Plant Methods, 2005; 1: 5-5 (más artículos en esta revista)

Examen de las metodologías y de un protocolo para la transformación mediada por Agrobacterium de trigo

BioMed Central
D Huw Jones (huw.jones @ bbsrc.ac.uk) [1], Angela Doherty (angela.doherty @ bbsrc.ac.uk) [1], Huixia Wu (huixia.wu @ bbsrc.ac.uk) [1 ]
[1] IPC de la División de Investigación Rothamsted, Harpenden, AL5 2JQ, Reino Unido

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Resumen

Desde el primer informe del trigo transformación por Agrobacterium tumefaciens, en 1997, varios factores que influyen en la ejecución de T-ADN en la regeneración de tejidos y la cultura han sido más investigados y modificados. Este documento examina la metodología actual que describe la literatura Agrobacterium transformación de trigo y por completo el protocolo que hemos desarrollado y utilizado para producir más de un centenar de líneas transgénicas en la primavera y el invierno, tanto variedades de trigo.

Introducción

La transformación de cultivos de cereales es una poderosa herramienta de investigación para el descubrimiento de genes y la función de investigar los rasgos genéticamente controlado y se está convirtiendo rápidamente en un elemento clave en el proceso de mejoramiento varietal. Proporciona los conocimientos fundamentales que sustentan informar a los atajos y las estrategias convencionales de mejoramiento. Para determinados cultivos, sino que también permite la introducción de nuevos genes directamente en el local de germoplasma adaptado y la creación de nuevas variedades genéticamente modificadas. Como prueba de esto, un total de 81 millones de hectáreas de cultivos transgénicos aprobados, principalmente para la tolerancia a los herbicidas o resistencia a los insectos, se plantaron en el año 2004 [1], aunque el trigo no cuenta en la actualidad forman parte de esta cartera.

El trigo fue uno de los últimos de los principales cultivos que se transformó con el primer fértil plantas transgénicas están utilizando bombardeo de partículas de poco más de una década atrás [2 - 6]. Los avances en el diseño de micro-dispositivos de proyectil, la elección de explantes, la composición y selección de los medios de comunicación ha permitido a los sistemas de aplicación de la transformación de trigo para estudiar la función de genes específicos en una amplia gama de características agronómicamente importantes (por [7 - 9]]. Sigue siendo un bombardeo de partículas sólidas, relativamente eficiente método para la manipulación genética de trigo [10], sin embargo en el nivel molecular, el ADN integración sitios son a menudo innecesariamente complejo. Existen varias ventajas significativas a la transferencia de ADN a través de Agrobacterium, incluida una reducción en el número de copias de transgenes, la integración estable con menos reordenamientos largo de las moléculas de ADN con fines definidos y la capacidad de generar líneas libres de genes marcadores seleccionables [7, 11 - 14 ]. Esta ha sido una fuerza motriz en el desarrollo de métodos de utilización de Agrobacterium tumefaciens para entregar el ADN, aunque la capacidad de transformar el trigo habitualmente de esta manera se limita actualmente a unos pocos, bien dotada de recursos públicos y comerciales de los laboratorios en todo el mundo. Esto se debe en parte a la necesidad de personal con experiencia y caras de laboratorio el crecimiento de las plantas y la infraestructura, sino también a través de una falta de claridad-escrita, completa, disponible públicamente-protocolos. Hay varios documentos de investigación y las patentes que describen mejoras específicas a las metodologías, pero estos no proporcionan un paso-a-paso guía para el proceso de transformación en su conjunto.

Hemos comparado la literatura publicada, en los epígrafes que describen las principales variables en el proceso de transformación. En primer lugar, consideramos que la relativamente escasa variedad de genotipos de trigo que se han transformado con éxito, la elección del explante y la validez de los tratamientos que se llevó a cabo. En segundo lugar, comparamos las cepas de Agrobacterium, residente Ti plásmidos y vectores binarios utilizados y considerar la importancia de nuevos genes de virulencia. Los diversos inoculación y co-cultivo de las condiciones y, por último, se discuten los pasos claves para controlar el sobrecrecimiento de células de Agrobacterium y de la selección de la regeneración de plantas transformadas se describen. Nosotros, después, un protocolo detallado para la transformación de embriones inmaduros de reciente aislamiento y la regeneración de plantas fértiles en 9-12 semanas.

