Journal of Inflammation (London, England), 2005; 2: 12-12 (más artículos en esta revista)

Calor y proteínas de choque térmico shock factor 1 de expresión y localización en humanos infectados por el virus de vaccinia macrófagos derivados de los monocitos

BioMed Central
Aleksandra Kowalczyk (kowalczyk@awe.mol.uj.edu.pl) [1], Krzysztof Guzik (chris@awe.mol.uj.edu.pl) [1], Kinga Slezak (kingas02@interia.pl) [1] , Jakub Dziedzic (jakub-Dziedzic@Merck.com) [1], Hanna Rokita (hannar@awe.mol.uj.edu.pl) [1]
[1] Universidad Jagellónica, Facultad de Biotecnología; 7, San Gronostajowa, 30-387 Cracovia, Polonia

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Resumen
Antecedentes

Los virus siguen siendo uno de los inductores de la respuesta al estrés en las células infectadas. Heat shock respuesta inducida por el virus vaccinia (VV) se estudió la infección in vitro en sangre humana macrófagos derivados de los monocitos (MDM) como células de la sangre por lo general constituyen el principal sitio de la infección.

Métodos

Monocitos de sangre humana se cultivaron durante 12 - 14 días. Las transcripciones de choque térmico factor 1 (HSF1), la proteína de choque térmico 70 (HSP70), la proteína de choque térmico 90 (HSP90) y dos genes virales (E3L y F17R) se analizaron por la transcriptasa inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR), Y las correspondientes proteínas mediante Western blot. Heat shock factor 1 ADN vinculante actividades fueron estimados por turnos ensayo de movilidad electroforética (EMSA) y su localización subcelular analizados por immunocytofluorescence.

Resultados

Parece que la infección con el virus vaccinia conduce a la activación del factor de choque térmico 1. Activación de HSF1 causa aumento de la síntesis de una forma inducible de la HSP70 tanto en el ARNm y el nivel de proteínas. Aunque HSP90 mRNA fue mayor en las células infectadas por el virus de vaccinia, el contenido de proteína HSP90 se mantuvo sin cambios. En el momento de máxima expresión de genes del virus de vaccinia, un efecto inhibidor de la infección sobre el calor y la proteína de choque térmico shock factor 1 fue más pronunciada. Además, en la fase temprana de la infección por translocación de HSP70 y HSP90 desde el citoplasma al núcleo de las células infectadas se observó.

Conclusión

Preferencial nuclear acumulación de HSP70, el mayor estrés de la proteína inducible acompañante, sugiere que VV emplea este mecanismo de cytoprotection para proteger a la célula infectada en lugar de ayudar a la replicación viral. Los resultados en conjunto con nuestros previuos datos sobre monocitos infectados con el MDM o VV o S. Aureus firmemente sostienen que emplea varios celulares VV antiapoptótico / cytoprotective mecanismos para prolongar la viabilidad y la actividad proinflamatoria de las células de monocitos-macrófagos linaje.

Antecedentes

La manipulación del sistema inmunológico, especialmente la interferencia con componentes específicos de la respuesta apoptótica de las células infectadas es esencial para un virus para replicar y difundir en un host.

Virus de la vacuna poxviruses pertenece a la super-familia, un grupo de los grandes de ADN de los virus conocidos de su exclusiva fuera del núcleo en el citoplasma de la célula infectada [1]. Infecciones del virus de la vacuna son comúnmente asociados con una célula huésped generalizado de proteínas y ácidos nucleicos de inhibición de la síntesis, en función de tiempo y una dosis infecciosa. A pesar de observarse el cierre de acogida transcripcional y traduccional mecanismos selectivos y expresión de muchos genes virales, varias proteínas eucariotas son transitoriamente inducida o activada por poxviruses, por ejemplo, factores de transcripción [2], citoquinas [3, 4], las proteínas de choque térmico [5] y Enzimas antioxidantes [6]. Por otra parte, aunque principalmente necrótico, el virus de vaccinia se oponen a la apoptosis debido a varios anti-apototic genes presentes y expresó desde su genoma [7, 8].

