Genetic Vaccines and Therapy, 2005; 3: 8-8 (más artículos en esta revista)

A juicio de los genes somáticos de orientación en vivo con un vector de adenovirus

BioMed Central
Asami Ino (ino@nibio.go.jp) [1], Yasuhiro Naito (ynaito@sfc.keio.ac.jp) [1], Hiroyuki Mizuguchi (mizuguch@nibio.go.jp) [4], Naofumi Handa ( Nhanda@ims.u-tokyo.ac.jp) [1], Takao Hayakawa (hayakawa-takao@pmda.go.jp) [5], Ichizo Kobayashi (ikobaya@ims.u-tokyo.ac.jp) [1 ]
[1] Departamento de Ciencias del Genoma de Medicina, Escuela de Estudios Superiores de Ciencias de la Frontera, Universidad de Tokio y el Instituto de Ciencias Médicas de la Universidad de Tokio, 4-6-1 Shirokanedai, Minato-ku, Tokio 108-8639, Japón
[2] Programa de Postgrado en Biofísica y Bioquímica, Escuela de Estudios Superiores de Ciencias de la Universidad de Tokio
[3] Department of Environmental Information, Keio University, 5322 Endo, Fujisawa, Kanagawa 252-8520, Japan
[4] Laboratorio de Transferencia de genes, y el Reglamento del Instituto Nacional de la innovación biomédica, Asagi 7-6-8, Saito, Ibaraki, 567-0085 Osaka, Japón
[5] Productos farmacéuticos y dispositivos médicos Agencia, Shin-Kasumigaseki Bldg. 3-3-2, Kasumigaseki, Chiyoda-ku, Tokio 100-0013, Japón

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Resumen
Antecedentes

Gene orientación in vivo proporciona un método potencialmente poderosa para el análisis genético y la terapia génica. Con el fin de detectar sensibilidad y medir con precisión la secuencia de los cambios diseñados, hemos utilizado un ratón transgénico sistema, MutaMouse, que se ha desarrollado para la detección de la mutación in vivo. Es la sede de bacteriófago lambda + lacZ genoma con genes, cuya variación a lacZ-negativos alelo es detectado in vitro después de los envases en las partículas de bacteriófago. También hemos demostrado que la transferencia de genes con una reproducción de vectores de adenovirus defectuosos pueden lograr eficiente y precisa la orientación de genes in vitro.

Métodos

Un 8 kb largo de ADN correspondiente a la bacteriófago lambda transgén con uno de los dos lacZ-negativos sola base de la sustitución de par-alelo mutante se insertó en una reproducción de vectores de adenovirus defectuosos. Este adenovirus recombinante se inyectó a los ratones transgénicos a través de la vena de la cola. Veinticuatro horas más tarde, el ADN genómico fue extraído del hígado y el tejido lambda:: lacZ fueron recuperados por in vitro embalaje. El lacZ-negativos fagos se detectó como una placa de agar con ex fenil-beta-D-galactoside.

Resultados

La frecuencia de los mutantes-lacZ negativo adenovirus recombinante ratones fue inyectado en el mismo nivel de control con el ratón (~ 1 / 10000). Nuestra mayor limitación análisis no detectó diseñado recombinante.

Conclusión

La frecuencia de genes de la orientación en el hígado del ratón por estos adenovirus recombinante ha demostrado ser inferior a 1 / 20000 en nuestro ensayo. Sin embargo, estos resultados ayudarán a la elaboración de un sensible, confiable y ensayo de PCR-independiente de la orientación de genes in vivo mediado por el virus de vectores y otros medios.

Antecedentes

Gene orientación, que es precisa la alteración de la información genómica por recombinación homóloga, ha proporcionado un poderoso medio de análisis genéticos en los microorganismos y los sistemas de mamíferos [1]. En los sistemas de ratón, las células troncales embrionarias in vitro líneas modificado puede ser utilizado para generar ratones que son alterados en la línea germinal. Si el gen de orientación de las células somáticas es posible gracias a la transferencia de genes in vivo, facilitará el análisis de la función de genes, y proporcionar un medio de la terapia génica de enfermedades genéticas y otros [2].

