rápido aislamiento de los ácidos nucleicos cantidad mínima de A. Thaliana tejido. Esta técnica aísla ambas plantillas de ADN y ARN, la cantidad y la calidad de las cuales son suficientes para PCR y RT-PCR, respectivamente. Nuestros datos muestran que esta nueva técnica puede acelerar considerablemente la PCR para la detección de ADN-T knockout mutaciones y facilita enormemente el seguimiento de la separación de la progenie de Col-0 × Ler Ler cruces, que hemos utilizado para la identificación de una mutación inducida por SEMA afectan a la regulación de la floración tiempo En A. Thaliana.

Resultados
La sucrosa método de preparación para el rápido aislamiento de los ácidos nucleicos por PCR para el análisis de las plantillas

Hemos probado sistemáticamente diversos protocolos optimizados para el aislamiento de ADN a temperatura ambiente, la eficiencia de la amplificación de PCR omitiendo el componente inhibitorio EDTA. Las combinaciones de protocolos de aislamiento de ADN Edwards et al. [9] y Walbot y Warren [10] por lo tanto, se compararon mediante ~ 2,5 mg (~ 3 mm 2), de A. Thaliana hoja de tejido en 50 μ l de mezcla de extracción, de los cuales 1 μ l se utilizó como modelo en la aplicación de una rutina de PCR. Hemos encontrado que uno de los buffers de extracción de la variante, en lo sucesivo denominado Solución de sucrosa, exhibieron ningún cambio en la eficiencia de amplificación de PCR juzgados por bromuro de etidio geles de agarosa teñidos-en respuesta a los distintos pH de 7,0 a 8,0, o el cambio de la sal y sacarosa Concentraciones entre 200 y 400 mM de NaCl y 300 a 440 mM de sacarosa, respectivamente (datos no presentados). Debido a la presencia de sacarosa en la extracción de amortiguación, el nombre de este método de extracción de ácido nucleico de la sucrosa Prep. De acuerdo con Thomson y Henry [11], encontramos que el extracto crudo de calefacción durante 10 min seguido de centrifugación por 5 seg en el 6000 g eliminado casi todos los desechos que interfiere con la amplificación de PCR.

La sucrosa Prep protocolo fue optimizado mediante el control de tamaño de muestreo. Óptimos resultados fueron obtenidos por la cosecha de la hoja de tejido con 500 μ l Eppendorf tope ponche (produciendo alrededor de 10 mg de tejido fresco) en 200 μ l de Solución de sucrosa. Múltiples muestras fueron almacenadas en hielo antes de la extracción y el uso de suelo fueron estériles ya sea consejos o pipeta de plástico pestles. Los extractos pueden ser almacenadas a 4 ° C durante la noche o a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo, sino que se utiliza normalmente de inmediato. Podríamos almacenar las muestras a -20 ° C durante un máximo de 4 semanas no detectable disminución de la eficiencia de amplificación de PCR. Tras el almacenamiento a largo plazo, sin embargo, las muestras necesarias de calefacción antes de volver a la amplificación de PCR. El éxito de la amplificación de PCR se obtuvo con A. Thaliana extrajeron muestras de ADN de 2 a 4 semanas de edad, la hoja de material, los pétalos, sépalos, estigmas, estilos, anteras, y los embriones. El tamaño máximo de los productos obtenidos en reacciones de amplificación de PCR de rutina es de aproximadamente un 3 kb. El uso de la bicicleta térmico optimizado condiciones, no se observó diferencia de los productos hasta 4 kb ADN en comparación con plantillas preparadas de acuerdo con Edwards et al. [9]. Al limitar la cantidad de restos vegetales arrastrados en la mezcla, el producto de PCR de tamaños de hasta 5,5 kb fueron obtenidos (Figura 1].

Novela marcador conjunto de la cartografía entre A. Thaliana ecotipos Landsberg erecta y Col-0

La disponibilidad de toda la secuencia del genoma de A. Thaliana ecotipo Col-0 y la alta abundancia de la secuencia genómica de Landsberg erecta (Ler Ler) nos permitió diseñar un nuevo conjunto de marcadores que muestran polimorfismo entre estos ecotipos [12, 13]. Un nuevo conjunto de 51 marcadores de ADN se identificó a intervalos regulares a través de los cinco cromosomas (Tabla 1; Figura 2A]. Este marcador permite establecer la cartografía a 10 cM (~ 2 Mbp) de resolución.

