Journal of Carcinogenesis, 2005; 4: 19-19 (más artículos en esta revista)

La función de c-kit y el mesilato de imatinib en el melanoma uveal

BioMed Central
Patricia Pereira Rusa (patriciarusa@yahoo.com.br) [1], Alexandre Nakao Odashiro (alexandrenakao@yahoo.com.br) [1], Jean Claude Marshall (jeansutton37@hotmail.com) [2], Zelia María Correa ( Zmcorrea@terra.com.br) [2], Rubens Belfort (alexandrenakao@hotmail.com) [1], Miguel N Burnier (miguel.burnier @ mcgill.ca) [2]
[1] Departamento de Oftalmología, Universidad Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil
[2] C. Henry Witelson Laboratorio de Patología Ocular del Departamento de Oftalmología, Universidad de McGill, Montreal - Canadá

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Resumen
Antecedentes

Melanoma uveal (UM) es el más común tumor intraocular primario en adultos, dando lugar a metástasis en el 40% de los casos y en última instancia a la muerte en 10 años, a pesar de locales y / o tratamiento sistémico. La proteína c-Kit (CD117) es una membrana tirosina quinasa del receptor y su sobreexpresión se ha observado en varias neoplasias. Mesilato de imatinib es un compuesto FDA aprobó quinase que inhibe los receptores de tirosina, así como c-kit. Imatinib mesilato controles en el crecimiento del tumor hasta el 85% de los tumores del estroma gastrointestinal avanzado, una neoplasia resistentes a la terapia convencional.

Métodos

Cincuenta y cinco especímenes de primaria UM seleccionados de los archivos del Laboratorio de Patología Ocular, la Universidad de McGill, Montreal, Canadá, se immunostained de c-kit. Todas las células que muestran distintos inmunoreactividad se consideraron positivos. Cuatro líneas de células humanas UM y 1 uveal humano transformado los melanocitos línea celular se probaron en ensayos in vitro de la proliferación (TOX-6) y la invasión de ensayo con mesilato de imatinib (concentración de 10 μ M).

Resultados

La expresión de c-kit fue positiva en 78,2% de la UM. Hubo una significativa disminución en la proliferación y la invasión de los 5 tipos de líneas celulares.

Conclusión

La mayoría de UM expresó c-kit, y imatinib mesilato hace disminuir la proliferación y la invasión de los tipos de líneas de células humanas UM. Estos resultados justifican la necesidad de un ensayo clínico para investigar in vivo la respuesta de UM a imatinib mesilato.

Antecedentes

Melanoma uveal (UM) es el más común dentro de la primaria de tumor ocular en adultos [1], con una incidencia de cinco a seis personas por millón de personas [2]. Cuarenta por ciento de los pacientes progresará UM desde el local hasta el desarrollo de metástasis enfermedad sistémica que, en última instancia conducir a la muerte después de 10 años de diagnóstico, a pesar de las opciones de tratamiento como la radioterapia local, enucleación y quimioterapia sistémica [3].

C-Kit (Kit, CD117, receptor del factor de células madre) es un 145 kDa tirosina quinasa transmembrana de la proteína que actúa como un receptor de tipo III. El c-kit proto-oncogen, localizado en el cromosoma 4q11-21, codifica la c-kit, que está ligando el factor de células madre (SCF, de acero factor, kit ligando, el factor de crecimiento de mastocitos) [4, 5]. Fosforilación de la proteína tirosina tirosina kinasas es de particular importancia en la señalización celular y pueden mediar señales para importantes procesos celulares, como la proliferación, diferenciación, apoptosis, adhesión, y la migración. El papel de la expresión de c-kit ha sido estudiado en tumores sólidos y hematológicos, como leucemias agudas [6], y los tumores del estroma gastrointestinal (GIST) [7].