Hay dos grandes problemas inherentes a la utilización de la orientación de genes in vivo. En primer lugar, su baja eficiencia hace que sea difícil de detectar y analizar. Un sensible y preciso sistema de medición, por lo tanto, es necesario para detectar este tipo de eventos de baja frecuencia. Aunque ha habido varios informes de genes de la orientación en el hígado de rata con oligonucleótidos diseñados específicamente [3, 4], su reproducibilidad sigue siendo controvertido [5]. PCR basado en los métodos de detección podría ser inexacta y por lo tanto, propensos a diversos artefactos. Con el fin de detectar y medir la orientación de genes en ratones con la suficiente sensibilidad, usamos un bacteriófago ratón transgénico-sistema, MutaMouse, que se ha desarrollado para la detección de mutagénesis in vivo (Figura 1] [6]. El tándem repite MutaMouse lleva de la bacteriófago lambda genoma con el gen lacZ +, en la que el cambio a un lacZ-negativos alelo se detecta después de su embalaje in vitro viables en partículas de bacteriófago.

El segundo gran problema con la orientación de genes in vivo es que no recombinación homóloga es mucho más frecuente que la recombinación homóloga en células de mamífero. Raras precisión células modificadas son seleccionados y purificado en el caso de las células madre embrionarias que son tratadas in vitro. Por la orientación de genes in vivo, impreciso modificación sería perjudicial para usos analíticos y fines terapéuticos. Precisa la modificación genética que se ha logrado de manera eficiente el uso de replicación defectuosa adenovirus vectores para la entrega de genes in vitro [7, 8]. Fujita y colegas usaron un plásmido de mamíferos como un modelo objetivo [7]. El gen de orientación era frecuente (~ 10 -4 por casilla) y el análisis de los productos reveló que recombinación homóloga fue más frecuente que la recombinación homóloga no. Una posible razón de esta protección es de alta precisión de la ADN viral por la terminal de la proteína, que se adjunta covalentemente a los extremos del ADN viral y de otras proteínas virales durante su traslado al núcleo y ADN diana. Escapadas sin protección en el ADN llevaría a la no recombinación homóloga.

El adenovirus es útil para la entrega de genes in vivo, ya que cuenta con una amplia gama de acogida, es fácil de preparar a un alto título y sólo rara vez se integra en el genoma huésped no por recombinación homóloga [9, 10]. Hasta la fecha, más de 170 estudios clínicos han utilizado vectores de adenovirus recombinante para expresar cDNA en los seres humanos [11]. De la infección por adenovirus numerosos experimentos se han llevado a cabo con ratones, y han establecido que la inyección de adenovirus recombinantes en el ratón de cola-vena conduce a la expresión de sus genes en aproximadamente la mitad de las células del hígado [12, 13].

En el presente estudio, se determinó la orientación de genes en el hígado del ratón utilizando una reproducción de vectores de adenovirus defectuosos y un ratón transgénico sistema (Figura 1]. Aunque nuestros intentos iniciales no detectó el gen predice la orientación (la frecuencia de la esperada recombinantes fue de menos de 1 / 20000 por lambda genoma), la estrategia y los métodos detallados aquí se ayuda al desarrollo de virus de genes mediante la orientación in vivo.

Materiales y métodos
Las bacterias, bacteriófagos y plásmidos

Las bacterias, bacteriófagos y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran junto con los detalles de su construcción en el archivo adicional 1.

BIK12001 se utilizó para la valoración de bacteriófago lambda y la medición de lacZ-negativos bacteriófago lambda por fenil beta-D-galactoside (p-gal) selección (véase más adelante). BIK1564 se utilizó para el crecimiento de todas las cepas bacteriófago lambda en este estudio. BIK2206 se utiliza para la confirmación de la negativa LacZ-fenotipo de la bacteriófago seleccionados con p-gal usando 5-bromo-4-cloro-3-indlyl-beta-D-galactosa (X-gal).