Usando el nuevo marcador para establecer un nuevo mapa mutantes de floración temprana Ler Ler

Para probar la eficiencia de la vinculación con la nueva cartografía de marcadores polimórficos conjunto, un desempeño Ler Ler línea T-ADN construye overexpressing CONSTANS (CO) y FLORACIÓN LOCUS C (FLC), así como una fusión entre el promotor de SUPRESSOR de OVEREXPRESSION DE CONSTANS 1 (SOC1) y un beta-glucuronidase (GUS) gen (35S:: CO 35S:: FLC 1 kb:: SOC1: GUS; [14]], fue objeto de SEMA mutagénesis con el fin de investigar sobre las mutaciones que afectan a la floración tiempo. Una floración temprana mutante muestra una alargada hipocotilo cuando se crece en la luz blanca se identificó en la generación M 2. Después de que se demuestre que la floración temprana fenotipo mutante fue heredado estable a la generación M 4, el mutante de vuelta-se cruzó con el progenitor transgénicos Ler Ler padre. F 1 progenie mostró tipo silvestre de floración tiempo (de aquí en adelante como el tiempo normal de la floración), lo que indica que la mutación es recesiva. Herencia recesiva fue confirmada por el análisis de 96 F 2 progenie, de los cuales alrededor de una cuarta parte mostró floración temprana. Posteriormente, el Col-0 cartografía de los padres, se ha generado por el cruce 35S:: CO/35S:: FLC / 1 kb:: SOC1: GUS transgenes de la Ler Ler progenitoras Col-0 a cuatro veces. La floración temprana Ler Ler línea mutante posteriormente fue cruzado con el Col-0 cartografía de los padres, y una F 2 segregar a la población se generó a la mutación de ruta. Seis principios de plantas con flores se eligieron a partir de la generación F 2, y una hoja de cada planta se bulked juntos y ADN purificado utilizando el protocolo de Edwards et al. [9]. 6 plantas de la misma manera que muestran un fenotipo normal de la floración se identificaron, sus hojas también fueron juntos y bulked ADN purificado.

Fragmentos de ADN fueron amplificados de cada uno de los bulks de ADN por PCR utilizando toda la nueva serie de 51 poylmorphic marcadores. Dos marcadores, ciw3 y F26B6 en el cromosoma II se identificaron a estar vinculadas a la floración temprana mutación como marcadores fueron homocigotos para el alelo Ler Ler a partir de la floración temprana granel y heterocigotos para el normal floración masiva. Los otros marcadores de ADN en heterocigosis en ambos bulks indicando que no estaban vinculadas a la mutación de floración temprana, con la excepción de los tres marcadores más probable que se vincularon a los loci de la T-ADN que lleva el CO, FLC y SOC1 construcciones genéticas ( Datos no presentados). Figura 2B muestra el marcador vinculado F26B6 y un marcador disociados F14G16 amplificada de la Col-0 y Ler Ler padres y el ADN bulks de floración temprana y normal progenie F 2. F26B6 marcador de ADN se confirmó que estar vinculadas a la mutación mediante amplificación por PCR de la marca de los cinco principios de la floración normal y cuatro plantas con flores de la cartografía de la población F 2 (Figura 2C].

A continuación, utiliza la sucrosa Prep rápidamente a la pantalla de 96 principios de plantas con flores de la población F 2, confirmando que la mutación se encuentra entre los marcadores ciw3 y F26B6 (datos no presentados). El análisis de la secuencia de ADN anotado para genes candidatos en esta región PHYB revelado como uno de los candidatos más probables responsables de la floración temprana fenotipo mutante. Anteriormente, un mutante phyB Se ha demostrado que la flor anterior en virtud de las condiciones de día largo y tiene una alargada hipocotilo bajo condiciones de luz blanca [15, 16]. Por lo tanto, PHYB secuenciado el gen de tipo salvaje Ler Ler y nuestros principios de la floración mutante. A base de la sustitución de cytosine se detectó a timina en la posición 1660 pb aguas abajo de la PHYB traslacional sitio web inicial, resultando en un codón de parada prematura en el primer exón. Esta mutación sin sentido se prevé que dar lugar a una proteína truncada que es poco probable que sea funcional, ya que no consta el PAS repetir dominio ni la histidina quinasa relacionados con el dominio esencial de la conocida función de la proteína.

