Lipids in Health and Disease, 2005; 4: 23-23 (más artículos en esta revista)

Peroxisomal actividad de las enzimas, y los niveles de poliaminas en LPA-ratones transgénicos en dos dietas diferentes

BioMed Central
Knut A Eliassen (knut.eliassen @ veths.no) [1], Bjørn P Brodal (bbrodal@odont.uio.no) [2], Aud Svindland (adsvindland@ioks.uio.no) [3], Harald Osmundsen ( Haraldo@odont.uio.no) [2], Helle Rønning (wkhr@weifa.no) [1], Srdjan Djurovic (serdjan.djurovic @ ioks.no) [4], Kåre Berg (k.berg @ genova.no ) [4]
[1] Departamento de Ciencias Básicas y Medicina Acuáticos, Escuela Noruega de Ciencias Veterinarias, PO Box 8146 Dep. No-0033 Oslo, Noruega
[2] Department of Oral Biology, University of Oslo, P.O. Box 1052 Blindern, No-0316 Oslo, Norway
[3-0514 Oslo, Noruega
[4] Institute of Medical Genetics, University of Oslo, P.O. Box 1036 Blindern, Oslo, Norway
[5-0407 Oslo, Noruega

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Resumen
Antecedentes

En el hombre, elevación de los niveles de plasma de lipoproteína (a) (Lp (a)) es un factor de riesgo cardiovascular, fosfolípidos oxidados y se cree que juegan un papel como moduladores de procesos inflamatorios como la aterosclerosis. Poliaminas son potentes antioxidantes y anti-inflamatorias. Por lo tanto, es de interés para examinar el metabolismo de poliaminas y sus LPA en ratones transgénicos.

Concentración de las poliaminas putrescina, espermidina y espermina, así como la actividad de peroxisomal poliamina oxidasa peroxisomal y de otras dos enzimas, acyl-CoA oxidasa y catalasa se midieron. Los ratones fueron alimentados con la dieta, ya sea una norma o una dieta rica en grasa y colesterol (HFHC). Algunos de los ratones en cada grupo de alimentación fueron dadas además aminoguanidine (AG), un inhibidor específico de diamine oxidasa, que cataliza la degradación de putrescina, y también inhibe la glicosilación no enzimática de la proteína que está implicada en la etiología de la aterosclerosis en pacientes diabéticos . No ratones transgénicos fueron utilizados como controles.

Resultados

Los poliamina oxidasa peroxisomal actividad fue significativamente mayor en LPA ratones transgénicos que en los ratones no transgénicos, mientras que la actividad de catalasa peroxisomal intestinal fue significativamente menor. Β-oxidación hepática en el aumento de Lp (a) ratones transgénicos alimentados HFHC la dieta, pero no en los de la dieta estándar.

Espermidina concentración hepática se incrementó en todos los ratones alimentados con la dieta HFHC en comparación con los alimentados con una dieta estándar, mientras que se redujo la concentración de espermina. Con excepción del grupo alimentado sólo estándar de la dieta, los ratones transgénicos mostraron un menor grado de esteatosis hepática que los no ratones transgénicos. AG no tiene efecto significativo sobre hepática.

Conclusión

Los resultados indican una relación entre la actividad de la enzima peroxisomal y la presencia de la LPA de genes humanos en el genoma murino. El efecto puede ser el resultado de cambios en los procesos oxidativos en el metabolismo lipídico y no como resultado de un efecto directo de la LPA peroximal construir sobre la expresión génica.

Antecedentes

Elevación de los niveles de plasma de lipoproteína (a) Lp (a) son un importante factor de riesgo cardiovascular en el hombre [1]. Hemos informado anteriormente el desarrollo de la arteriosclerosis en la aorta de ratones transgénicos para cDNA en representación de los genes humanos para la Lp (a), hLPA, en una dieta estándar [2, 3], mientras que los ratones transgénicos no sólo esporádicamente desarrollado arteriosclerosis. En la LPA cDNA de animales transgénicos, la apolipoproteína (a), (apo (a)), ocurre libre en el plasma, y hemos encontrado una correlación significativa entre el plasma apo (a) la concentración y el tamaño de la aorta las lesiones.