Como condiciones de estrés por calor, las infecciones, las radiaciones y la exposición a productos químicos inducir un aumento de los niveles de proteínas de choque térmico en muchas líneas celulares [9]. Las proteínas de choque térmico puede ser inducida in vitro después de la infección por una gran variedad de los virus [10], como Ad5 y HSV-1 que se han mostrado para inducir la síntesis de una de las principales proteínas de choque térmico, HSP70. Virus de la vacuna ya se encuentra para ser un potente inductor de HSP70 en ratones [11, 12]. El papel de HSP70 en la infección por el virus vaccinia no se ha aclarado hasta el momento, sin embargo los resultados de los estudios anteriores en infectados por el virus de vaccinia U937 primaria de los macrófagos y las células sugieren su papel en el plegamiento de proteínas virales y virus asamblea [5]. Por otra parte, los estudios in vivo en ratones revelan falta de la influencia de la infección viral en el ciclo de vida [12]. Obviamente, constituyen HSPs acompañantes específicas para la proteínas víricas necesarias para garantizar la debida plegables, translocación y la formación de múltiples componentes de los complejos de proteínas víricas. Investigaciones recientes indican que las proteínas de choque térmico ejercer represión de la apoptosis [13 - 15] y, por tanto, podrían apoyar la infección por el virus vaccinia.

La inducción de la síntesis de proteínas de choque térmico anterior requiere la activación de factores de choque térmico. HSF1 se supone que es el principal mediador de la respuesta de estrés celular, que se une al elemento promotor choque térmico (HSE) [16, 17]. Se cree que en condiciones normales de monómeros HSF1 existen inactiva en el citoplasma en grandes complejos con otras proteínas de choque térmico, por ejemplo, HSP90 y HSP70. Al estrés, el calor, cuando se necesitan las proteínas de choque, HSF1 sufre trimerization, posterior translocación en el núcleo y vinculante para el choque térmico dentro de los elementos de regulación de las secuencias de la proteína de choque térmico genes [15, 18].

Para comprender más el papel del virus vaccinia en el curso de la infección, la respuesta de choque térmico se estudió en la sangre humana derivados de los monocitos macrófagos infectados con el virus vaccinia Western Reserve cepa.

Métodos
Cultivo de células

Leucocitos de sangre periférica (PBL) se aislaron por norma Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) gradiente de centrifugación de la sangre de donantes sanos. Las células fueron cultivadas en la concentración de 2 × 10 7 PBL de células por 5,5 cm plato de proteínas para la recolección o en la concentración de 8 × 10 6 PBL de células por 3,5 cm plato de inmuno análisis. Las células se cultivaron por 10-14 días en medio RPMI (Gibco) con 10% de suero humano (AB serotipo); medio fue cambiado cada 48 horas hasta que los monocitos alcanzado la adhesión. El adherente monocitos constituyen el 10% del total de PBLs puestos en el plato. Hepatoma humano HepG2 células se cultivaron en MEDM con 10% FCS en 60 mm de diámetro cultura platos por 48 horas antes de la infección o choque térmico.

La propagación de virus

El virus vaccinia Western Reserve cepa se propagó en células VERO-B4 (DSMZ, Alemania) infectados a la multiplicidad de infección (MOI), de 1 (una unidad formadora de placa, ufp, por casilla) mantuvo en MEM suplementado con 4% FCS inactivado por calor . Las células infectadas se cosecharon cuando el máximo se observó efecto citopático y la infectividad se estimó por una infectividad quantal ensayo sobre células VERO-B4 [19] y un estándar de la placa de ensayo. Macrófagos humanos fueron infectados con el virus en la multiplicidad de la infección por 1 o 5. Se lavaron las células infectadas después de 1 h de adsorción del virus y medianas frescas añadió.

Heat shock

El choque térmico se realizó en 42 ° C en el baño de agua durante una hora, seguido de 2-4 horas de recuperación a 37 ° C.

Proteína aislamiento

Las células se lavaron con 1 ml de PBS frío y cosechada a la Eppendorf de 2 ml en tubos de 1-2 ml de PBS. Las células cosechadas fueron centrifugadas a 250 × g durante 5 min. El pellet de células se suspendió ya sea en 400 μ l de la resuspensión de amortiguación para el aislamiento de las fracciones nucleares y citoplasmáticas de las proteínas de acuerdo con el método Suzuki [20], o en 150 μ l de buffer de la extracción (50 mM Tris pH 8,0, 10 mM CHAPS , 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4, 5 mM DTT, 1 mM PMSF, 10% de glicerol) para los extractos de células enteras [21]. Según el método Suzuki, la fracción nuclear contiene todos los núcleos, y el resto de sobrenadante que se denomina "frente al citoplasma de la fracción". La contaminación de los núcleos con citoplasma fue excluida sobre la base de mediciones de la actividad de lactato deshidrogenasa LDH utilizando un kit de detección de Boehringer Mannheim.