La sucrosa Prep como método para la identificación de inserción de T-ADN mutaciones

Para determinar si la sucrosa Prep método es adecuado para el cribado de T-ADN homocigotos mutantes, seleccionados segregar T 2 progenie de la línea SALK_098205, en el que un T-ADN se inserta en el exón 3 del gen AtWRKY22 (At4g01250; Figura 3] . Paralelamente, ARN aislado de las mismas plantas utilizando un kit comercial. Como se ilustra en la Figura 3, la sucrosa Prep (ADN; panel superior) ha dado unos resultados que están en consonancia con los observados expresión de los genes (cDNA; panel inferior) con lo que la identificación de la línea 3 como homocigotos pérdida de la función de AtWRKY22 mutante.

La sencillez de la sucrosa Prep también facilitó la detección de la T-inserciones de ADN en poblaciones más grandes. Por ejemplo, la identificación de la doble ejecución knockouts T-inserciones de ADN con idénticos marcadores seleccionables es fácilmente posible mediante el procedimiento de preparación de sucrosa. Para ilustrar este punto, se realizó un experimento para crear un atwrky46 (At2g46400), atwrky53 (At4g23810) doble mutante. Estos factores de transcripción WRKY pertenecen al mismo sub-grupo (grupo III) y muestran muy similar cinética de inducción de la transcripción en respuesta a patógenos y elicitor tratamientos (datos no presentados). Después de cruzar la inserción de T-ADN líneas (Figura 4], F 2 progenie fueron seleccionadas por PCR para detectar la pérdida de genes específicos. Siete candidatos fueron inmediatamente identificados como potencialmente ser homocigotos para ambas mutaciones inserción dentro de los 90 plantas ensayadas (Figura 4B]. Dos de estos 7 candidatos fueron posteriormente confirmados para ser verdad knockouts doble (no se muestra).

La sucrosa Prep también pueden ser utilizados con eficacia para detectar la presencia o ausencia de determinadas transcripciones por RT-PCR

Para demostrar que la sucrosa Prep método también es adecuado para fácil detección de transcripciones en pequeñas cantidades de tejidos vegetales, probamos la expresión de SOC1 (At2g45660) y AGC1-10 (At2g26700) genes en muestras de hojas por RT-PCR de amplificación de ARN Plantillas preparado por la sucrosa Prep. Desde el RNA podría ser destruida en la calefacción, los extractos de hoja de las muestras fueron sometidas a diferentes tiempos de calentamiento de 1 a 5 min antes de la RT-PCR de amplificación. La longitud de la calefacción paso no parece influir en la eficiencia de la RT-PCR de amplificación desde el SOC1 transcripción se detectó en todas las muestras (Figura 5]. Aunque la amplificación de los cDNA producto fue más débil en comparación con la eficacia obtenida con el kit comercial de purificación de ARN, el cDNA fue producto específico y su amplificación es reproducible.

A continuación, probamos homocigotos T-ADN knockout líneas por la pérdida de WRKY transcripciones. A T-ADN en la AtWRKY36 (At1g69810) gen, localizado en el primer intrón. Esta inserción provocado una pérdida de transcripción detectables por RT-PCR en comparación con el análisis de tipo salvaje (datos no presentados). RT-PCR análisis de tipo salvaje y homocigotos atwrky36 knockout plantas mutantes se realizó mediante el uso de la sucrosa Prep. Desde el T-DNA se encuentra en el primer intrón, ningún producto de amplificación de cDNA que se esperaba en las eliminatorias mutante (Figura 6, panel A). Sin embargo, un leve cDNA producto fue detectado por RT-PCR el ensayo que sugiere que la inserción de T-ADN se ensamblan a partir de una pequeña fracción de primaria transcripciones.

