Plant Methods, 2005; 1: 6-6 (más artículos en esta revista)

Protocolo: La precisión de la ingeniería genética de plantas loci por recombinación homóloga en la clonación Escherichia coli

BioMed Central
Laura C Roden (LRODEN@science.uct.ac.za) [1], Göttgens Berthold (bg200@cam.ac.uk) [2], Effie S Mutasa-Göttgens (effie.mutasa @ bbsrc.ac.uk) [ 1]
[1] Broom's Barn Research Station, Higham, Bury St Edmunds, Suffolk IP28 6NP, UK
[2] Cambridge Institute for Medical Research, Hills Road, Cambridge, CB2 2XY, UK
[3] Depto Mol. & Cell Biol. 7701, Ciudad del Cabo, Sudáfrica

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Resumen

Datos de la secuencia del genoma de los vegetales ahora ofrecer oportunidades para realizar estudios de genética molecular a nivel de todo el gen locus y superiores. Esos estudios se facilitará mediante la adopción y el desarrollo de la más nueva generación de herramientas de la ingeniería genética, sobre la base de la clonación con fines de recombinación homóloga en Escherichia coli, que son libres de las limitaciones impuestas por la disponibilidad de los sitios de restricción coloca adecuadamente. Aquí se describe la base de recombinación homóloga en la clonación E. Coli, las herramientas disponibles y los recursos, junto con un protocolo de largo alcance para la clonación y la manipulación de un gen locus de Arabidopsis thaliana, para crear construcciones co-ordinately impulsada por locus específicos de los elementos de regulación.

Introducción

Planta de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son recursos que se ha generado para que aumente el número de especies, que con científicos de largo alcance y mapas físicos asociados secuencia de datos para los dos modelos y las plantas de cultivo. Esto brinda la oportunidad para revertir la genética y funcional de los estudios en el nivel del gen locus y superiores. Esta última requiere de métodos para la clonación y la manipulación de grandes fragmentos de ADN, sin las limitaciones impuestas por la necesidad de enzima de restricción convenientemente situado sitios. Para conseguir avances significativos en este sentido tuvo su origen en el desarrollo de la recombinación homóloga (HR) la clonación en Escherichia coli, basado en RecE / RecT (ET) [1, 2] y λ RED operón productos genéticos [3, 4]. Esencialmente, en ET estrategias basadas en la PCR-amplificación de fragmentos de ADN lineal corto con las regiones de homología (~ 50 pb y 60 pb) son un objetivo preciso en cualquier secuencia de ADN incluidos los plásmidos de alto número de copias, la E. Coli cromosoma y BAC. RED basada en protocolos de confiar en una defectuosa λ prophage para proporcionar funciones que protegen la lineal y recombinar fragmentos de ADN, bajo el control de una temperatura sensible λ cl-represor, con recombinogenic funciones de encendido a 42 ° C y fuera a los 32 ° C. Esta inducción ventana fija ayuda a reducir los reordenamientos no deseados, lo que permite que se estable de ADN clonado.

HR-clonación en E. Coli se utiliza ampliamente en la investigación biomédica sobre el terreno y se está convirtiendo en un instrumento que se utiliza para BAC ingeniería en estudios de genómica funcional [5]. Sus aplicaciones incluyen recombinogenic de orientación para la interrupción o la sustitución de genes y ADN subcloning de BAC directa por aislamiento de las regiones genómicas concretas. Un esquema general de la clonación de recursos humanos se da en la Fig. 1. Así, la construcción de los transgenes de la genómica funcional de plantas o de la próxima generación de plantas genéticamente modificadas de cultivos pueden beneficiarse de la ingeniería del nivel de precisión que ofrece en materia de recursos humanos de la clonación.

Nuestro interés de largo alcance en materia de recursos humanos la clonación fue impulsado por el deseo de crear herramientas específicas de planta y transgén que se dirigen a las construcciones de la expresión a disparar meristemo apical. Queríamos expresar el frijol (Phaseolus coccineus) GAPc2ox1 (codificación GA 2-OXIDASE 1, que degrada bioactivos giberelina) en el tiroteo ápice de la remolacha azucarera (Beta vulgaris) plantas y estudiar el efecto sobre la floración. Se presentan detalles de nuestras construcciones y las herramientas moleculares (plásmidos), desarrollado para la creación de estas construcciones de RED clonación.