La presente investigación, en base a muestras de tejidos de los animales en el estudio antes mencionado, se llevó a cabo para descubrir si poliaminas podrían influir en el desarrollo de aterosclerosis. No se encontraron restos de sangre y la pared de la aorta para poliamina mediciones. El hígado y el riñón, por lo tanto, fueron escogidos.

La justificación para el examen de la poliaminas, espermidina y espermina, es que sus cargas positivas gran interacción con fosfolípidos y de inhibir la peroxidación lipídica [4], y, en cierta medida la protección de liposomas de oxidación [5]. Además, exhibe una espermina efecto antiinflamatorio [5], y ejerce una acción antagónica sobre la agregación plaquetaria [6]. Desde la proliferación de las células vasculares en las paredes es importante en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas, el conocimiento de los niveles y el metabolismo de poliaminas son de por sí de interés debido a sus conocidas importancia para el crecimiento y la diferenciación celular. Además es de interés para medir la actividad de la peroxisomal poliamina oxidasa, una enzima importante en la conversión de poliaminas [7]. Examen de la actividad de las enzimas peroxisomal es de su interés también por la proliferación peroxisomal receptores activados (PPARs) se sabe que están implicados en el desarrollo de la arteriosclerosis (para revisión, ver [8]. Anteriormente hemos demostrado que la alimentación de ratas una dieta enriquecida en Poliaminas produjo un descenso en el hepática poliamina oxidasa y catalasa actividad, que podrían ser restaurados simultáneamente por la suplementación de la dieta con clofibrate, un proliferador peroxisomal y un drogas hipolipemiantes [9].

El hecho de que las drogas hipolipemiantes, clofibrate, ha cambiado la actividad de poliamina oxidasa indica que el contenido en materia grasa de los tejidos puede influir en el metabolismo de poliamina. Por lo tanto, es de interés especial para examinar si la grasa de carga había ningún efecto sobre el hígado poliamina contenido, y en la actividad poliamina oxidasa.

En el presente estudio se encontró que poliamina oxidasa actividad fue mayor en los ratones transgénicos que en los animales no transgénicos. Para examinar si esto refleja un aumento general de las enzimas peroxisomal, que mide la actividad de otras dos enzimas peroxisomal, catalasa y β-oxidasa. Catalasa descompone el H 2 O 2, un producto de la actividad oxidasa, y, por tanto, protege a la célula contra el efecto tóxico de H 2 O 2, mientras que peroxisomal β-oxidación desempeña el importante papel fisiológico muy largo de la oxidación de ácidos grasos y la cadena lateral del colesterol .

Algunos grupos de ratones fueron tratados con AG AG porque inhibe la formación de glicosilación no enzimática de las proteínas [10], que están implicados en la etiología de las complicaciones de la diabetes, incluyendo la arteriosclerosis [10, 11], y porque AG es un conocido Inhibidor específico de diamine oxidasa, que cataliza la degradación de putrescina, el precursor de las poliaminas; espermidina y espermina.

Tenemos aquí el informe que la introducción de genes humanos en LPA ratón FVB dio lugar a ningún cambio significativo en la poliamina concentración en el hígado y los riñones, pero se cambió la actividad de tres enzimas peroxisomale saber: polyaminoxidase intestinal y hepática catalasa y oxidasa acyl-CoA ( Responsable de la β-oxidación). Parece que hay menos hepática en los ratones transgénicos en comparación con el control de ratones FVB.

En los ratones alimentados con una dieta HFHC en comparación con los alimentados con una dieta estándar baja en grasa, el hígado espermidina y espermina concentraciones eran diferentes, lo que resulta en una disminución de la relación entre las concentraciones de espermidina y espermina en el HFHC ratones alimentados.