El "Touch-and-Go 'enfoque de PCR y RT-PCR aplicaciones

También desarrolló un método alternativo para el aislamiento de los ácidos nucleicos de muy pequeño tamaño de las muestras designado 'Touch-and-Go'. Este método elimina la preparación de las medidas necesarias de preparación de sucrosa, desde la extracción de ADN / ARN plantillas se hace simplemente a la captación de tejido vegetal con una pipeta de punta que está inmediatamente disponible para la amplificación de ácidos nucleicos por PCR y RT-PCR métodos respectivamente. En la práctica, fue la perforación de la hoja de tejido utilizando una RNAse libre de 20 μ l pipeta de punta contra una superficie firme, es decir, un dedo cubierto con un guante de látex y, a continuación, la pipeta de punta fue inmediatamente abordado en 50 μ l de PCR solución en la mezcla de reacción preparado pozos . Debido a la cantidad muy pequeña de material foliar adoptadas por pipeta punta de la perforación, el número de ciclos de PCR debe ser de 35 a 40 cuando se utiliza este método. Por material vegetal ubicado en el invernadero o sobre el terreno, 10 μ l de agua fue entregado a los tubos de PCR o mantenerse en placas de hielo, y "Touch-and-Go 'de muestreo se realizó por tocar el agua en los tubos o pozos con la pipeta punta Que contiene los tejidos vegetales. Después de la toma de muestras, 40 μ l de solución de la mezcla de PCR fue agregado a los tubos o de los pozos y en el laboratorio de ADN / ARN se amplificó por PCR de 40 ciclos utilizando un termociclizador. Figura 6, panel B muestra que el 'Touch-and-Go' método puede ser usado para amplificar el ADN de productos PCR un máximo de 1,5 kb de tamaño. Este mini-método de preparación también fue probado en combinación con RT-PCR en la vigilancia para detectar la pérdida de expresión de AtWRKY70 (At3g56400) en una inserción de T-ADN mutante línea. El mutante atwrky70 inserción conlleva la inserción de T-ADN en el último exón del gen. Figura 6, panel B muestra que ninguna señal de cDNA fue detectable en la homocigotos atwrky70 knockout línea en comparación con los extractos de tipo salvaje de la que tanto ADN y así se cDNA productos amplificados. Para verificar que el observado banda inferior de la correcta predijo cDNA tamaño de AtWRKY70 es, en efecto, este fragmento de gel fue aislado y posteriormente secuenciados. La secuencia de datos confirmado claramente que este fragmento representa a la escuela para pedir AtWRKY70 fragmento de cDNA y que los dos eran conocidos intrones empalmados.

El "Touch-and-Go 'método de extracción También se puso a prueba en el cribado de una atwrky40, atwrky18 doble mutante. Figura 7 muestra una selección de la progenie F 2 homocigotos para la atwrky18 inserción de T-ADN mutación. Considerando que un fragmento de ADN de 644 pb específicos para el locus AtWRKY18 se amplificó a partir de extractos preparados de tipo salvaje Col-0 y homocigotos atwrky40 plantas mutantes, este no era el caso cuando el ensayo se aplicó a los extractos que se han preparado a partir de homocigotos atwrky18 líneas. Al 72 de cribado segregar progenie F 2 de un atwrky40 × atwrky18 cruz, hemos identificado 19 personas que se atwrky18 homocigotos para la mutación (como juzgados por la ausencia de los 644 pb de productos PCR). Estos resultados están de acuerdo con la proporción esperada mendelianos segregación (es decir, 18/72; Figura 7]

La sucrosa Prep y el 'Touch-and-Go' métodos pueden ser utilizados con éxito en otras plantas