La construcción de los plásmidos utilizados en este estudio se detalla en el archivo adicional 1. La construcción de pAdNY58 también se ilustra en la Figura 2. La construcción de pAdNY57 fue el siguiente. El SmaI (1)-SacI fragmento de LIA7 en el gen lacZ (Figura 2] se utiliza para sustituir al más corto SmaI-SacI fragmento de pUC18. El Glu461Gly mutación (Figura 3] se introdujo en el plásmido resultante (pNY15) por sitio de mutagénesis dirigida mediante PCR [14] de la siguiente manera. La PCR productos generados con el primer par LZG-U (5'-ACCGGCGATGAGCGAA-3 ') y LZG-MA (5'-GCCTGATCCATTCCCCAGCGACCA-3'), y el primer par LZG-MS (5'-GGGAATGGATCAGGCCACGGCCGC-3 ') Y LZG-D (5'-GGGCTGGTCTTCATCC-3 '), se mezclan y se utilizan como plantillas para la segunda ronda de PCR con el primer par LZG-U y LZG-D. El MluI-BssHII fragmento de la naturaleza de tipo de gen lacZ pNY15 fue sustituido por el MluI-BssHII fragmento de la PCR producto. Los dirigidos cambio en la resultante plásmido (pNY15G3.11) fue confirmado por secuenciación. PNY20 fue producido por la sustitución de los más pequeños SmaI-SacI fragmento de pNY19 con la homóloga SmaI-SacI fragmento de pNY15G3.11, que lleva la secuencia mutante.

Estas dos mutaciones lacZ fueron trasladados de nuevo a lambda por recombinación homóloga in vivo [15], a fin de generar LIA15 y LIA11, respectivamente. Recombinational La transferencia se llevó a cabo de la siguiente manera. Las células de BIK12015 o BIK12018 fueron aumentado a 600 OD = ~ 0,3 en LB (10 g bactotrypton, 5 g de extracto de levadura y 10 g de NaCl por litro), que contiene 20 μ g / ml de cloranfenicol, un 0,2% de maltosa y 10 mM MgSO 4. LIA7 fue adsorbido a las células en una multiplicidad de 1,0 a 37 ° C durante 15 minutos. La mezcla se agita a 37 ° C hasta los 600 OD descendido por debajo de 0,3. Una sola gota de CHCl 3 fue agregado a la mezcla, que luego fue sacudido por 30 segundos. La mezcla fue centrifugada y el sobrenadante fue recuperado. El sobrenadante fue ensayada para BIK12001 sobre placas de agar que contiene p-gal como se detalla a continuación. Las placas en el p-gal placas fueron aislados y analizados para la secuencia de cambio diseñado por la restricción de productos PCR (véase el análisis de los mutantes de ADN bacteriófago).

Selección de lacZ-negativos bacteriófago con p-gal

El lacZ-negativos se detectaron partículas de bacteriófago utilizando selección positiva [15, 16]. BIK12001 células fueron cultivadas con agitación a 37 ° C para OD 600 = 1,0 en LB que contiene ampicilina (50 μ g / ml), kanamicina (20 μ g / ml) y 0,2% de maltosa. La cultura se centrifuga a 3500 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. Los pellets se disuelve en la mitad del volumen de LB con 10 mM MgSO 4. El bacteriófago fue adsorbido en estas células a temperatura ambiente durante 20 minutos. Para estimar el número total de bacteriófagos, 2,5 ml fundido 1 / 4 LB top agar (5 g LB caldo base (Gibco BRL, Rockville, MD, EE.UU.), 6,4 g de NaCl y 7,5 g por litro Bactoagar) fue añadido a 0,25 ml de La mezcla de células y bacteriófagos, y todo el contenido se vierte en un 1 / 4 LB placa (5 g LB caldo base, 6,4 g de NaCl y 15 g por litro Bactoagar). Para estimar el número de negativas de bacteriófagos-lacZ, 2 ml de la mezcla de células y bacteriófagos, y 22 ml de líquido 1 / 4 LB top agar que contiene 0,3% p-gal (Sigma Chemical Co, MO, EE.UU.), fueron mixtos Y vierte sobre cuatro 1 / 4 LB placas. Las placas fueron incubadas a 37 ° C durante 12 horas.

Construcción de adenovirus recombinante

PNY56 fue construido mediante la sustitución de los más cortos XbaI-BamHI fragmento de pHM5 por el XbaI-BglII fragmento de pNY19 (Figura 2]. PAdHM4 incluye todo el genoma de los vectores de adenovirus recombinante. El plásmido pAdNY56 fue construido mediante la sustitución de los más cortos CeuI-I-PI-SceI fragmento de pAdHM4 por un I-CeuI-PI-SceI fragmento de pNY56. El PacI fragmento de pAdNY56 se transfectadas en células de la línea celular 293, que permite la reproducción de la reproducción-adenovirus defectuosos. El adenovirus recombinante AdNY56 fue preparado y purificado como se describe anteriormente [18]. De igual manera, se construyó AdNY57 de pNY20 través pNY57 (archivo adicional 1], y se construyó AdNY58 de pNY21 través pNY58 (Figura 2, la archivo adicional 1].