Resultados

Los resultados no indican una diferencia de sexo con respecto a cualquiera de los parámetros medidos.

De peso corporal

Órgano de peso disminuyó un 2-5% durante el período experimental. Los animales tratados con aminoguanidine mostró la mayor pérdida de peso. La reducción en el peso corporal puede estar relacionada con la relativamente elevada edad de los ratones. Ratones en la dieta alta en grasa, intermitente mostró un aumento en el peso corporal de 2-9%, con un pico alrededor de 3 semanas después de comenzar. Sin embargo, la media de peso corporal al final del período de tratamiento, no fue significativamente diferente de los de los grupos alimentados con una dieta estándar (datos no presentados).

Poliamina oxidasa actividad

El pequeño polyaminoxidase actividad intestinal fue significativamente (p <0,05) mayor en los grupos de ratones transgénicos que en los no transgénicos. El poliamina oxidasa actividad en el intestino delgado fue aproximadamente dos veces mayor que en el hígado. Los datos que muestra los efectos de los tratamientos sobre la actividad intestinal poliamina oxidasa se presentan en la figura 1. Poliamina oxidasa hepático actividad fue de 0,41 ± 0,06 nmol / min mg y no se vio afectada por el contenido de materia grasa de la dieta, tratamiento AG, o transgenity.

Actividad de catalasa

La Figura 2 muestra la actividad de catalasa en homogeneizado medido desde el intestino delgado. En todos los grupos de tratamiento de la actividad de catalasa en los animales transgénicos fue significativa más baja que en los ratones no transgénicos. En ratones transgénicos, aminoguanidine dado en el agua potable, la actividad de catalasa fue significativamente mayor en los de la dieta HFHC que en los de la dieta estándar (Fig. 2]. AG tratamiento de los ratones transgénicos en la dieta estándar de reducción de la actividad de catalasa intestinal significativamente.

Hubo sólo pequeños e insignificantes diferencias en la actividad de catalasa hepática entre transgénicos y no transgénicos y ratones entre las dos dietas. La actividad fue aproximadamente el mismo que en el intestino delgado de los ratones transgénicos no.

AG en el agua potable a los ratones en la dieta HFHC dado lugar a un aumento de la actividad de catalasa hepática de alrededor de 1,5 a 3,0 μ mol H 2 O 2 / mg de proteína s.

Peroxisomal β-oxidación (hepática acyl-CoA oxidasa actividad)

Peroxisomal β-oxidación en el hígado de ratones alimentados con transgénico HFHC la dieta aminoguanidine y en el agua potable fue significativamente (p <0,05) mayor que en los ratones transgénicos no en el mismo tratamiento (Fig. 3]. En correspondiente experimento con ratones en la misma dieta, pero sin aminoguanidine (Fig. 3], la diferencia observada no alcanzó significación estadística.

Diamine oxidase actividad intestinal

El diamine oxidase actividad en la parte proximal del intestino delgado se poderosamente inhibido en los animales dado AG, con independencia de su condición genética. La media ± DE diamine oxidase valores de la actividad, expresado en cantidad putrescina pr volumen de negocios. Min y 220 g de tejido se ± 160 y 17200 ± 6200 pmol por el aminoguanidine tratados y los no tratados los animales, respectivamente. Esto está de acuerdo con el establecido en el efecto inhibitorio de aminoguanidine sobre diamine oxidase actividad [12].

Tejido poliaminas

La concentración hepática de putrescina cansado de todo el nivel de detección del ensayo. La evaluación de estos datos, por tanto, no puede ser llevado a cabo.

