Cardiovascular Diabetology, 2005; 4: 16-16 (más artículos en esta revista)

Distintos efectos de la glucosa y de la glucosamina en endotelio vascular y las células musculares lisas: Pruebas de la función protectora de la glucosamina en la aterosclerosis

BioMed Central
Wenlan Duan (wduan@reddyus.com) [1], Latha Paka (SPaka@nshs.EDU) [2], Sivaram Pillarisetti (ram@reddyus.com) [1]
[1] Reddy terapéutica EE.UU., 3065 Northwoods Circle, Norcross, GA 30071, EE.UU.
[2] Angion Biomedica, 350 Community Dr, Manhasset, NY 11030
[3-350 11030, EE.UU.

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Resumen

La aceleración de la aterosclerosis es una de las principales complicaciones vasculares de la diabetes. Factores, entre ellos la hiperglucemia y la hiperinsulinemia puede contribuir a acelerar la enfermedad vascular. Entre los varios mecanismos propuestos para explicar la relación entre la hiperglucemia y la disfunción vascular es la hexosamine vía, en donde la glucosa se convierte a la glucosamina. Aunque algunos experimentos con animales sugieren que la glucosamina Mayo mediar resistencia a la insulina, no está claro si la glucosamina es el mediador de las complicaciones vasculares asociadas a la hiperglucemia. Varios procesos pueden contribuir a la aterosclerosis diabética incluyendo la disminución vascular proteoglicanos sulfato de heparina (HSPG), el aumento de la permeabilidad endotelial y el aumento de las células musculares lisas (SMC) proliferación. En este estudio, hemos determinado los efectos de la glucosamina y la glucosa en las células endoteliales in vitro y SMCs y de la aterosclerosis en ratones apoE nula. La incubación de células endoteliales con la glucosamina, pero no de glucosa, aumentado matriz HSPG (perlecan), que contiene secuencias similares a la heparina. El aumento de HSPG en células endoteliales se asoció con disminución de las proteínas de transporte a través de monocapas de células endoteliales y los monocitos disminuido vinculante a subendothelial matriz. SMC aumento de la proliferación de glucosa, mientras que la glucosamina, inhibió el crecimiento de SMC. El efecto antiproliferativo de la glucosamina fue mediado a través de la inducción de la perlecan HSPG. Hemos probado si la glucosamina afecta el desarrollo de aterosclerosis en ratones apoE-nula. La glucosamina redujo significativamente la lesión aterosclerótica en la raíz aórtica. (P <0,05) Estos datos sugieren que la enfermedad macrovasculares asociadas a la hiperglucemia es poco probable debido a la glucosamina. De hecho, el aumento de la glucosamina HSPG mostró atheroprotective efectos.

Introducción

Incluida la disfunción vascular generalizada microvasculares (nefropatía) y macrovasculares (aterosclerosis acelerada) es una característica de las complicaciones de la diabetes [1 - 3]. Hiperglucemia por varios mecanismos pueden contribuir a un aumento de la aterosclerosis. Intracelular de glucosa pueden aumentar el estrés oxidativo y la generación de especies reactivas del oxígeno en las células endoteliales [3]. Esto puede resultar en la activación de factores de transcripción Redox sensibles como el factor nuclear kappa B, y de los genes inflamatorios. La glucosa puede formar aductos con proteínas por mecanismos no enzimáticos conducentes a la generación de proteínas glucosilada y avanzado glycation productos finales (AGE) [4, 5]. En diferentes modelos animales bloqueando EDAD y de su receptor RAGE reducción de las enfermedades vasculares [6]. Otra vía que se ha postulado a desempeñar un importante papel en la resistencia a la insulina y complicaciones vasculares potencialmente es la vía hexosamine [7, 8]. En esta vía de la glucosa se convierte a la glucosamina por la acción enzimática de la glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferase (GFAT). In vitro de determinados tipos de células en la glucosamina fue demostrado que aumenta la expresión del factor de crecimiento TGF β y PAI-1 [9, 10]. La glucosamina es también el precursor de la biosíntesis de proteoglicanos y aumenta la producción de proteoglicanos incluidos los proteoglicanos heparán sulfato (HSPG) en la producción de diferentes tipos de células incluyendo las células vasculares.