La infección por adenovirus

Mujeres MutaMice (7 semanas de edad) se obtuvieron de Covance de Investigación Products Inc (Denver, PA, EE.UU.). El MutaMice se mantuvieron en determinadas condiciones libre de agentes patógenos animales en la facultad del Instituto de Ciencias Médicas de la Universidad de Tokio, Japón. Después de los animales fueron anestesiados con Nembutal (Dainippon Farmacéutica Co, Osaka, Japón), 3 × 10 9 unidades formadoras de placa (PFU), de los adenovirus recombinante en 200 μ l de PBS (137 mM NaCl, 8,10 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4, 0,9 mM CaCl 2, 0,33 mM MgCl 2) se inyecta en la vena de la cola de cada ratón usando una aguja de calibre 30. AdNY56 se inyecta en un ratón, AdNY57 fue inyectado en dos ratones y AdNY58 fue inyectado en dos ratones.

Aislamiento de ADN genómico, la recuperación de bacteriófago lambda y medición de la frecuencia de mutantes

Veinticuatro horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados. Un lóbulo del hígado de cada animal fue extirpada, congelados por la inmersión en nitrógeno líquido y se almacenan en una de 1,5 ml tubo de plástico a -80 ° C. ADN genómico se aisló de tejido del hígado con fenol-cloroformo y se precipitó por el etanol o sodio como se describe en el manual de MutaMouse. Bacteriófago lambda partículas se recuperaron de ADN aislado de los envases con extractos de incubación (Mutaplax, Epicentro, WI, EE.UU.). El lacZ-negativos mutantes fueron detectados por p-gal de selección, tal como se describe más arriba. Cada placa de agar selectivo se recuperó en 100 μ l de SM buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgSO 4, 100 mM de NaCl y 0,01% de gelatina). Con el fin de verificar la lacZ-fenotipo negativo, cada aislamiento fue ensayada en agar con X-gal in situ utilizando un ensayo de la siguiente manera. BIK2206 se cultiva en LB que contiene ampicilina (50 μ g / ml) y la tetraciclina (10 μ g / ml). - Dos veces concentrado cultura (1,25 ml) se mezcla con 6 ml fundido LB / MM agar (100 ml de medio LB, 0,75 g Bactoagar, 10 mM MgSO 4, el 0,2% de maltosa y 0,35 mg / ml de X-gal) y la proliferación de agar. A 10 - μ l bacteriófago alícuota de cada muestra fue avistada en estas células. Las placas se incubaron durante la noche a 37 ° C. La frecuencia de mutantes se calcula dividiendo el número de PFU en el selectivo de la placa (que se han verificado con X-gal) por el número total de PFU en 1 / 4 LB agar.

Análisis de los mutantes de ADN bacteriófago

El lacZ-negativos bacteriófago lambda ADN de los ratones se analizó utilizando enzimas de restricción tras la PCR. Por la negativa lacZ-lambda ADN de la AdNY57 tratados ratón, la PCR se llevó a cabo con el primer par de LG-1 (5'-TACCGGCGATGAGCGAAC-3 ') y LG-2 (5'-CTCCAGGTAGCGAAAGCC-3'). El 288-bp producto fue purificado por etanol / sodio precipitación, digeridos con TfiI (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.) (sitio de reconocimiento, 5'-G | AWTC-3 '(W = A ó T)) a los 65 años ° C y analizados mediante electroforesis en agarosa. La secuencia fue mutantes resistentes a la TfiI, mientras que la de tipo salvaje secuencia era delicada, con un rendimiento de 204 pb y 84 fragmentos. El primer par de Lam-1 (5'-TACTGTCGTCGTCCCCTC-3 ') y Lam-2 (5'-CGCAGATGAAACGCCGAGT-3') se utilizó para la lacZ-negativos lambda ADN de la AdNY58 tratados ratón. El 213-bp producto de PCR fue digerido con XspI (Takara Bio Inc, Shiga, Japón) (sitio de reconocimiento, 5'-C | TAG-3 ') a 37 ° C y analizados mediante electroforesis en agarosa. La secuencia de tipo salvaje fue resistente a XspI, mientras que la secuencia mutante era sensible, con un rendimiento de 146 pb y 67 fragmentos.