Se aislaron ADN de las dicotiledóneas especies de cultivo de tabaco (Nicotiana tabacum) y su pariente cercano N. Benthamiana, así como de la monocotyledonous especies de cultivos de cebada (Hordeum vulgare) mediante Sacarosa Prep y el 'Touch-and-Go' métodos para demostrar su aplicabilidad para las plantas distintas de A. Thaliana. Como se ilustra en la Figura 8 (dos paneles superiores), ambos métodos producen suficiente calidad y cantidad de ADN que pueden ser amplificados utilizando primers para dos genes NtCDPK2 tabaco (kinase2 proteína dependiente de calcio) y que NtRBCS rendimiento 2 kb y 0,8 kb productos PCR amplificación de ADN Respectivamente. La amplificación no sólo en uno de cada ocho reacciones utilizando la sucrosa Prep mientras que ninguno no a través del "Touch-and-Go 'método. El mismo aislamiento y la amplificación de PCR se realizó con cebada tejido utilizando cuatro pares de primers específicos de la cebada que producen distintos tamaños de amplificación de fragmentos de ADN (Figura 8; inferiores de los paneles y el cuadro 2]. Los tamaños y los patrones de uso de la amplificación de ADN observaron fragmentos son idénticos a los observados con otros métodos convencionales de aislamiento de ADN (comunicación personal T. Zhao, M. Böhmer, y G. Freymark, MPIZ Köln). Todos los pares de la cartilla producido la esperada tamaño de los fragmentos (1,7, 0,7, 0,6 y 0,4 kb) en el análisis de PCR utilizando ADN aislado de la sucrosa Prep. Usando el Touch-and-Go 'método, tres pares primer éxito de la amplificación de fragmentos de menor tamaño esperado (0,7, 0,6 y 0,4 kb), pero no para ampliar el tamaño de los fragmentos más grandes de 1,7 kb.

Diagramas de flujo para la preparación de sucrosa y el 'Touch-and-Go' métodos de PCR y RT-PCR aplicaciones se muestran en la Figura 9.

Discusión

La sucrosa Prep no es único en ser una rápida protocolo de aislamiento de ADN. Kasajima et al. [18] han explotado el método de Edwards et al. [9] a desarrollar un método rápido de detección de transgenes y marcador, y han demostrado la amplificación de fragmentos de hasta 1,4 kb de tamaño. Como Langridge et al. [19] y Petersen et al. [20], también hemos observado que el ADN puede extraerse de la molienda de tejidos vegetales en el agua pura, y la transferencia de una muestra alícuota del extracto a una reacción de PCR o de las plantillas de ADN que puede ser emitido por la adición de una pequeña cantidad de tejido a un PCR Mezcla de reacción (datos no presentados). Por lo tanto, hemos intentado utilizar muy pequeñas cantidades de tejido de la muestra con pipeta consejos por la perforación de hoja de tejido y de inmediato tocar la punta en la reacción de PCR preparado mezclas. Este "Touch-and-Go 'método es comparable en la eficiencia de amplificación de PCR de fragmentos de ADN de hasta alrededor de 1 kb con la sucrosa y otros de preparación rápida métodos de aislamiento de ácidos nucleicos. La estabilidad de la sucrosa Prep en la prestación de plantillas para muchos PCR o RT-PCR reacciones sin embargo nos animó a seguir el método de optimización en relación con las diversas aplicaciones de alto rendimiento.

Lisis alcalina con NaOH [21 - 23] También se ha utilizado con éxito en el rápido aislamiento de ADN, sin embargo mediante amplificación por PCR de fragmentos de ADN son típicamente más pequeño de 2 kb de tamaño. Un paso común entre la mayoría de los procesos rápidos y de la sucrosa Prep es la inclusión de un "punto de ebullición" paso. Burr et al. [24] utilizó un protocolo de ciclos térmicos de 65 º C a 96 º C durante un tiempo total de 11,5 minutos, mientras que Thomas y Henry [11] ha optimizado su protocolo para la extracción de ADN de tejidos de secado por calentamiento durante 10 minutos a 95 ° C . Muchos de ADN rápido a los métodos de preparación de diluir los contaminantes a partir de la cosecha de tejidos, lo que interfiere con la reacción de PCR, mediante el aumento de la extracción de volumen [22 - 26]. Sacarosa Prep también emplea dicha dilución paso utilizando alrededor de 50 μ l de tampón de extracción de 2,5 mg de tejido. Otro componente de la Solución de sucrosa es el uso de la sal, que también es empleada en el protocolo de Wang et al. [22] y es un componente principal de buffers de extracción de ADN descritas por Edwards et al. [9] y Walbot y Warren [10].