Se midieron las concentraciones de proteína utilizando el ensayo BCA (Sigma) que se basa en bicinchoninic ácido [22]. Se midió la absorbancia a 562 nm en el lector de microplacas SpectraMax 250 (Molecular Devices).

Western blot

Igual cantidad de los extractos de proteínas (10 μ g / carril) fueron separados por SDS-PAGE según el protocolo descrito por Laemmli [23]. La proteína de transferencia se realizó en un semi-seco secante sistema (Fastblot B31, Biometra) en el buffer de transferencia (25 mM Tris pH 8,3, 0,2 M glicina, el 20% de metanol, v / v) a 35 V durante 30 min. Igualdad de la carga de las muestras, e incluso la transferencia, fueron confirmadas por la tinción de las membranas con Ponceau S. La membrana (Hybond, Amersham Pharmacia) fue bloqueada con 5% de leche en polvo en TST buffer (10 mM Tris HCl pH 7,5, el 0,9% de NaCl, 0,05 Tween 20%) de 1,5 horas, seguido de un lavado de 20 min en el TST buffer. La membrana se incubó ya sea con el principal anti-HSF1 (H-311, sc-9144), o anti-HSP70 (K-20, sc-1060), o anticuerpos anti HSP90 (H-114, sc-7947) de Santa Cruz Biotecnología, en la dilución 1:1000 en el TST buffer con un 2% de BSA durante 1 h. La membrana se lavó cuatro veces en TST amortiguación durante 15 min. Secundario de conejo anti-anticuerpos IgG acoplado a peroxidasa de rábano (Amersham Pharmacia) fueron diluidos 1:5000 en buffer TST con 2% de BSA. La membrana se incubó con anticuerpos de la secundaria 1 hora, seguido de cuatro lavados de 15 min. TST en el buffer. La ECL-plus kit (Amersham Pharmacia) se utilizó para visualizar la proteína. Las membranas fueron expuestas en las películas de rayos X durante 10 minutos a 1 hora, y las películas se desarrollaron.

Movilidad electroforética cambio de ensayo

A cambio de la movilidad de ADN de ensayo se llevó a cabo tal y como se describe por Duyao [24]. El doble varados oligonucleótidos que contiene el sitio de unión HSF (5'-CTAGAAGCTTCTAGAAGCTTCTAGAA-3 ') eran una "óptima" elemento de choque térmico (HSE) con cinco perfecto invertido nGAAn repite desde el hsp70 humanos [25]. Fragmentos de ADN fueron etiquetados usando polimerasa Klenow y [α-32 P] dCTP rellenando 5'-domina de cuatro bases en ambos extremos después de recocido. Igual cantidad de proteínas (5 μ g) en el 10% de glicerol fueron incubados a temperatura ambiente durante 30 min. Con 0,5 ng de la etiqueta dsADN oligonucleótido en presencia de 2 μ g de poli (de-dC) en 10 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA y 0,1 mM de TDT en un volumen total de 20 μ l. Por supershift análisis, los anticuerpos policlonales de conejo contra la HSF1 (H-311, sc-9144X) de Santa Cruz La biotecnología también fueron preincubated con extractos de proteínas en 1:20 diluciones. Mezclas de incubación se electrophoresed en 4,5% nondenaturing gel de poliacrilamida en 0,5 × TBE. Los geles secos se analizaron por autorradiografía.