Resultados
Diseño experimental para la detección de la orientación de genes in vivo

La Figura 1 ilustra nuestro diseño experimental para la detección sensible de la orientación de genes in vivo. El MutaMouse lleva aproximadamente 40 copias del bacteriófago lambda gt10lacZ gt10lacZ en un cromosoma [6, 19]. El único sitio de la integración se encuentra en la banda C en el cromosoma 3 [20]. Nuestro objetivo es la secuencia natural de genes lacZ. El donante de ADN se entregó a los núcleos de células del hígado por la vena de la cola de la inyección de adenovirus recombinante. ADN genómico se aisló en el hígado y su embalaje in vitro permite la recuperación de la lambda en el genoma viable bacteriófago partículas. Un lacZ-bacteriófago mutante negativo fue seleccionada como una placa en un ex-Escherichia coli mutantes galE defectuoso en el gen en una placa de agar que contiene p-gal. Este producto químico es convertida por el gen lacZ producto (beta-galactosidasa) en la UDP-galactosa, que se acumula en la ausencia de la proteína GalE para inducir la muerte celular. La proporción de la placa mutante-a los formadores de formadores de la placa total se estimó la fracción de los genes mutados. El gen mutante se analizaron mediante enzimas de restricción.

Replicación-defectuoso adenovirus recombinante construido por un in vitro-ligadura método se utiliza para entregar el ADN de donantes [18, 21]. La Figura 3 muestra la estructura de los adenovirus recombinante utilizados en el presente estudio (véase la figura 2, la archivo adicional 1, y Materiales y métodos para más detalles). 8077-Un fragmento de bp lambda gt10lacZ gt10lacZ fue insertado en el sitio E1 supresión de los mutantes adenovirus [18, 21]. AdNY56 había lacZ de tipo silvestre, mientras que AdNY57 y AdNY58 tenía una mutación puntual en lacZ (Figura 3B].

AdNY57 se construyó el fin de introducir una mutación puntual en el sitio activo de LacZ. El objetivo fue la secuencia 5 'GAA que los códigos de Glu461, que es esencial para la actividad de LacZ [22, 23]. AdNY57 se espera que cambie su segunda base (es decir, la 1437 ª base) de la Aa la G, con lo que la generación de la Glu461Gly mutante, que muestra una disminución de 76 veces en la actividad [23]. El mutante y de tipo salvaje secuencias pueden distinguirse utilizando la enzima de restricción TfiI (Figura 3B].

AdNY58 se construyó el fin de introducir una mutación puntual en el 5 'TAT que los códigos de Tyr105. AdNY58 se esperaba que su tercer cambio de base (es decir, la base de 369a) de T de G, con lo que la generación de la Tyr105Stop mutante. El mutante y de tipo salvaje secuencias pueden distinguirse utilizando la enzima de restricción XspI (Figura 3B].

Control de los experimentos

Hemos demostrado que lacZ mutantes que se prevé que se generen por el adenovirus recombinante pueden ser seleccionadas con p-gal de la siguiente manera. Bacteriófago lambda cepas portadoras del mutaciones se produce mediante la transferencia de cada mutación en un plásmido de nuevo a lambda mediante recombinación homóloga en el E. Coli (como se detalla en Materiales y métodos). Las dos cepas bacteriófago, lambda gt10lacZ gt10lacZ - Tyr105Stop (LIA11) y lambda gt10lacZ gt10lacZ - Glu461Gly (LIA15), fueron utilizados en la selección de p-gal. Como se muestra en la Tabla 1, con lambda de tipo salvaje lacZ mostró una placa de la formación de la eficiencia de menos de 1 / 10000 en el agar selectivo relativo a que en el no selectivo de agar. Por el contrario, cada una de las cepas mutantes lambda mostró similar o ligeramente disminuido la formación de la placa de la eficiencia en el agar selectivo. Llegamos a la conclusión de que la espera un producto con AdNY57 y AdNY58, si se producen, deben ser seleccionados y mediante el p-gal-procedimiento de selección.