Materiales
Reactivos

E. Coli cepa EL250 (genotipo DH10B [cI857 λ λ cI857 (cro-bioA) <> araC araC-P BAD flpe] <>, donde se indica que cro-bioA se ha sustituido con araC araC-P flpe BAD) a disposición de los autores [3] de los que han desarrollado una serie de diferentes cepas incluidas EL350 (con inducible araC BAD cre-P). Estas cepas llevar un defectuoso λ prophage con el rojo y el GAM recombinación de genes bajo el control de la λ P L promotor y exo y apuesta firmemente controlados por la temperatura sensible cI857 represor. Exo y Beta proporcionar recombinogenic función Gam mientras que inhibe el E. Coli nucleasa RecBCD degradantes electroprated lineal de fragmentos de ADN. El promotor de la araBAD araBAD operón (P BAD) es inducida por la L-arabinosa flpe de expresión que permite la creación y eliminación de las secuencias entre la FRT y LoxP LoxP sitios respectivamente. Se utilizó EL250 para permitir la eliminación de la kanamicina en nuestros genes-FRT mPGK-Tn5-neo-FRT cassette. NUESTROS RESULTADOS: El gen marcador fue removido como se describe [3], y trabajó con el 90% -100% de eficiencia y se pudo Recuperar s de 100 colonias que se han convertido en kanamicina sensibles.

• Luria Bertani (LB) y los platos de caldo de completarse con antibióticos, según sea necesario

• Totalmente secuenciado BAC, PAC o de otros clones con genes deseados locus. Planta de clones BAC y PAC están ampliamente disponibles en un número de diferentes fuentes, incluidos los laboratorios y organizaciones por ejemplo, El Centro de Recursos Biológicos Arabidopsis (ABRC) http://www.biosci.ohio-state.edu/ ~ plantbio / Servicios / abrc / Abrchome.htm o el Nottingham Arabidopsis Stock Centro (CINA) y en http://arabidopsis.info/, http://www.dna.affrc.go.jp/ genes de arroz y otros. El locus AtSTM utilizados en nuestros experimentos es clonado en el BAC F24o1, provienen de la Arabidopsis Centro de Recursos Biológicos, de Columbus, Ohio.

• pUC basado en vectores que se utilizarán para realizar (i) el locus de rescate brecha de reparación de la construcción (debe ser seleccionable para contrarrestar el BAC / PAC), y (ii) el gen de interés (GOI) dirigidos a la construcción de cassette (debe contener un Marcador seleccionable para contrarrestar la brecha de reparación de la construcción).

• Alta fidelidad Taq ADN polimerasa. Preferiblemente uno que conserva una de las colas para la clonación con fines de asistencia técnica, por ejemplo, la Alta Fidelidad Ampliar sistema de PCR (Roche Diagnostics).

• PCR primers - cuatro locus primers específicos para la amplificación de fragmentos de ADN en el lugar flancos fronterizos de la brecha de reparación de rescate objetivo construir y dos primers específicos del lugar (con un mínimo de 70 pb de longitud) para generar productos destinados a GOI con destino específico sitio 5 'y 3 'homología de las armas.

• PCR de productos y kits de purificación de gel por ejemplo, la gama Qiagen QIAquick ™ y DpnI DpnI enzima de restricción - utilizados para extraer el plásmido de las plantillas de las reacciones de PCR, ya que sólo es transportada metiladas sitios.

• Otros reactivos estándar para la clonación de genes y la electroforesis en gel

Equipo

• agitación orbital incubadora

• agitación orbital baño de agua por ejemplo, la Operación Grant 200 - esenciales para la inducción de la recombinación funciones en las células bacterianas.

• Electroporator por ejemplo, Bio-Rad E. Emisores coli

• Máquina de PCR

• Transiluminador UV de onda larga - onda larga luz ultravioleta es menos perjudicial para el ADN durante la escisión de las bandas de geles. UV-ADN dañado no recombinan con eficiencia.

• Electroforesis equipo capaz de electroforesis en gel de campo de la inversión (FIGE) o electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), por ejemplo, BioRad CHEF DR-II, III o DR-Mapper ™ XA, de la resolución eficiente de grandes fragmentos de ADN