Extracción de RNA y RT-PCR

ARN total fue extraído a partir de cultivos celulares utilizando reactivo Trizol (Gibco). RNA de muestras (2 μ g) se utiliza para la síntesis de ADNc reacciones en un volumen total de 20 μ l con 10 μ l de cada muestra de ARN, 0,5 μ g oligo (dT) 12-18 cartilla (Gibco) y 200 U de SuperScript II RNAse H-Reverse Transcriptasa (Gibco), de acuerdo con el protocolo con la enzima. Aunque algunas muestras de ARN fueron tratadas con RNasa libre de DNasa para eliminar todos ADN genómico antes de la reacción RT, se recibieron resultados similares utilizando DNasa no tratados ARN preparativos. Las reacciones de PCR se realizaron utilizando F105S Taq polimerasa (Polygen) en las mezclas que contienen: 5 μ l 10 × PCR buffer, 1 μ l 10 mM dNTPs, 2 μ l de cada cebador, 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2, de 2,5 U (1 Μ l) Taq polimerasa, 2 μ l cDNA y 37 μ l de agua estéril. Las reacciones se llevaron a cabo en las siguientes condiciones: 94 ° C por 1 min, 60 ° C por 1 min y 72 ° C durante 1,5 min durante 30 ciclos (hsp70 y hsf1) o 95 ° C por 1 min, 50 º C por 1 min y 72 ° C durante 1,5 min durante 30 ciclos (hsp90 α α hsp90) o 94 ° C por 1 min, 55 ° C por 1 min y 72 ° C durante 1,5 min durante 30 ciclos (E3L, F17R, y β - Actina). Cada perfil térmico se terminó con la última prórroga de 72 ° C durante 15 min. Los productos de reacción fueron resueltas nondenaturing en gel de agarosa al 2% y visualizados por tinción con bromuro de etidio. El primer secuencias se enumeran en el cuadro 1. Los primers fueron diseñados para coincidir con las secuencias de exones separados (a excepción de la hsp70 codificada por un solo exón), para evitar la contribución del genoma-templated producto en el análisis de señales.

Inmunofluorescencia tinción de células

Las células fueron cultivadas en la cubierta de vidrio estéril resbalones 3,5 cm montadas en platos de la cultura. Las células fueron fijadas con paraformaldehído 3% en PBS a 37 ° C por 15 min y permeabilized con 0,1% Triton-X-100 en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Sitios de unión inespecíficos fueron bloqueadas con 3% de solución de albúmina sérica bovina en PBS y las células se tiñeron con la anti-humano HSF1 (H-311, sc-9144) anticuerpos policlonales de conejo (Santa Cruz de Biotecnología) en la dilución 1:200. La secundaria ovejas Cy3 anti-conejo conjugado IgGs (Sigma, C2306) se utilizaron en la dilución 1:200. ADN nuclear, además, se tiñeron con Hoechst 33258 (Molecular Probes) a una concentración de 0,5 μ g / ml durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se lavan tres veces con PBS. Cover resbalones fueron montadas en láminas microscópicas de vidrio utilizando Vectashield (Vector Laboratories) para prevenir la decoloración de los tintes fluorescentes. Microfotografías fueron tomadas usando un microscopio Leitz Orthoplan con un epifluorescence y contraste de fase óptica equipada con la Nikon FX-35DX cámara de alta sensibilidad películas Kodak TMAX 3200. Desde un punto de ambos, contraste de fase, así como imágenes de fluorescencia se tomaron fotografías.

Resultados
Cambios en el choque térmico factor 1 y la proteína de choque térmico mRNAs contenido durante la infección por virus vaccinia macrófagos de la sangre humana

Los niveles de HSF1, HSP70 y HSP90 mRNAs se determinó por RT-PCR en el control y macrófagos infectados por el virus. En la mayoría de células de este, ni HSP70, HSP90 ni se detectaron mRNA (Figura 1A], aunque en algunas culturas nivel basal de las dos transcripciones era visible (Fig. 1B]. Esta heterogeneidad se debe probablemente a las características individuales de los donantes de sangre o suero. En contrario, se HSF1 mRNA constitutivamente en el acumulado de todas las culturas examinado. El análisis no mostró ningún aumento de la HSF1 transcripciones hasta 48 h pi (con una baja dosis infecciosa, 1 ufp / célula), de manera similar a la respuesta de choque térmico cuando HSF1 ARNm no es inducida (Figura 1A]. Sin embargo, la cinética bifásica de HSF1 ARNm se observó después de dosis altas de la infección (5 ufp / célula), con el mínimo en 6 a 24 h pi máxima correspondiente a la transcripción de genes virales (Fig. 1B] [5]. Posterior disminución de la transcripción viral fue seguida por un aumento de mRNA HSF1 contenido.