Con excepción de los ratones estándar de la dieta y el tratamiento aminoguanidine, transgénicos y no ratones transgénicos no presentan ninguna diferencia significativa en hepática espermidina y espermina concentraciones (Figs. 4 y 5]

La concentración hepática de espermidina en ratones alimentados con la dieta aterogénica, HFHC; fue significativamente (p <0,05) menor que la de los ratones estándar determinada dieta (Fig. 4]. Por otra parte, un pequeño pero significativo incremento (p <0,05) en espermina concentración se observó en los ratones alimentados con la dieta sin HFHC AG en el agua potable, en comparación con los alimentados con la dieta estándar (Fig. 5]. La espermidina y espermina ratio fue de 0,76 para los ratones en la dieta HFHC, y de 1,32 para los de la dieta estándar.

En el riñón no hubo diferencias entre transgénicos y no transgénicos ratones. En consecuencia, a los ratones transgénicos no la putrescina, espermidina y espermina concentraciones fueron (73 ± 36) nmol / g, (363 ± 83) nmol / g y (606 ± 101) nmol / g, respectivamente, y los correspondientes valores para el Animales transgénicos fueron 66 ± 22, 398 ± 170 y 642 ± 154 nmol / g. Además, no hay diferencia entre los dos ratones en la dieta, o entre AG ratones tratados y no tratados.

Esteatosis hepática

En el grasos infiltraciones, no hay indicios de células inflamatorias. Esteatosis hepática fue clasificada de 1 a 3. Típicas secciones de hígado con esteatosis de grado 1, 2 y 3, junto con las secciones de un hígado normal se muestra en la Fig. 6. Esteatosis producido en el hígado de todos, pero cuatro ratones. El grado de esteatosis fue menor en los ratones transgénicos que en los no ratones transgénicos, pero la diferencia fue estadísticamente significativa (p <0,05) sólo para aquellos en una dieta estándar con AG en el agua potable y los alimentados sólo por un alto consumo de grasa Dieta (Fig. 7].

Discusión
Actividades enzimáticas

Introducción de cDNA en representación de la LPA gen junto con el promotor de transferrina, en el genoma del ratón, ocasionaron cambios en la actividad de las enzimas peroxisomale poliamina oxidasa y catalasa en el intestino delgado, pero no en el hígado (Figs. 2, 3, 4]. Esto contrasta con el hecho de que la LPA gen se expresa en hígado, pero no en el intestino [13], lo que indica que el efecto sobre las enzimas intestinales deben ser secundarias. Desde los genes que codifican para poliamina oxidasa (Locus ID no Mm 212.503) y para acyl-CoA oxidasa (Locus ID no. Mm 11.430) se encuentran en diferentes cromosomas del ratón, 7 y 11, respectivamente, es poco probable que los cambios observados en estas Actividades enzimáticas fueron causados por la introducción de la LPA con un gen promotor de transferrina, en o cerca de la región reguladora del gen de estas enzimas.

El aumento de la actividad intestinal poliamina oxidasa LPA en ratones transgénicos, frente a los no ratones transgénicos (Fig. 1], indica un metabolismo alterado peroxisomal poliamina. Cuando la actividad de la H 2 O 2 produciendo poliamina oxidasa es el aumento de la enzima en ratones transgénicos la, un aumento en la actividad de catalasa se debe anticipar. Sin embargo, esto ya no es el caso. (Fig. 2] El aumento de la actividad poliamina oxidasa por lo que no puede ser explicado por un aumento general de la actividad de las enzimas peroxisomal. El aumento de H 2 O 2 de producción de la mayor actividad poliamina oxidasa es probablemente marginal, en comparación con el H 2 O 2 de producción de otras fuentes. Los cambios observados en hepática peroxisomal β-oxidación (Fig. 3] no puede explicar la disminución en la actividad de catalasa porque peroxisomal β-oxidación no cambió en el control de ratones e incluso aumentado en la AFL-HFHC ratones transgénicos en la dieta. El aumento de la oxidación peroxisomal β-LPA en ratones transgénicos en la dieta HFHC está de acuerdo con los informes que muestran que las dietas altas en grasa, especialmente los que contengan grasa hidrogenada, causan un aumento de peroxisomal β-oxidación [14, 15]. En ratones transgénicos no la misma dieta no causó aumento significativo de peroxisomal β-oxidación. De ello se desprende que los ratones transgénicos con respecto a la LPA pueden ser más propensos que los no ratones transgénicos para aumentar de peroxisomal β-oxidación, probablemente debido al bajo contenido de grasa (Fig. 2].