• Espectrofotómetro de densidad celular cuantificación

• Temperatura controlada centrífuga capaz de ejecutar a 4 ° C

Protocolo

Los protocolos indican a continuación describen el desarrollo de (i) una AtSTM-locus específicos brecha de reparación de rescate de vectores, (ii) una planta de genes destinados a la construcción con un marcador de resistencia a kanamicina removible cassette de pGK-FRT [6], bajo el control de ambos Bacterial Tn5 el promotor y el ratón phosphoglycerate quinasa (mPGK) promotor de la selección en procariotas y eucariotas, respectivamente. Esto proporciona plantillas para seleccionable mediante amplificación por PCR de fragmentos de genes que pueden ser adaptadas a cualquier lugar deseado de genes, y (iii) un frijol (Phaseolus coccineus) GAPc2ox1 transformación construir, co-ordinately impulsada por "todos" los elementos AtSTM locus, designado pSTM17 PSTM17 pSTM17:: GAPc2ox1. También hemos construido un pENTR4 basada AtSTM brecha de reparación de rescate de vectores para la producción de un Gateway ™ (Invitrogen) compatible entrada y genérico clon T-ADN transformación construcciones, así como una orientación mgfp5 ER-cassette. El pSTM17 pSTM17 pSTM17:: GAPc2ox1 se ha transformado en azúcar de remolacha, lo que demuestra por primera vez que el ratón PGK promotor es completamente funcional en plantas transgénicas, lo que permite la explotación directa de las herramientas existentes de mamíferos.

Los pasos básicos en la RED-EL250 HR locus procedimiento de rescate y de la ingeniería

1. Diseño de cebadores de PCR para la amplificación del locus de rescate (recuperación) de homología de armas y también para la orientación GOI

2. Construcción de una laguna de reparación de locus de rescate vector.

3. Construcción de un vector que contiene orientación por el Gobierno de la India, antes de la una contra marcador seleccionable (diferente de la de la brecha de reparación de la construcción).

4. EL250 electroporación de células con el BAC o clon que contiene el gen deseado y locus electrocompetent BAC/EL250 preparación de las células inducida por Exo, Beta y Gam funciones.

5. De la brecha de rendimiento de reparación de locus de rescate, en las células tratadas como supra; selección de recombinantes y la confirmación por análisis de restricción de la digestión y la secuencia. Transformación de los rescatados lugar fresco EL250 plásmido en las células.

6. Mediante amplificación por PCR, purificación y cuantificación de la orientación de cassette el Gobierno de la India y su recombinación sitio-específica en el locus rescatados EL250 plásmido en las células. Selección de recombinantes y la confirmación de que el anterior.

El plásmido recombineered está lista para su aplicación en el análisis funcional tal como lo desea.

Primer diseño y construye plásmido
Rojo clonación Protocolo

Original y métodos de información sobre la forma de obtener células huésped puede encontrar en la página web recombineering http://recombineering.ncifcrf.gov/

D: Sustitución de AtSTM exon1 por fusión en el marco de la promotorless GAPc2ox-FRT-FRT orientación neo-cassette

Antes de comenzar: El purificado, DpnI DpnI tratados y cuantificados PCR amplificado GOI orientación casete debe hacerse para participar en este experimento.

1. Uso de hasta 100 ng de la amplificación de PCR GAPc2ox1-FRT-FRT orientación neo-cassette, electroporate inducida STM17/EL250 como se describe en las células B: pasos 1 - 2. Los ataques de cassette se amplificó con HotStar Taq ADN polimerasa (Qiagen) y primers 28001 frtlow y 2oxexon1 (0,3 μ M cada uno) en un 50 μ l de volumen de reacción. Condiciones de incubación fueron: 1 ciclo de 95 ° C durante 1 min seguido de 20 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos, 68 ° C durante 4,5 min. (Con un 5 seg. Incremento en el tiempo de cada ciclo), seguido de 1 ciclo de 68 ° C durante 10 min.

2. Seleccione recombinantes en LB kanamicina. Recuperar plásmidos y confirma con el análisis de restricción de la digestión y la secuencia. Plásmidos están ahora listos para su aplicación en ensayos funcionales. NUESTROS RESULTADOS: Se han recuperado muchas colonias en esta etapa (100 s), de los cuales ~ 6% eran correctos por restricción de la digestión y análisis de la secuencia. Por ejemplo, normalmente seleccionados entre 30 y 35 colonias de las cuales dos eran correctos. Ver Fig. 5 para los resultados de nuestro experimento GOI orientación. NOTA: No es aconsejable en esta etapa, al menos, a través de la secuencia de recombinación sitio en el Gobierno de la India cassette para confirmar la integridad de los genes de cassette antes de proceder con la funcional en los ensayos de plantas transgénicas.

RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS: Alto inducida por un número de colonias en placas de sugerir la orientación selectiva de cassette plantilla de la contaminación en lugar de recombinación. Check DpnI DpnI digiere y utilizar este en combinación con gel de purificación para eliminar ADN de la plantilla objetivo de cassette producto de PCR antes de electoporating de recursos humanos. En nuestra experiencia, si el número de colonias de un inducida por las células es por lo menos 50 - 100 veces inferior a la de las células inducida, se trata entonces de un valor de cribado de colonias de células inducida.