La importancia clínica de la expresión de c-kit en los tumores malignos se basa en la existencia de un compuesto (imatinib mesilato, STI571, Gleevec ®, Novartis Pharma AG, Basilea, Suiza), que inhibe específicamente los receptores tirosina quinasa [8]. Además, un clínicamente relevante avance ha sido notable el hallazgo de anti-tumor efectos de este compuesto en los GIST, un grupo de tumores considerados como ser, en general, resistentes a la quimioterapia convencional [9]. Mesilato de imatinib ha sido aprobado por los Estados Unidos-la FDA para el tratamiento de c-kit positivo GIST y de cromosoma Filadelfia positivo leucemia mieloide crónica [10]. El propósito de este artículo es estudiar la inmunoexpresiones de c-kit en la UM, así como los efectos de la in vitro imatinib mesilato de UM líneas celulares.

Materiales y métodos
Los bloques de parafina

Fijado en formol e incrustados bloques de parafina de enucleación de primaria de melanoma coroideo se obtuvieron de los archivos de la Henry C. Witelson Laboratorio de Patología Ocular, McGill University, Montreal, Canadá, desde los años 1980-2004. Todos los casos de tumor tiene suficiente material para el análisis. Los tumores con irradiación fueron excluidos.

Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó a través de policlonal anti-CD117 anticuerpos A4502 (Dako, Mississauga, Ontario, Canadá). El anticuerpo se aplicó en una dilución de 1:300 durante 18 horas a 4 ° C, después de 15 minutos en 10 nmol / l de citrato buffer (pH 6,0) para la recuperación de antígeno. Peroxidasa endógena fue bloqueada usando un 0,3% de hidrógeno peroxidasa diluido en metanol durante 30 minutos. Una norma complejo avidina-biotina (ABC) utilizando la técnica de diaminobenzidine se utiliza para la visualización, con una mancha roja coloración para evitar una interpretación errónea en los tumores pigmentados. Un caso de KIT-positivo Tumor Estromal Gastrointestinal (GIST) se utilizó como control. Control negativo secciones fueron incubadas con el suero normal de conejo en vez de la primaria de anticuerpos.

Después de procesamiento de tejidos, todas las celdas que muestra distintas inmunoreactividad se consideraron positivos, independientemente de la intensidad de la tinción. Hemos asignado los resultados de la tinción de c-kit como tinción negativa cuando no estaba presente, cuando baja a menos de 50%, y alta cuando más del 50% de las células del melanoma fueron positivos. La inmunoreactividad se clasificó como la membrana citoplasmática o expresión utilizando el sistema de calidad se ha descrito anteriormente. Con el fin de caracterizar mejor la expresión de c-kit en uveal melanomas, la expresión en los distintos tipos de células (fusiformes y epitelioide - ha modificado la clasificación de Callender) se analizó, en la célula mixta, predominante epitelioide predominante husillo y tumores.

Cell Cultura

Cuatro líneas de células humanas UM (92,1, SP6.5, MKT-BR, OCM-1) y uno de los melanocitos humanos uveal transformado línea celular (UW-1) fueron incubadas a 37 ° C en una humidificado 5% de CO 2-atmósfera enriquecida. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Burlington, Ontario, Canadá), complementado con un 5% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 1% fungizone, y un 1% de penicilina-estreptomicina comprado de Invitrogen (Burlington, Ontario, Canadá). Las células fueron cultivadas en monocapa en 25 cm 2 frascos (Fisher, Whitby, Ontario, Canadá), y observó dos veces por semana, en todos los medios de comunicación cambio, para un crecimiento normal por microscopía de contraste de fases. El cultivo se a la confluencia y el paso por el tratamiento con 0,05% de tripsina en EDTA (Fisher) a 37 ° C y lavada con 7 ml RPMI-1640 los medios de comunicación antes de que se centrifuga a 120 g durante 10 minutos para formar una bolita. Las células fueron suspendidas en 1 ml de medio y contó utilizando el colorante azul de Trypán exclusión de prueba.