En la pared vascular HSPG son producidos por todos los tipos de células, ya sea como componentes de la membrana celular (syndecan y glypican) o la matriz extracelular (perlecan) [11]. Perlecan es el principal HSPG de las células endoteliales y SMC [12, 13]. En lesiones ateroscleróticas el contenido de HSPG se reduce y los estudios muestran una correlación inversa entre la cantidad de colesterol en la lesión y la concentración de HS [14, 15]. Así, a diferencia de chondroitin sulfato proteoglicanos, HSPG se correlacionó negativamente con la aterosclerosis.

En este estudio demuestran que la glucosamina y la glucosa tienen diferentes efectos sobre la HSPG vascular y crecimiento de las células y la glucosamina en virtud de sus efectos beneficiosos en las células vasculares también reduce la aterosclerosis en ratones.

Métodos
Materiales

D (+) La glucosamina y la D (+) glucosa fueron adquiridos de Sigma Chemical Co (St. Louis, MO). L-(4,5 3 H) Leucine, 3 H-Thymidine, (35 S) como sulfato de la solución acuosa y (125 I) de Amersham Life Science Corp (Arlington Heights, IL). Heparinase, heparitinase y chondroitinase ABC fueron comprados a Seikagaku América Inc (Bethesda, MD).

Lipoproteínas

LDL (d <1,063), Lp (a) (d = 1,11) y HDL (d = 1,1-1,23) fueron aisladas de plasma fresco por ultracentrifugación secuencial. Para algunos experimentos I-125 radio-LDL yodados usando yodo monochloride [5] se utilizó.

Células endoteliales

Células endoteliales de aorta bovina fueron aisladas y cultivadas, tal como se describe [20]. Las células (5-20 pasajes) fueron cultivadas en medio esencial mínimo con 10% de SFB (-Life Technologies, Gaithersburg, MD).

125 I-LDL transporte

I-125 para el transporte de LDL experimentos, las células endoteliales se cultivaron en el cultivo de tejidos inserciones (Falcon-0,3 μ m de tamaño de poro) para facilitar su acceso a la parte superior (luminal) y menor (subendothelial) superficie de las células endoteliales. La función barrera de las células endoteliales monocapa se examinó como en el informe anterior [16], con [3 H] dextrano (media mol wt 150.000) y [14 C] albúmina. Transporte de estas moléculas de la apical a la basolaterales lado de la monomoleculares fue <5% / h, una velocidad similar a la de los demás. Al final de cada experimento LDL transporte, la monocapas se tiñeron con un 2% de toluidene azul para verificar la uniformidad de la monocapa. En el día de la prueba, 125 I-etiquetados LDL fue añadido a la cámara alta y después de incubación radiactividad en la sala inferior-medio y asociado a la matriz extracelular se determinó. El importe total de cada transportado a través de la lipoproteína de monocapas (red de transporte) es la suma de estas dos mediciones. Para determinar la etiqueta 125 I-LDL asociado a la matriz subendothelial de células, las células fueron incubadas durante 10 minutos con soporte de 50 U / ml de heparina (Elkins-Sinn, Inc, Cherry Hill, NJ)

Metabólicas etiquetado y preparación de subendothelial matrix (SEM)

PG endotelial se radiomarcado con (35 S) sulfato junto con la dosis indicada de la glucosamina para 12-16 h. PG celular se evaluó mediante la eliminación de las células con Triton X-100/NH 4 OH. Células endoteliales fueron cultivadas en 24 o 48 y placas (Falcón: Beckton Dickinson, Lincoln Park, NJ). Subendothelial matriz (SEM) se preparó como se describe [17]. En pocas palabras, confluente monocapas de células endoteliales se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 10 minutos en una solución que contenga 0,1% TritonX-100 y 20 mM NH 4 OH a temperatura ambiente. Independiente células fueron eliminadas por el lavado cuatro veces con PBS. Este procedimiento deja intacta la matriz adjunta a la superficie del pozo. Matrix PG fue extraído con guanidina 6 M HCl durante 4 horas a 4 ° C. Para tratamientos de enzimas, SEM se incubaron con una mezcla de heparinase y heparitinase (1 U / ml cada una) o chondroitinase ABC (1-2 U / ml) durante 3 horas a 37 ° C.