Genotipo y de explantes de pre-tratamientos

Bobwhite de embriones inmaduros, antes de la culta de entre 1 y 6 días en CM4C medio, los más utilizados explante [15 - 18], si bien la utilización de 9 de día de pre-embriones inmaduros cultivados de cv. Fielder [19] y callo derivados de embriones inmaduros de Bobwhite [17] y cv. Veery 5 [20] También se ha informado (véase el cuadro 1 de resumen). Aunque los embriones inmaduros de Bobwhite se pre-cultivadas antes de la inoculación, Cheng et al. [17] informe no existe una diferencia significativa entre la eficiencia en la transformación de embriones inmaduros, la validez de los cultos o callo embriogénico. En un enfoque alternativo, recién aisladas de embriones inmaduros durante el invierno y la primavera de cultivares de trigo de Florida y Cadenza se encontraron preferible a la validez de los cultos [21], y es este tipo de explante que se describe en el protocolo que acompaña, ya que tiene el potencial de ser aplicado A otras variedades. Cigóticos germinación precoz es un problema importante cuando se utilizan explantes de embriones inmaduros, pero pueden ser suprimidas por la adición de hormonas como dicamba, abscisic ácido o altos niveles de 2,4-D para el medio de cultivo. Algunos autores establecen expresamente que el embrión eje de la eliminación o dañadas para impedir la germinación cigóticos [19 - 21]. Un marcado efecto de tamaño / edad de T-ADN entrega y regeneración se ha demostrado, con gran embriones (> 2 mm) dando significativamente mayor expresión transitoria de los niveles más bajos, pero las frecuencias de regeneración [21] que en los más pequeños (<1,5 mm) . Hacemos hincapié en la necesidad de utilizar embriones de 0.8-1.5 mm en el protocolo que acompaña.

Explante diversos tratamientos previos han sido evaluados en los intentos de mejorar la ejecución de T-ADN o cultivo de tejidos, en particular, las variedades de respuesta. Osmótica y la desecación tratamientos han sido evaluados e incorporados a los protocolos sobre la base de bombardeo de partículas [22 - 26], y también han sido probadas por Agrobacterium transformación de trigo. Aire secado pre-embriones inmaduros cultivados y callo embriogénico explantes durante Agrobacterium co-cultivo de aumento de T-DNA de Agrobacterium entrega y reprimidas crecimiento de las células, que a su vez facilita una mejor recuperación de células vegetales [18]. Los mismos autores no encontraron tal ventaja cuando explantes fueron desecados antes de la inoculación o cuando osmótica acondicionado se utilizó, sin embargo otros informes indican un efecto beneficioso sobre la transformación del aire de secado antes de co-cultivo de arroz suspensión cultivos celulares [27] y de la caña de azúcar callo [28]. Osmótica acondicionado, el 10% de sacarosa antes de la inoculación Agrobacterium causado un marcado aumento de la expresión transitoria GUS en la validez de arroz cultivadas callo [29] sino un paso plasmolysis utilizando el 20% maltosa, no consiguió mejorar la entrega de T-ADN en 10 días la validez de los embriones en cultivo de trigo [30].