La sucrosa Prep ha sido optimizado para A. Thaliana tejido, pero también es adecuado para el aislamiento de ADN de otras especies, como el tabaco y la cebada (Figura 8]. Por lo tanto, sucrosa Prep seguramente también para especies como el maíz, trigo, arroz, papa, tomate y otras plantas que tienen concentraciones bajas a moderadas de fenólicos y almidón

La combinación de la mayor parte segregant análisis con nuestros nuevos marcadores polimórficos de ADN conjunto demostró ser muy eficaz en la rápida localización de una mutación de interés dentro de un intervalo de 10 cM. Seguimiento de F 2 con la segregación de sucrosa Prep dramáticamente aliviado el análisis, como hemos empleado un agitador de ADN y bloquea el ciclo térmico para la calefacción, lo que hace el futuro con robots optimización posible. Secuenciación del ADN de un gen candidato identificado una mutación en el primer exon del gen PHYB, causando un codón de parada prematuro en el aminoácido 554. La resultante proteína truncada no se prevé para contener el PAS de dominio, que son importantes en función phytochrome y mediar en la interacción con putativo de señalización asociados [27 - 29].

La sucrosa Prep demostrado su eficacia en la detección de homocigotos T-DNA de mutantes de inserción y es especialmente útil para la rápida identificación de homocigotos doble knock-out que llevó las líneas T-DNA inserciones teniendo idénticos marcadores seleccionables (Figura 3 y Figura 5]. En ocasiones, algunos PCR primers no se comportan de forma diferente entre los convencionales y las plantillas de los preparativos de ADN obtenidos por la sucrosa Prep (Figura 1 y Figura 4]. No obstante, en la mayoría de los casos en que una combinación no funcionó con sucrosa Prep, que tampoco se producen mediante amplificación por PCR con los métodos convencionales en virtud de los mencionados límites de tamaño (datos no presentados).

Pre-selección de segregar F 2 o T 2 y T-SEMA-mutación del ADN inducidas por las poblaciones con la sucrosa Prep reducido en gran medida el número de líneas que requieren más estudios. Tras la rápida detección de preparación con sucrosa, el análisis detallado siempre llevó a la identificación de las líneas mutantes homocigotos que fueron confirmados por el ADN y el ARN otros métodos de aislamiento.

ARN aislado de las plantas es a menudo un proceso largo que requiere de productos químicos tóxicos o kits caro, y requiere una práctica muy limpia debido a la gran contaminación de RNAses. Un rápido método de aislamiento de ARN, por lo tanto, es muy conveniente. Hemos demostrado que por encima de extractos de plantas preparado por la sucrosa Prep también son adecuados para ensayos de RT-PCR (Figuras 5 y 6]. Debido a la alta concentración de los extractos de ADN, los cebos deberán estar diseñados de exones separados por intrones, a fin de diferenciar el ADN de cDNA (Figura 6]. ADN contaminación no es un problema exclusivo de nuestro enfoque, pero es común a varios otros métodos de aislamiento de ARN. La única desventaja importante de nuestra rápida ARN método de aislamiento es que el ratio de ARN a ADN es muy baja en comparación con otros métodos, donde se concentra la ARN a través de varios pasos. Sin embargo, nuestro método es muy útil, e incluso superior a otros métodos en ciertas aplicaciones que requieren velocidad y el uso de cantidades limitadas de tejidos vegetales. Así, el método es especialmente útil si las células que expresan el gen de interés se limitan a ciertos tejidos, como hydathodes, venas mayores y menores, las nuevas hojas jóvenes, flores órganos, como nectarios, zonas de abscisión de flores, sépalos pétalos, anteras, gynoecium, Puntas de raíces, así como locales de patógenos y de los tejidos infectados islas de células generadas por transposón saltar. Una de las limitaciones de nuestro método es que no es conveniente para los genes que se expresan en niveles muy bajos. El "Touch-and-Go 'método no es adecuado para la RT-PCR cuantitativa aplicaciones, debido a la cantidad de ARN diferentes aisladas durante el muestreo.