La UM 92,1 líneas celulares, SP6.5, y MKT-BR fueron establecidos por el Dr Jager (Hospital Universitario de Leiden, Países Bajos), el doctor Pelletier (Universidad de Laval, Quebec, Canadá), el doctor Belkhou (CJF INSERM, Francia) , Respectivamente. Dr Albert (Universidad de Wisconsin-Madison, EE.UU.) estableció la OCM-1 y UW-1 líneas celulares [11, 12].

Invasión de ensayo in vitro

Una cámara de Boyden modificadas que consiste en una membrana polyethelene teraphthalate (PET) con 8-um diámetro de los poros, precubiertos con Matrigel, artificial membrana basal, (Beckton Dickenson Labware, Bedford, MA) fue utilizado como se describe anteriormente [13], al ensayo de La capacidad invasora. PET membrana sin Matrigel se utilizó como control.

En pocas palabras, 1,25 × 10 5 células se han añadido a la cámara alta en el medio RPMI-1640 con 0,1% de SFB. Medio RPMI-1640 con 10% de SFB se añadió a la cámara baja como un chemoattractant para obtener la base de referencia la capacidad invasora de las líneas celulares. El efecto del mesilato de imatinib invasión fue ensayada por la adición de 10 μ M de imatinib mesilato para el RPMI-1640 suplementado con 10% de SFB en la cámara alta. Las concentraciones de imatinib mesilato fue elegido sobre la base de los niveles sanguíneos de la reportada en los estudios previos con la dosis máxima tolerada de mesilato de imatinib en los ensayos clínicos [14]. Las cámaras fueron incubadas a 37 ° C en el 5% de CO 2-atmósfera enriquecida por 48 horas para permitir la invasión celular a través de la Matrigel.

No invadir las células fueron eliminados de la cámara alta que limpia suavemente por la superficie de la membrana con una torunda de algodón húmedo. Membranas fueron removidos y luego teñidas utilizando una tinción de Diff-Quick conjunto, que los núcleos de células manchas púrpura y rosa citoplasma. Manchadas microscópicamente células fueron contados en 20 campos de alta potencia, al azar. Sólo las células cuyo núcleo había invadido completamente a través de la membrana fueron contados. Cada condición experimental, incluido el control, se realizó por triplicado y el número medio de células invasoras continuación se calculó para todas las condiciones experimentales.

Porcentaje invasión se determinó para cada línea celular en relación con cada condición experimental utilizando la fórmula siguiente: = invasión% (media del número de células que invaden a través de la matrigel y la media del número de células que migran a través de la membrana de control PET), multiplicado por cien. Las líneas celulares se clasifican de acuerdo a su capacidad invasora.

In vitro de la proliferación de ensayo

El Sulforhodamine-B basado kit de ensayo (TOX-6, Sigma-Aldrich) se realizó según el protocolo del Instituto Nacional del Cáncer [15]. En resumen, cinco líneas de células humanas UM Se sembró en pozos a una concentración de 2,5 × 10 3 células por así, en un mínimo de seis pozos por cada línea celular. Una fila de 8 pozos expuestos a sólo medio RPMI-1640 se utilizó como control. Veinticuatro horas después de la siembra, el mesilato de imatinib fue agregado a los pozos experimentales. La concentración de mesilato de imatinib fue de 10 μ M [14]. Las celdas se permitió a incubar por 48 horas después de la siembra de células. Después de este período de 48 horas, las células fueron fijadas a la parte inferior de los pozos utilizando una solución de 50% de ácido tricloroacético (TCA) durante 1 hora a 4 ° C. Las placas fueron lavadas con agua destilada, para eliminar los TCA y medianas, y secarse. El Sulforhodamine-B tinte se añadió a cada pocillo y se permite que se mancha durante 25 minutos. El tinte Sulforhodamine-B fue posteriormente retirado por el lavado con un 10% de solución de ácido acético y una vez más permite que se seque al aire. El tinte que se incorporó en el fijo células en la parte inferior de los pozos se solubilizados en una solución de 10 mM Tris. La absorbancia del soluto se midió utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 510 nm. Esto dio una comparación de la tasa de control de la proliferación celular más de 48 horas en comparación con el índice de proliferación de las células expuestas a imatinib mesilato durante el mismo período de tiempo a una dosis de 10 μ M.