HSP70 mRNA aumentaron a principios de la infección con el virus vaccinia una alta dosis, y la clara disminución se encontró bastante tarde, a las 96 horas pi La transcripción de baja después de aumentar la dosis infecciosa fue lentamente alcanzando el máximo a las 48 h pi La cinética de HSP90 mRNA aumento a los altos vaccinia Virus de la dosis fue similar a la de HSP70 ARNm, sin embargo su nivel anterior a la disminución de los niveles de HSP70 transcripción, ya que esto ya se observó a las 72 horas pi En MOI 1, HSP90 mRNA aumento fue lento, similar al aumento de HSP70 ARNm. HSP70, HSP90 y HSF1 transcripciones estimado después del choque térmico de los macrófagos se incluyen también para la comparación y β-actina transcripción se muestra como un control.

La expresión de genes virales en los macrófagos

Con el fin de comprobar la infección viral en sí, dos genes virales fueron elegidos: E3L principios de genes, responsables de los virus vaccinia antiapoptótico defensa de la vía de interferón [26], y los fines de genes virales, F17R, el producto de los cuales toma parte en la madurez Virión asamblea [27]. La RT-PCR de los genes virales mostró un aumento de la cantidad de mRNA E3L en 4 h pi, que se mantuvo hasta 96 h pi F17R mRNA se detectó también a las 4 h pi, pero aumentó a 14 h y mantuvo elevada hasta 96 h pi (Fig. 2]. Los resultados ponen de manifiesto, que el retraso en la replicación del ADN viral no se ha detenido en los macrófagos. Además, el aumento y la persistencia de los niveles de mRNA E3L apoyar nuestra conclusión sobre la resistencia a la apoptosis suscitó en las células infectadas.

HSF 1 actividad y localización de la proteína en el virus vaccinia macrófagos infectados

Heat shock factor 1 vinculante ADN fue analizado en la actividad nuclear y de los extractos de células enteras de los macrófagos por un cambio de movilidad electroforética ensayo. EMSA mostró a la unión a proteínas de choque térmico en el elemento de control, a las 16, y 24 horas de la infección por el virus vaccinia (Fig. 3A]. Supershift análisis de la totalidad de los extractos de células infectadas por el virus de vaccinia células y los extractos de las células no infectadas confirmó que el choque térmico factor 1 estaba presente en cantidades iguales (Fig. 3A]. Sin embargo, las proteínas nucleares aisladas en 16 h pi (Fig. 3A, carril 5) no forma clara el pasado-HSE complejo de anticuerpos, lo que sugiere que los epítopes reconocidos por los anticuerpos policlonales son oscurecidos por otras proteínas. Similar DNA-proteína, sin que los anticuerpos contra la HSF1 añadió, sólo se observó en los infectados por el virus vaccinia y tratados por calor hepatoma humano HepG2 línea celular (Fig. 3B].

Aunque HSF1 contenido de proteína no cambió en los extractos de células enteras después de la infección por el virus vaccinia y durante la respuesta de choque térmico (Fig. 4A], más HSF1 acumulado en los núcleos de las células infectadas que en el control de los núcleos de las células, especialmente a las 48 h pi (Fig. 4B y 4C] como Western blot revelado. El análisis con un policlonal anti-HSF1 suero HSF1 muestra dos bandas con movilidades de aproximadamente 70 y 80 kDa, que difieren en el estado de fosforilación (Fig. 4C] [28]. El hyperphosphorylation de HSF1 y translocación de los factores en el núcleo del virus vaccinia-macrófagos infectados fue claramente visto a las 24 h pi (Fig. 4C].

Indirecta inmuno tinción de macrófagos con anticuerpos anti-HSF1 (los anticuerpos secundarios conjugados con Cy3) mostró prevalentes nuclear y débil frente al citoplasma de la localización de los factores en el control de las células (Fig. 5]. Aún más proteína se observó en el citoplasma y núcleos de las células infectadas por el virus vaccinia a las 24 h pi El porcentaje de las células que contienen HSF1 exclusivamente en sus núcleos se calculó sobre la base de la inmuno tinción de las células y los valores medios de por lo menos 100 células seleccionadas al azar En cada muestra fueron el 24% y el 46% de las células infectadas y de control, respectivamente.