El uso de la sucrosa y el Prep 'Touch-and-Go' métodos, hemos identificado homocigotos T-ADN knockouts para la AtWRKY36 y AtWRKY70 genes (Figura 6]. Con respecto a la amplificación de PCR de muestras de ADN, hemos encontrado el 'Touch-and-Go' método de gran utilidad y ahorro de tiempo, especialmente cuando la detección de la presencia o ausencia de productos PCR de menos de 500 pb en tamaño. Tuvimos variable sin embargo las tasas de éxito si el tamaño de los productos PCR se espera de más de 1 kb. Al igual que con la preparación de sucrosa, el "Touch-and-Go 'método funcionó muy bien para el tabaco en amplificar fragmentos de ADN de 2 kb, sin embargo, en la cebada, no se prevé ampliar el mayor fragmento de 1,7 kb y de la cantidad de producto de amplificación Variados fragmentos de menos de 1 kb de longitud. Esta diferencia observada en la reproducibilidad de aislamiento de ADN entre el tabaco y la cebada es posiblemente debido al menor número de células que se ven afectadas en plantas de cebada a la perforación con punta de la pipeta. No obstante, la sencillez, la rapidez y la reproducibilidad de la 'Touch-and-Go' enfoque y la solidez y la velocidad relativa de la sucrosa Prep método hace ideales para alto rendimiento basados en la PCR en las pantallas de transgénicos enfoques alternativos para sustituir el uso de marcadores de resistencia a antibióticos seleccionable [31].

Conclusión

En comparación con otros ácidos nucleicos rápido aislamiento protocolos descritos para muestras de plantas, la preparación de sucrosa es hasta el momento el único protocolo de extracción, el cual se muestra para ser compatible con simultánea aislamiento de ADN y ARN plantillas. Este paso mínimo de ácido nucleico método de aislamiento se puede combinar con el uso de nuestra alta resolución marcador establecido que se pueden resolver en gel de agarosa después de la amplificación con PCR para realizar rápida y precisa cartografía de las mutaciones del ADN usando polimorfismos entre A. Ecotipos thaliana Col-0 y Ler Ler. Prevemos que la utilización de sacarosa Prep así como la 'Touch-and-Go' método facilitará la mejora de los automatizado un genómica técnicas que se utilizan en estudios de genómica funcional de la planta modelo A. Thaliana, así como en otras especies de plantas, incluidos los cultivos importantes.

Métodos
La sacarosa prep

Solución de sucrosa: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM de NaCl y 300 mM sacarosa.

(A) muestras individuales: unos 10 mg de tejido de la hoja se colocó directamente en 200 μ l Solución de sucrosa y terreno a temperatura ambiente o en hielo utilizando una pipeta o punta pestle. Las muestras se calienta a 99-100 º C durante 10 min y luego brevemente en hilar 2000-6000 g durante 5 seg. Las muestras se colocaron en hielo hasta el PCR. Una μ l del sobrenadante se utilizó para PCR, evitando los desechos.

(B) 96-Múltiples muestra así formato: entre 10-20 mg de tejido de la hoja del 14 d de edad, se cosechará en las plantas de hoja en 96 discos y placas. Bolas de metal (3 mm, las piedras de carburo de tungsteno) se agregaron y se agita en una coctelera Retsch MM300 de 10 segundos, entonces 300 μ l de Solución de sucrosa se añadió, la placa se calienta a 99 ° C por 10 min y se colocan en hielo hasta su uso. A raíz de almacenamiento a 4 º C o -20 ° C, las muestras fueron recalentados a 99-100 º C durante 10 min y, a continuación, puso de inmediato en hielo.