Nuestro final recombineered construir fue designado AtSTM17:: GAPc2ox1 y se transformó en la remolacha azucarera de guardia de células protoplasts [7] de la que hemos podido seleccionado transgénicos callo y kanamicina en virtud de los brotes de selección impulsado por el ratón PGK promotor en la FRT-mPGK-Tn5-neo - FRT cassette (Fig. 6]. Ahora estamos en el proceso de realización de análisis fenotípico de nuestra AtSTM17:: GAPc2ox1 plantas.

Comentarios

La manipulación de grandes fragmentos de ADN para hacer construcciones complejas de la genómica funcional o de la ingeniería genética para el mejoramiento de cultivos es posible mediante la utilización de los recursos humanos en la clonación E. Coli. Hemos utilizado con éxito en la clonación de recursos humanos E. Coli a la sub-clon SHOOTMERISTEMLESS Arabidopsis thaliana (STM) de genes de un locus clon BAC en pBluescript y sustituir el exón 1 secuencias con un Gibberellin 2-oxidasa cDNA de genes de interés cassette estrechamente ligado a un FRT-flanqueado kanamicina gen marcador de selección . Esta casete es de uso genérico, porque en primer lugar, que se pueden orientar / recombineered en cualquier lugar / sitio de destino. En segundo lugar, la resistencia a kanamicina gen se encuentra bajo el control del promotor bacterial Tn5 y el ratón cinasa phosphoglycerate promotor (mPGK), que permiten, respectivamente, para la selección en procariotas y eucariotas. Ahora hemos demostrado la utilidad de la mPGK promotor para la conducción de expresión en plantas transgénicas y esto sugiere que bien puede haber un aumento del alcance de los científicos de plantas a beneficiarse directamente de las herramientas de genética molecular desarrollados para su aplicación en el ámbito biomédico.

E. coli ET-RED-en materia de recursos humanos y la clonación están bien establecidos tecnologías en el ámbito biomédico y tienen muchos usos además de la creación de las construcciones de transformación de largo alcance elementos reguladores. La identificación de elementos reguladores o locus de control de las regiones situadas a una distancia de la secuencia genética puede ser la ayuda de esta estrategia. Mutaciones puntuales, deleciones o inserciones, y fusiones de genes antisentido pueden ser construcciones de ingeniería en cualquier BAC para estudios de genómica funcional. El alcance de la planta de la ciencia es aún mayor por el recientemente informó de la aplicación de los recursos humanos a convertir el BAC en vectores binarios [8] junto con (i) la disponibilidad de un BAC de base física mapa de A. Thaliana, (ii) la libre disposición secuencia del genoma de Arabidopsis información a través de la Iniciativa Genoma, (iii) acceso a los datos de la secuencia del arroz y BAC recursos a través de El Instituto de Investigación Genómica (TIGR) y del Centro de Recursos del Genoma del Arroz (RGP).

Recursos para la RED / ET clonación están disponibles desde Neal Copeland y Nancy Jenkins y de beneficio para ambas organizaciones sin ánimo de lucro. Los detalles se pueden encontrar en la siguiente página web: http://recombineering.ncifcrf.gov/reagent_request.asp. La empresa comercial GeneBridges http://www.genebridges.com/web/company/index.htm también ofrece los reactivos de ADN y un servicio de ingeniería.

Abreviaturas

BAC = cromosoma artificial bacteriano; pb = pares de bases; FIGE = electroforesis en gel de campo de la inversión; 2ox = giberelina GA 2-oxidasa; GFP = gree proteína fluorescente; GOI = gen de interés; HA = homología brazo (s), HR = recombinación homóloga ; LB = Luria Bertani medio; LR = Locus de rescate; mPGK = ratón cinasa phosphoglycerate promotor; OD = densidad óptica; PCR = reacción en cadena de polimerasa; ORF = marco de lectura abierta; rpm = revoluciones por minuto, UV = ultravioleta.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

ESM-G BG y concibe el estudio y participó en su diseño. ESM-G LCR y redactó el manuscrito. LCR participado en el diseño del estudio y se llevó a cabo la mayor parte de la experimentación. ESM-G dirigió los trabajos, participó en el trabajo experimental. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
PCR Primer secuencias
Detalles de los primers utilizados aislar y manipular la
AtSTM
Locus de genes por recombinación homóloga en
E. coli
EL250
Agradecimientos

Ann Mathews, Roz y Sarah Williamson Yallop para la asistencia técnica de análisis molecular y transformación de remolacha azucarera.

El proyecto fue financiado por la Biotecnología y Ciencias Biológicas del Consejo de Investigaciones del Reino Unido como parte del plan ROPA.