El aumento observado en poliamina oxidasa y β-oxidasa actividad junto con una disminución de la actividad de catalasa también indican que otros son los cambios en los procesos oxidativos, como resultado de la introducción de genes de la LPA. Esto parece interesante, en opinión de la posible función de los fosfolípidos oxidados como moduladores de los procesos inflamatorios. Así, modificado fosfolípidos acumulan en los sitios de la inflamación, tales como lesiones ateroscleróticas [16]. Además, fosfolípidos oxidados se muestran para inducir la expresión de genes relacionados con la aterosclerosis [17]. Adicional se han presentado pruebas por el uso de murino naturales anticuerpo monoclonal IgM, EO6, que se une a la oxidación específicos de epítopos oxidados de lipoproteínas de baja densidad. Una alta correlación entre el plasma Lp (a) y EO6 se encuentran [18].

La conclusión hasta el momento debe ser que los cambios en las tres actividades de la enzima peroxisomal LPA-en ratones transgénicos es más probable que sea causada por el metabolismo lipídico alterado en estos animales, y no por un efecto directo de la LPA construcción en la expresión de los genes peroxisomal .

Poliaminas

En los riñones, ni el gen ni la LPA HFHC dieta y tratamiento AG parece influir en los niveles de poliamina significativa (datos no presentados).

El hepática espermidina y espermina concentración fueron casi no afectado por aminoguanidine tratamiento (Fig. 4 y 5]. Lo mismo ocurre para los riñones. Aunque la poliamina concentración en la dieta estándar era muy superior al de la HFHC dieta, la dieta HFHC provocado el incremento de la concentración hepática espermidina. Parece poco probable que las diferencias en la microflora intestinal, la flora causado las diferencias observadas en hepática poliamina contenido entre los dos grupos de alimentación.

Clofibrate tratamiento, que reduce los niveles de lípidos en plasma ya ha sido encontrado para aumentar el contenido hepático de espermidina y espermina reducir la de [9], lo que es contrario al efecto de la dieta HFHC.

El grupo había alimentado HFHC niveles más altos de grasa hepática, ya juzgar por la cantidad de vacuolas llenas de grasa (esteatosis) que los de la dieta estándar. Sin embargo, no encontró correlación significativa entre la esteatosis hepática hepática y los niveles de espermidina o espermina. A pesar de esto, sugerimos que el nivel de lípidos hepáticos pueden ser de importancia para la poliamina nivel hepático. El hecho de que espermina se une a los lípidos cargados negativamente, por ejemplo, fosfolípidos [19] puede explicar en parte el aumento de la concentración de espermina en el hígado.

Espermidina en el plasma puede obligar a HDL [20], que se sabe inhiben la formación de oxida las lipoproteínas de baja densidad (LDL) [21]. Poliaminas, especialmente espermina, también son potentes antioxidantes y anti-inflamatorias [5]. El poliamina concentraciones han sido reportados para inhibir la agregación plaquetaria en los conejos hipercolesterolémicos [6]. Estudios de la función de las poliaminas en la aterogénesis / thrombogenesis son, por lo tanto, se pide.

La espermidina y espermina relación es que se sabe que son altos en los tejidos de rápido crecimiento. Así, en el hígado de la rata en el momento del nacimiento el ratio es de 4,5, mientras que esta proporción a los 9 meses es 0,8 [22]. Uno sólo puede especular si la tasa de movimiento de las células del hígado en células de ratones alimentados con la dieta HFHC, que tienen un hepática espermidina y espermina ratio de 0,76, se reduce en comparación con la de los ratones en un estándar de la dieta correspondiente cuando la relación era de 1,32.