Análisis Estadístico

Las diferencias en las tasas de invasión bajo tres condiciones experimentales para cada línea celular melanoma uveal se determinaron mediante la prueba de ANOVA. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los cálculos son basados en computadoras (11,5 SPSS, SPSS Inc, Chicago, Illinois, EE.UU.).

Resultados

Cincuenta y cinco de los casos fueron estudiados UM. Ocho siete por ciento de los tumores (n = 48) fueron clasificados como tipo de células mixtas (husillo y células epiteliales), el 9% (n = 5) ha predominio de las células epiteliales, y el 3,6% (n = 2), de células fusiformes.

Setenta y ocho por ciento de los casos (n = 43) se encontraron c-kit positivo (Figura 1A]. Entre los casos positivos, el 46,5% (n = 20) presentó con lo que se considera como de alta expresión. Todas las lesiones con alta inmunoreactividad (n = 20) tuvieron la membrana citoplasmática de células y expresión. Mientras tanto, entre lesiones con baja inmunoreactividad (n = 23), el 100% presentó una reacción citoplasmática y sólo el 30,4% (n = 7) presenta con una membrana de la célula-patrón de tinción (Figura 1B]. (Tabla 1]

La invasión por ciento de las líneas celulares de la línea de base de acuerdo con la invasión sin mesilato de imatinib fue: MKT-BR (38,4%)> OCM-1 (21,7%)> 92,1 (14,4%)> UW-1 (12%)> SP6.5 (3%). La adición de imatinib mesilato redujo la invasión en todas las líneas celulares: MKT-BR (1,03%); OCM-1 (0,1%), 92,1 (0,2%); UW-1 (0%); SP6.5 (0%) . Los resultados se muestran en la Figura 3.

No hay cambios visibles en citomorfología se observaron en reacción a la presencia de mesilato de imatinib (figura 2].

Diferencias estadísticamente significativas entre las tasas de invasión para el grupo control y el grupo de imatinib mesilato se encontraron en todas las líneas celulares (T test valor p <0.05).

La figura 4 muestra los resultados del ensayo Sulforhodamine-B. La media y desviación estándar para cada línea celular por cada condición se muestra en la Tabla 2. Las células que están directamente expuestos mesilato de imatinib mostraron una disminución en la proliferación de las cinco líneas celulares humanas (92,1, MKT-BR, OCM-1, SP6.5, UW-1) en comparación con el control (p valor de 0,001354991, 0,012655861, 9,47698 × 10 -7, 0,002754018 y 5,79576 × 10 -6 respectivamente).

Discusión

Se sabe que la proteína tirosina quinasas (PTK) tienen un papel importante en los mecanismos celulares, como la diferenciación, proliferación y los mecanismos de regulación, así como en la transducción de señales. C-kit es uno de estos PTK, que se expresa en una amplia variedad de tumores malignos humanos [16] incluida la crónica y leucemia mieloide aguda [6], [7] GIST, matocitosis [17], carcinoma de pulmón de células pequeñas [18], Cromófobo carcinoma de células renales [19], [20] cutánea y UM [16]. Como c-kit se expresa en condiciones normales de las células intersticiales de Cajal, células progenitoras de los GIST [7], el presente artículo estudia la expresión de c-kit en uveal melanomas, como normal coroidea melanocitos hacer expresar este marcador [21].

Hemos demostrado que más del 75% de UM de nuestra serie son positivos para el c-kit. Esta conclusión, de por sí, apoya la idea de un ensayo clínico de imatinib mesilato de UM, sobre todo en los casos con metástasis. Una vez que se detecta la enfermedad metastásica, ningún método eficaz de la terapia sistémica ha sido identificado [3]. Por otra parte, no el 100% de los GIST es positiva para c-kit. De hecho, el 6% de los GIST c-kit son negativos [22]. Antes de que el imatinib mesilato "era", GIST metastásico tenían una mediana de supervivencia de los tiempos que van entre 10-20 meses [23]. Hoy en día, imatinib mesilato controles en el crecimiento del tumor hasta el 85% de los GIST avanzado [24], con el 90% de la toxicidad aceptable [25].