Agrobacterium tumefaciens cepas y vectores binarios

La capacidad de las cepas particular Agrobacterium para transformar células vegetales se define por sus genomas plásmido cromosómicas y que entre ellos deben codificar todos los mecanismos necesarios para la conexión y de transferencia de ADN. El Agrobacterium cepas que se han utilizado con éxito para la transformación de trigo se basan en sólo dos antecedentes cromosómicas, LBA4404 (Ach5) y C58, pero se han empleado con una gran variedad de plásmidos Ti y binario. Algunas cepas, en particular AGL0 y AGL1 han sido diseñados para contener la denominada hypervirulent plásmido Ti, la acogida pTiBo542 adicionales vir genes procedentes de la cepa Agrobacterium A281, que en su forma oncogénico posee una amplia gama de huéspedes y un gran induce, rápidamente aparecen los tumores [ 31]. Las cepas utilizadas en las publicaciones analizadas (véase el cuadro 2], también contienen un binario y, en ocasiones, de ayuda de los plásmidos, que confieren aún más a menudo copias de los genes de virulencia. Una comparación de las diferentes cepas de Agrobacterium demostrado que AGL0, un hypervirulent cepa que contiene un plásmido desarmado pTiBo542 [32], fue mejor en la generación de trigo transformantes que otras cepas analizadas [19]. La capacidad del plásmido Ti pTiBo542 para conferir mayor eficiencia de transformación fue observado por primera vez en dicotiledóneos [33 - 35] y la vir genes de este plásmido han sido ampliamente adoptado para monocot transformación de los vectores (por [11]]. El Agrobacterium débilmente virulenta cepa LBA4404, tuvo éxito en la transformación de trigo sólo cuando aumentada por la superbinary plásmido pHK21 que poseen copias adicionales de vir B, C y G pTiBo542 de genes, pero no en la ejecución de un estándar binario plásmido [20]. Otra prueba de los efectos positivos adicionales de los genes vir fue proporcionada por la demostración de que un fragmento de 15 Kb pTiBo542 ayudante pSOUP en un plásmido [36] aumento de T-ADN de entrega y la producción de plantas transgénicas de trigo, incluso cuando en un hypervirulent AGL1 antecedentes Ya que contiene pTiBo542 como residente plásmido Ti [21, 37]. Aunque ha habido una tendencia a incorporar los nuevos genes vir, en particular virG virG, en binario vectores esto no siempre es necesario, al menos para cv Bobwhite, en el que un gran número de líneas transgénicas se han notificado mediante Agrobacterium cepas aparentemente estándar binario y vectores [16 - 18]. Existe también un informe [15] de la transformación con un binario normal en el Agrobacterium cepa C58C1 que los autores describen como desarmado, sin embargo entendemos que la cepa C58C1 es, en realidad, curado de su pTiC58 plásmido [38, 39]. En la actualidad hay datos suficientes para definir con precisión los genes vir que son necesarias y donde deben residir para la óptima transformación de trigo en diferentes genotipos. También existe la posibilidad de seguir investigando el efecto sobre el trigo de transformación Agrobacterium mutantes específicos que han demostrado efectos beneficiosos para otras especies de plantas. Por ejemplo, las cepas que contienen mutaciones en el gen regulador de vir virG virG resultante en la expresión constitutiva de este gen y presumiblemente los demás vir genes que regula, dio un aumento significativo en la eficiencia de la transformación en el tabaco y el algodón [40], Catharanthus roseus [41] y Abeto rojo [42]. Este virG virG mutante también se combina con un alto número de copias del plásmido para mejorar aún más las tasas de transformación en el sector del arroz y la soya [43].

Inoculación y co-cultivo

La infección por Agrobacterium proceso se divide en dos etapas: en primer lugar, un breve período de tiempo, por lo general, unos pocos minutos a unas pocas horas (véase el cuadro 1], de la inoculación por inmersión total o parcial de los explantes en una suspensión de Agrobacterium. Luego, después de la mayoría de Agrobacterium células son eliminadas por verter o pipeteo, los explantes son co-cultivadas por un nuevo 1-3 días. Uno o ambos estos pasos se llevan a cabo en la oscuridad de aproximadamente 25 ° C, aunque la temperatura de dos co-cultivo de paso también ha sido tratado con un día de 27 ° C entonces dos días a 25 ° C [20]. Durante el período de co-cultivo, fenólicos inductores como acetosyringone trabajos de señalización junto a otros factores como la temperatura y un entorno ácido para promover la expresión de los genes vir. La presencia de 200 μ M acetosyringone Agrobacterium o en el co-cultivo de mediano aumentó notablemente T-ADN entrega [21]. Aumento transitorio GFP expresión se observó en los grupos de células de trigo con acetosyrigone a 400 μ M en el co-cultivo de la inoculación, pero no los medios de comunicación [19]. La necesidad de acetosyringone ha informado de una variedad de trigo explantes tipos [17, 37, 44], pero no para el trigo suspensión celular culturas donde la inducción de agentes exógenos no eran necesarias para la transformación estable [17].

El uso de los tensioactivos durante la inoculación y co-cultivo aumenta de manera significativa la ejecución de T-ADN. El aumento de las concentraciones de Silwet L-77 hasta el 0,04% tuvo efectos positivos en el T-DNA de entrega, medido por el número de embriones inmaduros con GUS focos y el número de focos por GUS embrión [21]. Sin embargo, concentraciones superiores al 0,05% la reducción de la supervivencia y la formación de callo en el recién aisladas de embriones inmaduros y una óptima concentración de 0,01% fue elegido [21]. Efectos positivos de los tensioactivos También se informó en el estudio [17] que utiliza Silwet y pluronic ácido F68 en el 0,02%. Silwet se ha utilizado en concentraciones tan altas como el 0,05% de pre-embriones y callos cultivados [15]. El protocolo presentado aquí utiliza Silwet L-77 en el 0,015%, pero no la validez de la cultura o de los tratamientos especiales de la inoculación.