Esteatosis

Para dos de los grupos de alimentación es significativamente menor grado de esteatosis hepática en los ratones transgénicos que en los animales no transgénicos (Fig. 7], sugiriendo diferencias en el metabolismo lipídico. Hemos anterioridad informaron de una tasa significativamente mayor de lesiones en la aorta LPA ratones transgénicos que en los no transgénicos animales y una correlación positiva entre la apo (a) el nivel y tamaño de la aorta las lesiones [2, 3]. Esto, junto con el hecho de que las células inflamatorias sólo se podía observar en la aorta infiltraciones de grasa, no en el de hígado, indican que existen diferentes mecanismos involucrados en el depósito de lípidos en la aorta las lesiones en el hígado y las células.

La AG ratones tratados en la dieta ha HFHC menos que la esteatosis los animales no tratados, pero las diferencias distan mucho de ser significativa. Esto indica que glicosilación no participa en la formación de esteatosis hepática en ratones.

Conclusión

El aumento de la actividad en poliamina oxidasa hLPA ratones transgénicos, y un aumento de la β-oxidación en ratones transgénicos alimentados con una dieta HFHC, junto con una disminución de la actividad de catalasa puede indicar que también otros procesos oxidativos se cambian como resultado de la introducción de la LPA gen. Esos cambios podrían ser de gran interés porque son productos de oxidación que se sabe que son importantes en el desarrollo de la arteriosclerosis.

Cambios en el patrón de poliamina al aumento de la ingesta de grasas son también dignas de mención. Sin embargo, en este estudio no hemos podido demostrar ninguna relación entre poliaminas / poliamina-metabolismo y la lesión arterioesclerótica visto en la misma ratones [2, 3]. Nuevos estudios están garantizados.

Materiales y métodos
Reactivos

Peroxidasa de rábano (CE 1. 11. 1. 7) (Tipo VI. RZ entre 250 y 330 U / mg), N1-acetil-espermina, 4-aminoantipyrine, palmitoiltransferasa-CoA, NAD +, FAD, HEPES, hexanediamine, putrescina 2HCl, espermidina 3HCl, espermina 4HCl, manitol y fueron adquiridos de Sigma Chemical Co (St. Louis, MO., EE.UU.). Perhydrol (H 2 O 2) se obtuvo de E. Merck (Darmstadt, Alemania). Todos los demás reactivos fueron de grado analítico. [1,4 - 14 C]-Putrescine dihidrocloruro (spes.act. 2,11 GBq / mmol) se obtuvo de Amersham Pharmacia Biotech, Ltd (Rainham, Essex, Reino Unido).

Y la alimentación de los animales

Este balance de los ratones también se han utilizado en una investigación paralela de los efectos de la LPA gen en el desarrollo de lesiones de aorta [2, 3]. Cuarenta y un ratones transgénicos con cDNA en representación de la LPA de genes humanos vinculados a la transferrina ratón promotor se estudiaron. Los ratones fueron un híbrido de fondo genético de la cepa C57BL / 6 cruzaron con cepa SJL [2, 3]. El original eran los ratones transgénicos obtentor un generoso regalo del doctor Richard M. Lawn, Falk Cardiovascular Research Center, la Universidad de Stanford, CA., EE.UU.. Veintinueve no transgénicos littermates de cría entre transgénicos y no transgénicos ratones fueron utilizados como controles. Análisis de ADN de los glóbulos blancos se realizaron para determinar la LPA transgénicos situación de los ratones. Los ratones son de ambos sexos y entre 49 y 67 semanas de edad cuando comenzó el estudio (ver Tabla 1].

La mitad de los animales fueron alimentados con una dieta estándar de ratón (RMI (S) SQS, dietas de Servicios Especiales, Witham, Essex, Inglaterra), que contiene 2,6% de grasa (de petróleo crudo), en donde la grasa saturada, el 20%. La otra mitad de los animales, se alimentaron una aterogénico semi-purificado dieta alta en grasa y colesterol (HFHC dieta), que contiene el 1,25% de colesterol, el 18,4% regular y el 0,5% de mantequilla de sodio cholate (ICN Pharmaceuticals, Inc 1731 Asse-Relegem, Bélgica). Varios de los animales en la dieta de cada uno se les dio un 0,1% (w / v) aminoguanidine en el agua potable (Tabla 1]. Todos los tratamientos duró 100 días.