Glicosaminoglicanos (GAG) estimación del tamaño

Para preparar las cadenas de GAG, de 1 ml alícuotas de la superficie celular PG purificados fueron tratados con 100 μ l de 10 N NaOH durante 18 horas a 26 ° C con agitación constante y luego neutralizados con 10 N HCl [18]. Para eliminar las proteínas básicas, las muestras se ajustaron a 7 M urea y cargados en 1 ml DEAE mini columna que antes era equilibrado con 3 cama volúmenes, de 7 M de urea, 0,1% Tritón X-100, 0,2 M en NaCl 0,05 M Tris, PH7.2. Peak fracciones se combinaron y dializados contra Tris 10 mM y 0,1% Tritón X-100 para eliminar la urea. Para determinar el tamaño de GAG, de 0,6 ml por encima de la proteína GAG libre se chromatographed sobre Sephacryl-200 (Pharmacia-Biotech) gel-filtración de la columna que fue previamente calibrado con estándares de peso molecular conocido utilizando 0,2 M NaCl como un eluido.

Monocitos y la adhesión de ensayo

HTP-1 células fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Rockville, MD) y fueron cultivadas en RPMI 1640 (Gibco-Laboratories, Grand Island, NY) con 10% de suero fetal bovino (Gemini Bioproducts Inc, Calabasas, CA).

La adhesión de ensayo se realizó como se describió anteriormente [19]. Monocitos fueron incubadas en leucina libre MEDM-BSA medio antes de etiquetado. 100 μ Ci (3 H) leucina se añadió a 1 × 10 7 células y se incubaron durante otros 2 h bajo condiciones de cultivo de células. La etiqueta células fueron centrifugadas a 800 rpm durante 5 minutos para eliminar la etiqueta no incorporado. Las células fueron lavadas tres veces y volvió a suspenderse en MEDM-BSA y luego añade a las células endoteliales a SEM monocapas o bien en 24 placas (24 × 10 5 células / así). Encuadernación se realizó durante 2 h a 37 ° C. No monocitos fueron retirados por lavado cuatro veces con MEDM-BSA y los vinculados con la radiactividad se extrajeron 0,5 N NaOH durante 1 h a 37 ° C y luego se cuentan.

SMC proliferación

Rat aórtica SMCs se cultivaron a lo descrito previamente [20] basal en el medio suplementado con factores de crecimiento, bFGF, hEGF y el 5% de suero fetal bovino (Clonetics Corp, San Diego, CA). SMCs se chapada en baja densidad (9 × 10 4 células / así) en 6 o 12 platos y bien cultivadas en la presencia o ausencia de 30 mM de glucosa o 2,5 mM glucosamina durante tres días. Las células fueron entonces trypsinized y una alícuota de trypsinate fue contado para la final con el número de células hemacytometer. Crecimiento neto fue evaluada por restando el número final de células de la serie inicial de la célula.

En otros experimentos, las células cultivadas a condiciones anteriores fueron etiquetados con (3 H)-timidina (5 μ Ci / ml) durante 6 h, y las células se lavaron cuatro veces con MEDM-BSA para eliminar la etiqueta no incorporado. Las células fueron lisadas en 0,5 N NaOH y de la incorporación de timidina en el ADN se evaluó.

Los estudios en animales
Resultados
La glucosamina, pero no aumenta la glucosa 35 SO 4 incorporación en endotelial HSPG

Para determinar si la glucosamina aumenta la producción HS endoteliales, células endoteliales de aorta proteoglicanos fueron etiquetados con 35 S sulfato. La glucosamina tratamiento aumentó 35 SO 4 incorporación a los medios de comunicación PG por 2 veces y en la matriz PG por 3 veces (Figura 1A]. Además de la glucosa (30 mM) a la mediana no afecta a la producción de PG. Enzimática análisis mostró que el incremento se consideró exclusivamente en HSPG glucosamina y el tratamiento no afectó CS / DS PG en las células endoteliales (Figura 1B]. Perlecan es el principal HSPG secretada por las células endoteliales, por lo tanto, comprobar si el aumento fue en perlecan. PCR en tiempo real el análisis mostró un aumento de 1,9 veces perlecan ARNm (Figura 1C bares) y en consonancia con immunoprecipitation este análisis mostró que los medios de comunicación de las células tratadas contienen glucosamina 2,3 veces en medio perlecan (Figura 1C línea). Así, estos datos sugieren que la glucosamina principalmente el aumento de las células endoteliales perlecan. Altamente sulfatados bloques de SA se denominan como la heparina-HS, que confieren varias propiedades biológicas a HS. Para identificar la heparina como el SA-GAG, matriz HSPG fueron sometidos a heparitinase digestión, seguido de bajo pH ácido nitroso [18, 21]. Heparitinase resistentes y sensibles al ácido nitroso SA se aumentó en dos veces (2300 cpm en el control frente a 4550 cpm en glucosamina tratados) lo que sugiere que la glucosamina tratamiento de las células endoteliales, como el aumento de la heparina-HS. La glucosa o la glucosamina no aumentó significativamente los macrófagos PG glucosamina, pero mostró un incremento moderado de SMC HSPG (Figura 2].