Entrega de los donantes de ADN y medición de la frecuencia de mutantes

Las partículas de adenovirus recombinante (3 × 10 9 PFU en 200 μ l de PBS) se inyecta en la vena de la cola de un MutaMouse. Está demostrado que el genoma de adenovirus se acumula en los núcleos de células del hígado después de la inyección de cola-vena [12, 13]. La mayoría de los núcleos de los hepatocitos se espera de recibir varias copias del genoma de adenovirus en estas condiciones (ver Discusión). Después de 24 horas, el hígado fue extirpada de la MutaMouse, el ADN genómico fue aislado del tejido hepático y el genoma de lambda se recuperó como un bacteriófago partícula in vitro por envase. El lacZ-negativos fagos se detectó selectivamente sobre agar con p-gal. El selectivo sobre estas placas placas fueron aislados y la LacZ-fenotipo negativo fue confirmado mediante placas de agar que contiene X-gal. La frecuencia de mutantes se calcula como la fracción de los fagos lacZ-negativos (Cuadro 2]. El control del ratón (animales número 0) no recibieron inyecciones.

El mutante frecuencias de la AdNY56-inyectado y control de los ratones fueron similares (Tabla 2, el Experimento 1), y que no difieren significativamente de los reportados previamente utilizando este método (ver [15] y las referencias que allí se cita). No hay incremento significativo en la forma mutante del gen fue inducida por la inyección de adenovirus recombinante: la frecuencia de los mutantes-AdNY57 y AdNY58-ratones inyectados fue similar a la del control del ratón, que es aproximadamente 1 / 10000 (Cuadro 2] .

Todos los lacZ-negativos bacteriófagos fueron purificados y sus genes lacZ fueron analizados utilizando la enzima de restricción tratamiento de los productos de la PCR (Figura 4]. Como se muestra en las figuras 3B y 4A, el producto de la PCR Glu461Gly mutante, como predijo AdNY57 de la inyección, no se puede cortar con TfiI. Por el contrario, los de tipo salvaje y la mayoría de los otros posibles mutantes se podría cortar con TfiI. En realidad, todas las lacZ-negativos bacteriófagos de la AdNY57-ratón se inyecta cleavable con esta enzima de la restricción. Como se muestra en la Figura 3B y 4B, el producto de la PCR Tyr105Stop mutante, como predijo AdNY58 de la inyección, se podría cortar con XspI. Por el contrario, los de tipo salvaje y la mayoría de los otros mutantes no se podía cortar con XspI. Ninguno de los bacteriófagos lacZ-negativos de la AdNY58-ratones fueron inyectados con cleavable esta enzima de la restricción.

No se espera detectar el gen de sustitución en cualquiera de los aislamientos. Además, la corrección de genes de la frecuencia de estos adenovirus construye demostró ser inferior a 1 / 20000 en el sistema actual.

Discusión

Aquí hemos intentado llevar a cabo la orientación de genes en un ratón transgénico que permitió que el sistema sensible de detección de mutagénesis por diversos agentes, como los que interactúan directamente con el ADN en el hígado y otros órganos [24, 25]. El límite de sensibilidad de este sistema es de 1 / 20000 (ver también [15]]. Este procedimiento podría ofrecer una alternativa a la prueba de PCR basada en la orientación de los genes in vivo, a pesar de nuestra inicial ensayos no detectar cualquiera de los previstos recombinantes.

En el sistema actual, la sensibilidad parece ser limitada por el alto nivel de mutagénesis espontánea en el gen objetivo. El MutaMouse sistema fue producido para la detección de mutagénesis en numerosos lugares dentro de un gen, en lugar de la orientación para el estudio de genes. Diseños experimentales de la selección específica de los eventos de recombinación homóloga, como los utilizados en el anterior trabajo in vitro [7], por lo tanto, ser preferido.