En melanoma cutáneo, c-kit es fuertemente expresada en fase de crecimiento radial, y la escasa o nula expresión se considera en fase de crecimiento vertical y metástasis [26]. Por lo tanto, en los melanomas cutáneos expresión de c-kit parece estar relacionado con la etapa de la enfermedad. Para investigar más a fondo el mismo de la expresión de c-kit en la UM, se observó el tipo de células (husillo y epitelioide) en la que el c-kit se expresó, como es bien sabido que el tipo de células fusiformes es menos agresivo que el tipo epitelioide [1 ]. Ninguno de los estudios anteriores registró el tipo de célula en la que la expresión se estaba produciendo. Mouriaux et al [21] compararon la expresión de c-kit con el tipo de células tumorales (Callendar la clasificación) como un factor pronóstico de correlación, pero no estudio en el que las células son, de hecho, la expresión de los receptores. En general los casos, incluidos los epitelioide, el husillo y los tumores mixtos, el 90,7% de las células epiteliales fue positiva para c-kit, mientras que 83,7% de las células fusiformes expresó c-kit. Este hallazgo sugiere un papel diferente de la expresión de c-kit en cutáneos y UMs. Por lo tanto, c-kit se puede utilizar para diferenciar primaria UM metastásico de los melanomas cutáneos al tracto uveal [27]. Al igual que en UM, GIST pueden clasificarse en células fusiformes, epitheloid de células y tipo de células mixtas, aunque el pronóstico de relevancia en el tipo de células GIST parece limitada [7]. Al igual que en UM mostró en el presente estudio, la expresión de c-kit parece que se distribuyen por igual entre epitelioide y de células fusiformes morfología GISTs [28].

Pache et al [29] y Mouriaux et al [21] encontraron una membrana patrón de inmunoreactividad en todos sus casos positivos (n = 72, 87% de todas las UM, y n = 43, 75% de todas las UM, respectivamente). El último sugirió que inmunoreactividad citoplasmática se debe a la no maduras c-kit en lugar de una forma truncada o interiorizado, y la tinción de membrana podría corresponder a la c-kit de forma activa. All-Ericsson et al [16] considera positiva todos los tumores que expresan c-kit, independientemente de la localización de manchas, que significa membrana celular o citoplasmática (n = 84, 63% de todos UM). El presente estudio demostró que todos los casos con alta expresión de c-kit mostró tanto citoplasmática de la membrana celular y tinción. En cuanto a los casos con baja expresión, el 100% ha citoplasmáticos expresión, pero sólo el 30,4% había membrana de la célula-patrón de las manchas. En los GISTs, la expresión de c-kit es difusa fuerte citoplasmáticos y hasta el 50% de los casos muestran citoplasmáticos punto-como (el llamado "patrón de golgi") tinción [7]. Además, no existen estudios sobre las diferencias importantes entre la membrana citoplasmática y en la tinción de GIST. Por lo tanto, la hipótesis que todos los casos que expresan c-kit, o de la membrana citoplasmática, debe considerarse c-kit positivo.

GIST es un sarcoma derivados de la células intersticiales de Cajal, la acogida mutación de c-kit. Las mutaciones se detectan en aproximadamente el 71% de los tumores, la mayoría (más del 60%) la participación de exón 11, y menos exones 9 y 13 [28]. Melanoma coroideo que no tiene alteraciones de los exones 2, 8, 9, 11, 13 y 17 [29]. Sin embargo, el imatinib mesilato selectivamente inhibe no sólo de c-kit, pero también otras tirosina quinasas tales como Bcr-Abl y de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) factor receptor [30]. Nosotros pudimos demostrar que la disminución de la proliferación de las células de UM con mesilato de imatinib fue muy significativo, en la UM 4 líneas celulares a prueba y en el humano uveal transformado los melanocitos línea celular, en comparación con el grupo control. Otros estudios también imatinib mesilato de apoyo que pueden disminuir la proliferación de células de las tasas de UM [8]. El mecanismo de c-kit que interfiera de UM proliferación podría ser diferente de la mutación de c-kit, pero son necesarios más estudios para investigar esta hipótesis.