La glucosamina tratamiento mejoró la función endotelial barrera

Subendothelial matriz HSPG se cree que desempeñan un papel clave en la función de barrera endotelial, sin embargo, si aumenta la disminución de las lipoproteínas de HSPG transporte a través de monocapas endoteliales no se conoce. En primer lugar, si la prueba de eliminación de HSPG LDL aumenta el transporte a través de endotelio. La eliminación de HSPG por heparinase tratamiento dado lugar a un aumento de 2,1 veces en 125 I-LDL de transporte en 10 min. (Figura 3A]. A los 15 min y 30 min el aumento en el transporte de LDL fue de 57% y 36% mayor que los controles. Por el contrario, el tratamiento después de la glucosamina, 125 I-LDL transporte en la CE monocapas disminuyó un 15-22% del tiempo en diferentes puntos de la glucosamina en las células tratadas (Figura 3B].

Monocitos vinculante a la matriz disminuye en la glucosamina tratadas las células endoteliales

Estamos anteriormente mostró que la eliminación de HSPG aumentos en la retención de los monocitos subendothelial matriz [19]. Estamos decididos HTP-1 monocitos a la subendothelial preparado a partir de la matriz de control, la glucosa tratados con glucosamina y células. Monocitos vinculante a la glucosamina estimula las células endoteliales se redujo en 52% en comparación a los no estimulados células (Fig. 3C]. En contraste monocitos vinculante a la glucosa tratados con células endoteliales fue aumentado ligeramente similar a observaciones anteriores (20%, que no se muestran ref [22]].

La glucosa y glucosamina efectos en la PG en el SMC-glucosamina, pero no trato de glucosa disminuye la proliferación de SMC

Estamos próximos determinado los efectos de la glucosa y de la glucosamina en SMC proliferación. Sub-SMC confluyentes fueron incubadas en los medios de comunicación que contiene 30 mM de glucosa o 2,5 mM glucosamina durante 48 h, y se determinó el crecimiento neto. De glucosa en el tratamiento no alteró el crecimiento SMC, evaluada por el número de células (Figura 4A] o de la incorporación de timidina (Figura 4B]. En contraste, el número de células y 3 H timidina incorporación en el ADN se redujo en un 60% por la glucosamina tratamiento (4A y B). Los principales HSPG secretada por SMC perlecan es, que es sabido que la correlación negativa con el crecimiento de SMC [11]. Immunoprecipitation análisis mostró un aumento de 2,5 veces en perlecan proteína SMC tratados con glucosamina (no se muestra). Estamos próximos a prueba si media la perlecan efecto antiproliferativo de la glucosamina en la SMC. Además de un anticuerpo anti-perlecan abolido completamente el efecto antiproliferativo de la glucosamina en la proliferación de SMC (Figura 5]. Estos resultados sugieren que la glucosamina perlecan tratamiento aumenta la producción, que a su vez modula SMC crecimiento en la proliferación de células. De conformidad con un mecanismo basado en perlecan, glucosamina no inhibió el crecimiento de las células endoteliales (Figura 4C]

La glucosamina aumenta SA y reduce la lesión aterosclerótica de la raíz aórtica en vivo

Hemos probado los efectos sobre la glucosamina y la aterosclerosis HSPG. Cuando se administra por vía intraperitoneal (5 mg / kg una vez al día durante 3 días) aumentó 35 S glucosamina sulfato de incorporación en HSPG en hígado (en un 61%) y el corazón (por 82%) (Figura 6]. Para determinar los efectos de la glucosamina en la aterosclerosis, ratones apoE null fueron tratados con glucosamina en dosis de 5 mg / kg durante 2 meses. Plasmáticas de glucosa y colesterol total no se vio afectada por la glucosamina (no se muestra). Oil Red-O tinción reveló reducción del 30% en lesiones de la glucosamina en el grupo tratado (p <0,05) (Figura 7]. Estos datos sugieren que la enfermedad macrovasculares asociadas a la hiperglucemia es poco probable debido a la glucosamina. De hecho, la glucosamina por inducir HSPG mostró atheroprotective efectos.