Los importes de las poliaminas en la dieta estándar fueron: 110 nmol / g putrescina, 240 nmol / g espermidina y 45 nmol / g espermina. Las cifras correspondientes para putrescina y HFHC espermidina en la dieta fueron 1,0 y 3,5 nmol / g, respectivamente. Espermina no podía ser detectado.

Mujeres y hombres fueron alojados por separado, con 1-5 ratones por jaula. Tenían un 12 hrs. Luz / oscuridad ciclo, una temperatura constante de 21 ° C y una humedad relativa del 65%. Sentinel ratones fueron utilizados para ejecutar un estilo de FELASA sistema de control de salud. Los ratones fueron clínicamente sanos durante todo el período experimental. Los ratones fueron planteadas en la Unidad de Laboratorio Animal en la Escuela Noruega de Ciencia Veterinaria (acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio y Uso Internacional, Bruselas, Bélgica), y ellos se mantuvieron de acuerdo con la normativa de la Tecnología Genética Noruega Ley de 1994. El estudio fue aprobado por el Consejo Noruego de Investigación Animal Autoridad.

Toma de muestras de sangre y preparación de muestras de tejidos para la enzima de las mediciones

Los ratones fueron anaesthetized por una inyección subcutánea de 0,05 ml/10 g de peso corporal de una mezcla de 1:1 de Fenatyl / Midazolum (Hypnorm "Janssen" 10x diluido con agua y Dormicum "Roche" 5 mg / ml) antes de Toma de muestras de sangre, que fue realizada por una incisión en la vena safena. Los ratones fueron posteriormente asesinados por dislocación del cuello, y tejidos para el análisis fueron eliminados lo antes posible. Tras la eliminación, el hígado fue pesado, y trasladado en helado manitol-mediano (300 mmol / L manitol, 25 mmol / L de HEPES, 1 mmol / L EGTA, pH 7.2). Un 10% (w / v) homogenado fue preparado por 2 golpes en un Potter-Elvehjem homogeneizadora equipado con un pistón de Teflón ®. El homogenado se centrifuga de 1 min a 1075 × g av. Los sobrenadantes resultantes fueron trasladados en varios pequeños viales, y se almacena a -20 ° C hasta el análisis.

A 20 cm de largo segmento proximal del intestino delgado, a partir de unos 0,5 cm de la pyloric esfínter, fue preparado. Se cortan longitudinalmente abierto, enjuagarse con helado 0,9% (w / v) NaCl, borró contra papel de filtro, y homogeneizada durante 15 s en helado manitol mediano con un Ultra-Turrax ® a 25000 rpm. El homogenado resultante se centrifuga a 1075 × g av durante 15 min y el sobrenadante se almacenó a -20 ° C hasta que se analizó. Antes de los ensayos, una parte de la homogenado se mezcla con una parte de manitol helado mediano y, a continuación, Triton X-100 se añade a una resultante de la concentración de 0,05% (v / v).

Enzimas de ensayos

Catalasa (EC 1.11.1.6) la actividad fue ensayada por el control de la descomposición de H 2 O 2 a 240 nm y 25 ° C esencialmente descrita por Bergmeyer et al [23]. Catalasa es lábil en la solución diluida. Por lo tanto, homogeneizado se diluye 10 veces, con 20 mmol / L de buffer fosfato de potasio, pH 7,4 inmediatamente antes de su análisis.