La concentración de imatinib mesilato utilizados para el estudios in vitro fue de 10 μ M. Esta concentración es equivalente a la más alta concentración de drogas realizados en la sangre de los pacientes que recibieron 1000 mg / día de imatinib mesilato, la dosis máxima tolerada reportados por los ensayos clínicos [14]. En esa dosis, la concentración sanguínea de imatinib mesilato varió de 6 a 10 μ M [14]. Según los ensayos clínicos, el tratamiento actual para los GIST es de 800 mg / día de imatinib mesilato [25]. All-Ericsson et al [16] demostraron que las concentraciones de 10 μ M de imatinib mesilato podría inhibir la proliferación de líneas celulares de 5 UM en el 50% (2 de ellos, OCM-1 y 92,1, también fueron estudiados en el presente artículo). Las diferentes concentraciones de mesilato de imatinib ha probado distintas respuestas de acuerdo a la línea celular. Pache et al [29] también tuvo la misma conclusión. Además, la última imatinib mesilato demostrado que no influye en la proliferación de melanocitos normales uveal. La humanos uveal transformado los melanocitos línea celular UW-1 estudiados en el presente artículo demuestran una disminución significativa en las tasas de proliferación y la invasión durante el tratamiento con imatinib mesilato. UW-1 fue originalmente derivados de uveal melanocitos, y transformarse en células de melanoma maligno en toda la cultura. Se postula que el imatinib mesilato podría actuar de una forma más general de que la vía del receptor c-kit, como lo hace UW-1 inhibe la proliferación e invasión tasas.

El efecto sobre la invasión de UM células en respuesta a imatinib mesilato nunca ha sido publicada antes. Tumor de las células invasoras debe poseer habilidades con el fin de que se produzcan metástasis. Debido a la falta de linfáticos en el ojo, las células del melanoma uveal debe abandonar el tumor primario a través de diseminación hematógena, con metástasis se producen casi exclusivamente en el hígado [2]. Nuestro estudio demostró que el imatinib mesilato redujo notablemente la invasividad de todas las líneas celulares de prueba. La invasión de ensayo es importante para mostrar la capacidad de las células para invadir una membrana de base, que simula el escape de las células del tumor primario, así como la implantación de células en el sitio de las metástasis. El uso artificial de la membrana basal puede estudiar la respuesta de las células invasoras a las drogas por contar la cantidad de células que invaden la capa matrigel. Una droga que puede inhibir o reducir la capacidad de invasión de células de la UM podría ser beneficiosa, ya que la mayoría de la UM son en la actualidad tratados de forma conservadora [31]. La disminución de la invasividad de las células tumorales, las drogas también disminución de la capacidad de implantación de células en el sitio de las metástasis. Por lo tanto, imatinib mesilato sería beneficiosa no sólo para los pacientes que ya UM desarrollado metástasis, sino también para los pacientes sin ningún signo de enfermedad metastásica.

Conclusión

Nosotros pudimos demostrar que melanomas de coroides primario expresar c-kit y el imatinib mesilato tasa de disminución de la proliferación y la invasividad de las células del melanoma uveal in vitro. Por lo tanto, nuestros datos apoyan un ensayo clínico para el estudio de imatinib mesilato en melanoma uveal.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer a la amabilidad de Farmacia Novartis de suministro imatinib mesilato para este experimento.

Dr Alexandre Odashiro Nakao cuenta con el apoyo de CAPES fundación.