Discusión

La glucosamina es un precursor de la biosíntesis de GAG. En células de la glucosamina se produce a partir de la glucosa por la vía hexosamine en una reacción que requiere la fructosa 6-fosfato y de la glutamina y catalizada por la enzima glutamina: fructosa-6 fosfato amidotransferase [7, 8]. Acerca de 1-2% de la entrada de la glucosa entre en esta vía. La glucosamina se utiliza principalmente para la glicosilación de proteínas y síntesis de GAG [23]. Aunque las células pueden sintetizar la glucosamina, la glucosamina exógenos también puede ser asumido y convertido a su derivado 6-fosfato, que puede utilizarse para la síntesis de HSPG. Los estudios actuales demuestran que la glucosamina y la glucosa tienen efectos sobre HSPG vascular y la proliferación celular. A diferencia de la glucosa, aumento de la glucosamina matriz HSPG (perlecan) tanto en la producción de las células endoteliales y SMC. Aumento de la incorporación de sulfato de glucosamina específicamente en HSPG.

Varios estudios anteriores sugirieron un papel de la glucosamina en el desarrollo de la resistencia a la insulina [8, 24]. Sobre la base de varios estudios in vitro glucosamina dijo también a ser un jugador de mediación en las complicaciones cardiovasculares [7, 9]. Estos observación recibido gran atención debido a la glucosamina es usado a menudo por los pacientes con artrosis [25]. Sin embargo, estudios recientes muestran que en los seres humanos a las dosis utilizadas por los pacientes con artritis glucosamina no parece inducir resistencia a la insulina [26].

Pérdida de la endoteliales SA ha postulado para dirigir a varios eventos patológicos, en especial a los acontecimientos relacionados con la aterosclerosis [13, 27]. Agentes que incluyen disminución endotelial HSPG, lipopolisacárido, TNF-alfa [28], [29] de homocisteína, lysolecithin y LDL oxidadas [30]. Por lo tanto, disminución de la TA puede ser una reacción inflamatoria.

En la aterosclerosis, CS / DS PG positivamente correlacionado con la progresión de la lesión [14, 15]. Así, la glucosamina tratamiento no sólo aumentó atero-protectora HSPG sino también disminuyeron (en SMC, la figura 2B] o no afectó (en células endoteliales, la figura 1B] aterogénico CS / DS PG. La glucosamina también aumentó la cantidad de heparina como el SA-(oligosacáridos secuencias que son resistentes a la digestión heparitinase pero sensible a heparinase y bajo pH ácido nitroso) en las células endoteliales. Subendothelial HSPG (perlecan) contiene cantidades importantes de estas secuencias [31]. En nuestros experimentos, principalmente el aumento de la glucosamina extracelular HSPG (en los medios de comunicación y en la matriz).

La glucosamina tratamiento también inhibe la proliferación de SMC. El alcance de esta inhibición es mucho mayor que el de otras sustancias antiproliferativas como apoE, el óxido nítrico y TGF-β (no se muestra). El efecto antiproliferativo de la glucosamina es más probable debido a la mayor producción de HSPG en los medios de comunicación. Ha sido bien documentado que, si bien la superficie celular HSPG son necesarios para la actividad del factor de crecimiento (como co-receptores) exógenos HSPG son un inhibidores potentes de SMC proliferación [32, 33]. Perlecan es el principal HSPG secretada por SMC y que se correlaciona negativamente con SMC proliferación [34]. En el presente estudio de la lucha contra la perlecan anticuerpo completamente bloqueado glucosamina efecto antiproliferativo. Estos datos sugieren que la glucosamina inhibe la proliferación de SMC por el aumento de los medios de comunicación perlecan. Estos datos también muestran que la inhibición del crecimiento de SMC glucosamina no es debido a la toxicidad general de la célula. Entre las células vasculares sólo SMC, pero no las células endoteliales y los macrófagos, son sensibles a la inhibición HSPG. En consonancia con este glucosamina no inhibió el crecimiento de las células endoteliales.