Asimismo, en el sistema actual, el éxito de la orientación de genes caso no se distingue en el fenotipo de las células de ratón. En ratones transgénicos con una sola copia del gen mutante lacZ [26], a la corrección de tipo salvaje de genes daría lugar a una lectura directa positiva en el cuerpo del ratón (por ejemplo, mediante la tinción con colorante). Sin embargo, como admiten los autores, sería difícil detectar la orientación eventos con una alta sensibilidad. La presencia de múltiples copias del gen objetivo sería mejorar la sensibilidad porque la lacZ + alelo es dominante respecto, y para epistatic, la lacZ - alelos con respecto a la anterior fenotipo. El MutaMouse múltiple (alrededor de 40) copias de los genes blanco, que equivalen a 0,4% del genoma. Este debe ser capaz de mejorar la sensibilidad de la detección de genes de la orientación, aunque la sensibilidad se ve limitada por mutagénesis espontánea. Además, la presencia de repeticiones en tándem puede tener otro tipo de efecto negativo sobre la orientación genética, como se detalla a continuación.

¿Cuán eficiente es la infección por adenovirus y la entrega a los hepatocitos núcleo? Cola-vena de inyección es un método para la entrega de adenovirus a las células del hígado. El promedio de número de copias de una reproducción defectuosa de adenovirus recombinante por genoma de células del hígado se ha estimado en 14-28 ejemplares utilizando hibridación del Sur después de la inyección de cola-vena, de 5 × 10 9 PFU del virus [12]. Esto corresponde a 40% de los inyectados adenovirus. Fluorescencia de hibridación in situ reveló que, después de la inyección de cola-vena, de 2 × 10 9 PFU, todos los núcleos de los hepatocitos había 1-100 copias de un adenovirus recombinante genoma, con un promedio de 20 ejemplares [27]. Después de la vena de la cola de inyección de 2 × 10 8 PFU de un adenovirus recombinante con el cassette lacZ expresión, el 40% de los hepatocitos expresó beta-galactosidasa [13]. Hemos asumido que la mayoría de las células del hígado recibido varias copias del genoma de adenovirus, por lo menos, suficiente para la expresión de genes, después de la inyección de 3 × 10 9 PFU en nuestro experimento. (No se puede plantear el título más debido a la toxicidad del virus.) Este tipo de información puede ser confirmada por el sur y la hibridación in situ por fluorescencia de hibridación.

El gen de la orientación frecuencia con adenovirus recombinante in vitro varía de ~ 10 -7 -10 -4 por casilla [7, 8, 28]. No hemos detectar cualquier señal utilizando adenovirus recombinante para la entrega de genes en el hígado del ratón. Con el fin de lograr la orientación de genes in vivo utilizando un vector adenovirus o por cualquier otro medio, será necesario aumentar la frecuencia de genes de la orientación. ¿Cómo podemos lograr este objetivo?

La eficacia de la orientación de genes in vitro varía de un lugar a otro [29, 30]. Esa legitimación de la dependencia podría reflejar efectos drásticos de la estructura de la cromatina en la frecuencia de recombinación homóloga [30, 31]. Así, el objetivo de transgenes podría ser colocado en otro lugar que es conocido por ser un foco de tensión en los genes embrionarios en la orientación (ES) células.

Secuencias repetitivas están metiladas en el genoma de ratón [32]. Ikehata y colegas sugiere que la codificación de toda la región de la MutaMouse lacZ transgenes es metilada a un alto grado en todos los CpG sitio [33]. Una posible razón de este fenómeno es que el contenido de la CpG gen lacZ (9%) [34] es mucho más alta que la media CpG contenido del genoma de ratón (~ 1%) [35]. Metil-CpG proteína de unión 2 (MeCP2) podría obligar a CpG metiladas pacto de la cromatina y de alguna manera [36]. Además, Manuelidis analizaron la estructura de un cromosoma ratón teniendo un gran (~ 11 Mb) insertar de un tándem repetidas transgén (~ 1000 copias) [37]. Este transgén fue localizado sobre un brazo del cromosoma 3, a una distancia de los centrómeros. Según Manuelidis, el transgén se heterochromatic y muy condensado. Por lo tanto, la MutaMouse transgén podría ser heterochromatic. La accesibilidad de nucleasas heterochromatic a la estructura es menor que la de euchromatin [38, 39]. Reducir el número de copias del transgén y / o utilizar otro transgén que es menor en CpG gen podría aumentar el contenido de orientación, a pesar de la disminución en el número de copias pueden afectar a la sensibilidad de detección. Un importante experimento que se puede hacer es probar si la codificación de la región MutaMouse lacZ transgenes es realmente heterochromatic, utilizando, por ejemplo, CHIP ensayo con el anticuerpo contra el histonas metiladas y PCR primers en la lacZ genes.