HSP70 proteína aumenta durante la infección y transitoriamente se acumula en el núcleo

HSP70 contenido de proteína aumentó durante las primeras 14 horas de infección (Fig. 6A], pero no tanto como se indica para el tratamiento de choque térmico macrófagos. El aumento se refleja en los cambios anteriores HSP70 mRNA contenido que se muestra en la Fig. 1. Prevalentes nuclear acumulación de la proteína se observó bastante tarde a las 24 y 48 horas pi (Fig. 6B], mientras que no se encontró a las 4 h pi (Fig. 6C]. Datos de los tratados por calor y el golpe de calor recuperado células también se incluyen (Fig. 6C].

HSP90 proteínas no aumenta durante el proceso de infección, pero transitoriamente localiza en el núcleo

HSP90 contenido de proteína no cambió durante la infección in vitro estimado por Western blot en los extractos de células enteras (Fig. 7A]. Sin embargo, desde el principio (en 14 horas pi) aumento en el contenido nuclear de la proteína fue encontrado de manera similar a los resultados obtenidos para la proteína HSP70 (Fig. 7B]. El análisis adicional de HSP90 contenido en el tratamiento de choque térmico y el choque de calor recuperado macrófagos reveló que el choque de calor de manera similar a la infección por el virus vaccinia, causa HSP90 translocación de proteínas en el núcleo y el efecto fue claramente visto 4 horas después del choque térmico (Fig. 7C].

Discusión

Varias proteínas celulares son utilizados por poxviruses y uno de los ejemplos es HSP70, que con los agregados de proteínas virales en el citoplasma [5]. Aunque el ciclo de vida del virus de vaccinia no parece depender de HSP70 expresión [12], la HSP70 transcripciones, así como la proteína aumentan de forma significativa en los macrófagos humanos a las 4 a las 24 h pi, como se muestra por nosotros y otros [5]. Ha sido bien documentado que la protección contra la apoptosis inducida por el estrés depende de la función de acompañante HSP70 [14]. Por lo tanto, los resultados presentados en este estudio indican que la HSP70 podría ser uno de los factores responsables de la supervivencia de la VV-macrófagos infectados. En contraste con los resultados presentados por otros que también sugieren un papel más importante de la piscina de HSP70 nucleares [5]. Nuestros datos muestran la localización predominante nuclear de HSP70 no apoyan la hipótesis sobre el posible papel de la HSP70 en el plegamiento de las proteínas virales [5], sino más bien hablar a favor de su papel protector en la biogénesis de los ribosomas en el nucleolos de las células infectadas [ 29].

El papel de HSP90 en la infección viral, sobre todo su acumulación nuclear (Fig. 7], sigue siendo poco clara. Nuestros estudios anteriores [4] ya han puesto de manifiesto el efecto estimulatorio de la infección por el virus vaccinia IL-10 sobre la expresión de genes en la sangre humana elutriated monocitos. El hallazgo se mantiene, de acuerdo con los datos sobre el aumento de la expresión de genes hsp90 de IL-10 en un hepatoma humano HepG2 línea celular y células mononucleares de sangre periférica [30]. La falta de inducción de la proteína HSP90 en el virus vaccinia las células infectadas se encuentran ya por otros [10, 31]. Sin embargo, estos autores [10] no se ha podido detectar un aumento de la inducción de la HSP70, y esta observación queda en contraste con nuestros resultados (Fig. 6]. Además, el diferencial de la cinética de HSP70 y HSP90 niveles de mRNA después de la exposición a un choque de calor en la sangre humana adherente monocitos también se encontró [32], por lo que el choque térmico respuesta parece ser similar en este aspecto a la infección por el virus vaccinia.

HSF1 no es una proteína de estrés-inducible, ni es su nivel de expresión, junto a la tasa de expresión de los genes de choque térmico [33]. Aunque la infección por el virus vaccinia causas aumento transitorio de mRNA HSF1, HSF1 ningún aumento en el contenido de proteínas se encuentra, probablemente debido a la inestabilidad de su ARNm. Por otra parte, la disminución de mRNA HSF1 observó al comienzo de la infección no afectar gravemente el contenido de proteínas a causa de una larga vida media HSF1 momento de la proteína [15]. La pequeña disminución en el contenido HSF1 por nosotros a los tres días pi (Fig. 4A], podría ser el resultado de la síntesis de proteínas celulares limitado observados durante la prolongada infección viral.