¿Cómo glucosamina aumento de la producción perlecan no está claro. Nuestros datos sugieren que el aumento de la glucosamina HS contenido de GAG, pero no la longitud de la cadena. Perlecan porque contiene sólo tres cadenas de HS por núcleo de proteínas, es concebible que más perlecan núcleo de proteínas se asocia con HS cadenas de facilitar su secreción. Alternativamente, la glucosamina puede haber inducido perlecan expresión. La glucosamina también es utilizado para la glicosilación de las proteínas incluidos ciertos factores de transcripción. Glicosilación estado de los factores de transcripción afecta a su actividad [35]. Por lo tanto, es concebible que la glucosamina tratamiento aumento de la glicosilación de los factores de transcripción perlecan expresión. La glucosamina también fue mostrado para inducir la expresión del factor de crecimiento [36 - 38], como el TGF β, que pueden estimular el perlecan [39]. Sin embargo, cabe señalar que en estos estudios, en contraste con los experimentos actuales, las altas concentraciones de glucosa tuvo el mismo efecto que el de la glucosamina. No obstante, si esto ocurre, desde perlecan anticuerpo bloqueó el efecto antiproliferativo de la glucosamina, estos datos plantean la posibilidad de que los efectos antiproliferativos de TGF β son mediados por perlecan.

Nuestros datos también mostraron que la glucosamina administración a ratones aumentó 35 SO 4 incorporación a los tejidos. La glucosamina es tomado por las células a través de los transportadores de glucosa y, por lo general ausente en el plasma circulante [40]. Una dosis de 5 mg / kg de glucosamina durante tres días aumentaron 35 SO 4 incorporación en el hígado en un 82% y en los corazones (en el que figura la aorta proximal) en un 61%. Queda por determinar si este aumento es específicamente en HSPG. El efecto in vivo de la glucosamina fue probado en otro estudio. Debido CS y DS PG se cree que las lipoproteínas de mediar en la retención y por lo tanto, aterogénico. Recientes estudios in vitro mostraron que la glucosamina proteoglicanos inducida han reducido, por lo tanto, vinculante a menos aterogénico LDL [41]. En un estudio anterior se examinó el efecto de la glucosamina en el plasma y el colesterol aórtico en conejos [42]. Sorprendentemente, en este estudio se encontró un doble disminución del colesterol / unidad de peso húmedo de la aorta. Sin embargo, nuestros datos muestran que la glucosamina aumenta, pero no sólo HSPG CS / DS puede explicar por qué se redujo la acumulación de las lipoproteínas. La capacidad de la glucosamina para inhibir la aterogénesis recientemente se ha postulado [43] y se ha demostrado en nuestro estudio de los ratones apoE nula. Esto ocurrió sin cambios en los lípidos y la glucosa plasmática. En conjunto con nuestros datos actuales, el estudio de los efectos del aumento de la aterosclerosis HSPG parece ser factible en ratones.

En resumen, nuestros datos muestran que la glucosamina aumenta la producción de HSPG en células vasculares y 35 SO 4 incorporación en el tejido. PG aterogénico, como CS / DS PG no se aumentaron. Al aumentar HSPG, glucosamina reducido de lipoproteínas aterogénicas, incluyendo el transporte, la retención de monocitos y la proliferación de SMC, que combinado con el efecto protector sobre la lesión aterosclerótica en ratones apoE nula, el aumento de la posibilidad de que se trata de un potencial agente anti-aterogénicas.

Abreviaturas

HSPG - proteoglicanos heparán sulfato, PG-proteoglicanos, LDL-lipoproteínas de baja densidad, SMC - células del músculo liso, GAG - glicosaminoglicanos

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

WD realizado estudios in vivo e in vitro LP realizó estudios. SP diseñado, supervisado el estudio y el apoyo proporcionado.

Agradecimientos

Estos estudios fueron, en parte, el apoyo de una subvención de la ayuda Investigatorship y de la Asociación Americana del Corazón, la ciudad de Nueva York de afiliados.