Peroxisomal β-oxidación fue ensayada como palmitoiltransferasa-CoA-dependiente de la reducción de NAD +, de acuerdo a Hovik y Osmundsen [24]. Poliamina oxidasa (poliamina: oxígeno oxidoreductase, EC 1.5.3.3) fue ensayada espectrofotométricamente según lo descrito por Hayashi et al. [25]. Diamine oxidasa, EC 1.4.3.6 se determinó radiometrically, tal y como se describe por Okuyama y Kobayashi [26].

Actividad de catalasa, peroxisomal β-oxidación y poliamina oxidasa actividad se midieron en 6 ratones seleccionados al azar de cada una de las 7 grupos de animales, mientras que los 5 ratones transgénicos en el grupo de dieta y HFHC AG fueron examinados. Como se observa en la Fig. 3, el número de ratones en algunos otros grupos también fueron menos de 6, debido a la pérdida accidental de algunas muestras.

Polyamine ensayos

Muestras de tejido fueron pesadas y posteriormente homogeneizado en 4 volúmenes de ácido tricloroacético al 5%. Hexano diamine se añadió como patrón interno. El homogeneizado se mantuvieron en hielo durante 1 hora, seguido de centrifugación a 2 ° C por 10 min a 5000 g av. El sobrenadante fue almacenado a -20 ° C hasta el análisis. Las poliaminas se dansylated [27, 28] y separados por HPLC [29] sobre una radial PAK-Una columna (Waters, Milford, Ma., EE.UU.).

Determinación de las proteínas

Proteína ensayo se llevó a cabo utilizando el método de biuret [30] con Boehringer Precimat (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) como proteína estándar.

Esteatosis

El tejido hepático para estudios morfométricos fueron retirados e inmediatamente colocado en una solución tamponada de formaldehído. El examen se hizo habitual en las secciones de hígado, en los bloques de parafina, manchadas de rojo O Petróleo y counterstained con hematoxilina. Esteatosis hepática fue identificado por microscopía de luz vacía como vacuolas en el citoplasma de las células del hígado (Fig. 7]. Para la identificación definitiva de los lípidos, congelados secciones separadas de las muestras fueron teñidas con Oil Red O. El mismo patólogo examinado las secciones ciegamente, y todas las mediciones se realizaron en cuatro ocasiones. La evaluación de la grasa visible en las células del hígado se evaluó utilizando una escala semi cuantitativa de 0 a 3. Cero indica que no vacuolar células hepáticas pueden ser detectados. En el más mínimo grado de esteatosis (grado 1) diminutas vacuolas se encuentran en pequeñas partes del lóbulo, mientras que en los casos graves (grado 3) casi todas las células del hígado se ve afectado y la mayoría de las células tienen grandes vacuolas. "Moderado" (grado 2) indican que entre los cambios grasos de esteatosis leve y grave (Fig. 7].

Análisis estadístico

Para calcular la importancia de las diferencias entre los no transgénicos y ratones transgénicos en el mismo tratamiento que utilizó un unpaired, dos de cola t-test, que emplea el programa GraphPad Prism v.2.0 (GraphPad Software Inc, de San Diego, EE.UU.).

Los valores que se indican en el texto y leyendas cifras corresponden a los medios, con SD como se indica.

Lista de abreviaturas

EDAD, glycosoationtion avanzados productos finales, AG, aminoguanidine; HFHC, la dieta alta en grasas y el colesterol; LPA, el gen que codifica apo (a).

Contribuciones de los autores

SD fue responsable de los ensayos de transgenicity de los animales utilizados en este estudio. BPB y HO eran responsables de las mediciones de la β-oxidación, poliamina oxidasa y catalasa actividad. AS hizo el examen patológico. HR mide la poliaminas. KB y KAE concebido y realizado el estudio de su diseño y la coordinación. KAE redactado el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado la versión final del manuscrito.

Agradecimientos

Estamos con gratitud las gracias doctor Richard M. Lawn por el generoso regalo de la LPA ratones transgénicos. La habilidad de asistencia técnica de Patricia A. Engen, Bente B. Gehrken, Tove Norén, Inger E. Nossen y Toril Woldene es muy apreciada.