Replicación de los cromosomas que se conoce para estimular recombinación homóloga. Hepatectomies parcial en ratones podría estimular la proliferación de las células del hígado y de la replicación del ADN, que a su vez podría estimular la recombinación. Hara et al. (1999) informó de que el aumento de la mutagénesis hepatectomies parcial con N-etil-N-nitrosourea, que es una acción directa de ADN ethylation agente, en el MutaMouse [40].

Tal vez sea más fácil de modificar el ADN de donantes que el destinatario de ADN. Uno puede generar recombinogenic daños en el ADN de donantes. Radiación de las partículas de adenovirus con luz ultravioleta de 1500 J / m 2 aproximadamente dio lugar a un aumento de tres veces en su mutua recombinación homóloga [41]. Recombinogenic los nexos que son inducidos por algunos mutágenos, como psoralens, cisplatino (cis-diamminedichloroplatinum) y mitomicina C [42]. Esos agentes, mutagénicas y recombinogenic tanto, podría ser conveniente para la orientación de genes in vivo si se muestran activas en la mutagénesis en un ratón transgénico-reportero sistema. El efecto de esa recombinogenic daño podría ser mucho mayor-con replicación defectuosa adenovirus recombinantes que con la repetición de adenovirus competentes, ya que su reproducción intermedias-son responsables de su elevada frecuencia de recombinación [41, 43 - 45].

El gen de la orientación frecuencia depende en gran medida de la longitud de homología, la frecuencia aumenta a medida que aumenta la longitud de homología de hasta 10 kb [46 - 48]. Si la desviación de esta norma por encima de 10 kb se debe a la esquila y / o degradación de más largo después de la electroporación de ADN en las células madre embrionarias, las AND de donantes que están protegidos por el ADN en proteínas que unen las partículas de adenovirus podría mostrar una mayor longitud de la dependencia en una amplia Rango de valores. Vector adenoviral con una mayor capacidad de las inserciones, que se conocen como de alta capacidad "gutless" vectores [49 - 51], por lo tanto, podría ser adecuado para su uso en este enfoque.

Conclusión

Aquí hemos intentado llevar a cabo la orientación de genes en un ratón transgénico que permitió que el sistema sensible de detección de mutagénesis. La frecuencia de genes de la orientación en el hígado del ratón por estos adenovirus recombinante ha demostrado ser inferior a 1 / 20000 con la sensibilidad y la PCR-independiente de sistema de detección.

Lista de abreviaturas

PCR, reacción en cadena de polimerasa; PFU, la formación de la placa de la unidad; RFLP, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción; p-gal, fenil-beta-D-galactoside; X-gal, 5-bromo-4-cloro-3-indlyl-beta - D-galactosa

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

AI lleva a cabo la inyección de los adenovirus recombinante y el análisis del ADN del ratón. YN y HM construido el adenovirus recombinante. NH inyectado el adenovirus recombinante para el ratón. YN construido el diseño experimental, así como la clonación de la parte del ADN de lambda MutaMouse el ADN genómico. IK siempre la idea original experimental y coordinado el diseño experimental. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Material suplementario
Disposición adicional 1
Cepas bacterianas, plásmidos, bacteriófagos cepas de adenovirus recombinante y construcciones.
Agradecimientos

Sra Kuniko Iwasaki y el doctor Ryuichi Miura del Centro de Investigación Animal de Laboratorio del Instituto de Ciencias Médicas de la Habana, el Japón, nos ha guiado en nuestro manipulación de los ratones. Dr Noriko Takahashi de nuestro laboratorio contribuyó con el mantenimiento de los ratones. Dr Yoichiro Iwakura del Instituto de Ciencias Médicas de la Habana siempre observaciones críticas sobre una primera versión del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT), de Japón (No.0828102 general de los mecanismos de reparación de ADN Recombinación. 1996-1999) y la Asociación de Propietarios de Japón (JOA) (1999 -2002), Organizado por la Sociedad Japonesa para la Terapia Genética.