Control de Agrobacterium, y regeneración de selección

Después de que el co-cultivo de período, explantes infectados progresos en una serie de pasos en el cultivo de tejidos medios de comunicación diseñado para inhibir el crecimiento de células de Agrobacterium y promover la regeneración y la selección de los transformantes. Los antibióticos utilizados para controlar el crecimiento de Agrobacterium se añaden inmediatamente después de co-cultivo de callo durante la fase de inducción y se mantienen en todos los medios de comunicación. Timentin carbenicilina o son de uso común, sino de otros compuestos como cefatoxin, cefotaxima, vancomicina y ticarcillium También se ha informado (véase el cuadro 1]. Planta de selección de agentes complementarios a la gen marcador en el T-ADN se introducen a matar o comprometer el crecimiento de untransformed material. Selección de plantas para la transformación a menudo se inició a los pocos días de co-cultivo de callo durante la fase de inducción y mantenido durante las últimas medidas de regeneración. Demoras en la selección, iniciado en la última fase de la regeneración de plantas fue preferido por [21] y es el método descrito en el protocolo que acompaña. Tres gen marcador seleccionable sistemas se han reportado transformación de Agrobacterium para el trigo. La primera se basa en la selección de antibióticos ya sea utilizando hpt (aph4-Ib) o nptII nptII (aph3 'II) fosfotransferasa que codifican enzimas que confieren tolerancia a los antibióticos aminoglucósidos como la kanamicina, la neomicina, paromomycin, G418 y hygromycin. Un segundo sistema utiliza el gen bar que confiere tolerancia a glufosinato de amonio basado en herbicidas como el PPT, Basta, etc Bialaphos Un tercer sistema se basa en el aroA aroA: CP4 genes que confieran tolerancia a los herbicidas a base de glifosato como Roundup. El uso de glifosato en 0,02 mM regeneración de meristemas ha informado de reducir el número de plantas de selección de escapar a cero [16]. NptII NptII, bar y aroA aroA: CP4 han sido utilizados con éxito por los diferentes grupos para producir plantas transgénicas de trigo, pero es No es posible señalar a comparaciones directas entre los sistemas de selección, porque a menudo una marca visual también se utilizó en conjunción con la selección químicos. Por ejemplo, en varios estudios, el reportero gen GUS se ha utilizado además de los convencionales marcador seleccionable para ayudar a optimizar la identificación de los transformantes [15, 17, 18, 20, 21, 45]. Asimismo, un T-ADN que contiene tanto hpt y las buenas prácticas agrarias, junto con hygromycin selección, se ha utilizado para identificar los principios de los acontecimientos en el proceso de transformación [19].

En la transformación de trigo a través de Agrobacterium, la longitud total de tiempo, desde el aislamiento del explante original a la transferencia de las plantas jóvenes a la tierra, es típicamente 12-16 semanas dependiendo de la duración de la validez de la cultura y el número de pasos de selección. Un protocolo abreviado teniendo sólo 7-11 semanas, logrado principalmente mediante la reducción de la selección paso a una semana, también se ha informado sobre [16]. El protocolo se describe en el presente documento ha sido optimizado para bar / glifosato selección con un ensayo para confirmar GUS T-DNA de integración y de expresión y toma aproximadamente 12 semanas.

Observaciones finales

Las ventajas derivadas de la integración simple molecular única copia de fragmentos de ADN con extremos definidos han impulsado la investigación de plantas mediada por Agrobacterium transformación. En comparación con el arroz y el maíz, el trigo con el progreso ha sido más lento, pero tal y como se describe aquí, robusto métodos para la transformación del trigo utilizando Agrobacterium ahora existen. Hay margen para optimizar aún más los medios de comunicación y los componentes de pH y para investigar el complemento ideal de genes de virulencia. Actuales cuellos de botella que limitan el rendimiento incluyen la intensidad de mano de obra las medidas de aislamiento y de las transferencias de embriones entre los medios de comunicación. A diferencia de biolística, Agrobacterium suspensiones pueden ser manipulados por los líquidos entrega robots y esta combinada con el uso de callo culturas y la automatización de la transferencia de medidas permitirían un mayor rendimiento que incluso a baja eficiencia permitiría a un número significativamente mayor de líneas transgénicas que se producen

Un protocolo para el trigo (Triticum aestivum L.) de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens
Protocolo
Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

Rothamsted Research receptores de subsidios recibe el apoyo de la biotecnología y el Consejo de Investigación de Ciencias Biológicas del Reino Unido. HW AD y fueron financiados por el Departamento de Medio Ambiente, Alimentación y Asuntos Rurales del Reino Unido.