El "Touch-and-Go 'método

Las hojas se perforan contra una superficie firme, como un dedo cubierto con un guante de látex usando una pipeta de punta fina (TipOne de Starlab GMBH, el catálogo no. S1111-3000 o S1110-3000). El ADN / ARN en la punta de la pipeta fue trasladado a la pre-PCR preparado en la solución de los tubos de PCR por tocar la punta de la pipeta a la solución de pipeteado y de arriba a abajo un par de veces. Para las plantas en el campo o invernadero, 10 μ l de agua PCR fue alicuotar en tubos o placas microtiter. Los tubos / placas se mantuvieron en hielo mientras que la perforación de hojas con una multa pipeta de punta contra una superficie firme y ADN / ARN la punta fue trasladado en el agua por pipeting arriba y hacia abajo. Tras su regreso las muestras al laboratorio, 40 μ l maestro de la mezcla de PCR se añadió a cada pocillo. Thermocycling con el "Touch-and-Go 'método requiere 40 ciclos de amplificación de PCR.

Método CTAB

El CTAB protocolo utilizado fue desarrollado por Murray y Thompson [32], modificada por Rogers y Bendich [33] y adaptado por Ríos et al. [2].

Las condiciones de crecimiento de las plantas

A. thaliana plantas cultivadas bajo un fotoperíodo de 16 h a 20 ° C en un invernadero.

SEMA Mutagénesis

Aproximadamente 6500 35S:: CO 35S:: FLC 1 kb: SOC1:: GUS co-2 semillas fueron mutagenized por imbibición en el 0,3% etílico methanesulfonate (SME; Sigma), de 8 a 9 h, seguido de un lavado con 0,1 M Na 2 SO 4 y agua destilada. El M 1 mutagenized semillas se plantaron en unas 260 piscinas que contienen cada uno 25 M 1 semillas. Alrededor de 300 M 2 de cada grupo de semillas se sembraron bajo condiciones de día largo y anotó para el tiempo de floración.

PCR y RT-PCR

PCR de rutina: 3 min 94 ° C, 35-40 ciclos de: (30 seg 94 ° C, 45 segundos a 55 ° C, 1 min 72 ° C), 10 minutos a 72 ° C, 4 ° C hasta el análisis. 2,5 μ M de genes específicos de cada uno de los cebos, 2,5 mM dNTPs, 5-10 U (0.5-1 μ l) Taq polimerasa (Invitrogen), 1 × Buffer Taq (comercialmente suministrado). Para los productos de más de 2 kb, 0,5 U de enzima Taq polimerasa LA (TaKaRa) fue sustituido por Invitrogen Taq polimerasa y el protocolo de PCR de Ríos et al. [2] Se utilizó.

Qiagen OneStep RT-PCR Kit (catálogo No. 210210) se utilizó después de las recomendaciones del fabricante. Para el aislamiento de ADNc, ARN se extrajo con RNeasy Plant Mini Kit de Qiagen (catálogo No. 74.904) después de las instrucciones del fabricante.

Primers y T-ADN knockout líneas se enumeran en el cuadro 2.

Gel documentación

Todas las fotografías son de gel de agarosa teñidos geles de bromuro de etidio y las imágenes están invertidas en Adobe Photoshop.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

KB desarrollado la sucrosa Prep, que se inició la colaboración con la IS para el uso de sucrosa de preparación para el trazado de mapas y efectos, junto con la UB participa en el diseño, coordinación y redacción del manuscrito. ES diseñado la novela marcador conjunto entre Col-0 y Ler Ler, ES EL DR mapeado y la mutación en el gen PHYB y ayudó en la redacción del manuscrito. BU desarrollado el 'Touch-and-Go' método y demostró que el aislado de los ácidos nucleicos o la sucrosa Prep 'Touch-and-Go' los métodos son adecuados para ensayos de RT-PCR, la prueba de todos estos métodos en la detección de ADN-T knockouts En Arabidopsis y demostrado que estos métodos también son aptas para el tabaco y la cebada. CK, GC y siempre que el IES instalaciones de laboratorio, dio valiosos consejos y experimental ampliamente ayudó en la redacción del manuscrito. CK y AB son los supervisores de doctorado KB. Todos los autores participaron en la lectura, corrección y aprobación de la versión final del manuscrito.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer la hábil asistencia de Nicole Kamphaus, Sandra Kröber y Anja Reinstädler y gracias a Marcel Lafos para la lectura crítica del manuscrito. Muchas gracias a Tiehan Zhao, Maik Böhmer, Gerald Freymark por compartir sus primers de la cebada, el tabaco y N. Benthamiana, respectivamente.