En las células en reposo, HSF1 se detecta predominantemente en una difusa citoplasmáticas y nucleares de distribución, y después del choque térmico que se traslada rápidamente a formar grandes y de forma irregular, gránulos nuclear [34]. Estas estructuras nucleares, a que se hace referencia como el estrés HSF1 gránulos, puede ser inducida por diversos subraya, y se detectan en los diferentes tipos de células [35]. En las células en reposo la localización predominante nuclear de HSF1, antes y después del choque térmico se ha comunicado [36], y nuestro análisis sugiere que HSF1 parcialmente permanece en el citoplasma de los macrófagos infectados (Fig. 5]. Active translocación de varias proteínas del núcleo para servir como factores de transcripción ya se encuentran algunos de los virus, que conduce su ciclo de vida en el citoplasma. Los últimos resultados proporcionan pruebas de que YY1 translocates en el citoplasma de las células infectadas por el virus de vaccinia para actuar como un activador de una de vaccinia finales de los genes [37]. El factor que ha sido contratado para el citoplasma de la vaccinia macrófagos infectados por el virus a través de un sistema de exportin-1, sensibles a leptomycin B [38].

La infección por el virus vaccinia traducido en la contratación masiva de la HSE vinculante en la actividad investigado las células (Fig. 3]. Sorprendentemente, sólo una pequeña parte de esta actividad fue reconocido por el anti-HSF-1-anticuerpos específicos, y el 'supershifted' fracción era constitutiva (Fig. 3A]. "Creemos que el observado HSE vinculante contiene HSF1 actividad, pero la mayoría de sus epítopes oscurecidas por el virus inducida chaperones, que en el acumulado de los núcleos de los macrófagos infectados en cantidades abundantes. La especulación con el apoyo de los resultados presentados en la Fig. 6B, que demuestran la preferencia nuclear acumulación de HSP70 y la falta de acumulación citoplásmica de HSP70 (Fig. 6B] después de la infección con el virus vaccinia. En consecuencia, la HSE observó vinculante actividad fue mucho más fuerte en los extractos nucleares (carril 1), que en los extractos de células enteras (carriles 2-4) (Fig. 3A]. El HSE vinculante similar actividad se observó en los extractos de la vaccinia-infectados o el calor conmocionado células HepG2 (Fig. 3B]. Es posible que la mayoría de HSP70 y HSP90 reconocen y se unen firmemente la preformados HSF1-HSE complejos in vitro [39]. Parece que la gran acumulación de estrés nuclear chaperones es característico para el virus vaccinia-las células infectadas.

MDM utilizado en nuestro estudio, VV sobrevivido a la infección del virus, aunque la reacción inducida por el estrés desarrollados en consecuencia a la dosis infectante (Fig. 1]. El cytoprotective papel del estrés parece evidente, ya que los macrófagos infectados con eficacia acumulada diferentes especies de ARNm durante al menos 4 días post infección. Fluorescentes examen microscópico de rutina no revelaron yoduro de propidio permeabilidad de las células infectadas (no se muestra). Hemos descrito previamente de que los monocitos de sangre periférica humana conservar viabilidad tras la infección con dosis bajas de VV [4]. Además, en las mismas condiciones experimentales HSP70 protegida contra los monocitos Staphylococcus aureus inducida por apoptosis [40]. Aparentemente, el reto por S. Aureus podría ser menos tolerables para los monocitos / macrófagos superior a la causada por el virus vaccinia. Es debido a la toxina α-toxina, que es del conocimiento de iniciar este tipo de apoptosis de los monocitos [41]. El poxvirus inducida cytoprotection parece ser mucho más eficaz que los demás tipos de reacción de estrés. Esa conclusión puede extraerse de la localización predominante nuclear de HSP70 en las células inducidas por el virus vaccinia. La localización predominante nuclear de HSP70 fue también observada en el virus sincicial respiratorio las células infectadas [42]. La reacción de estrés nuclear se ha considerado esencial para la protección también contra la hipoxia y el estrés oxidativo [43]. Viral las proteínas antiapoptóticas como el recientemente descubierto F1L [44] ciertamente actuar en concierto con Bcl-2 [45] y el estrés inducido por chaperones para prolongar la vida útil de las células infectadas. Poco se sabe sobre el impacto de patógenos inducida por los monocitos / macrófagos apoptosis en el sistema inmune. Persistencia de las células inmunitarias profesional albergar patógenos intracelulares en una práctica o un tejido linfático parece perjudicial para la inmunidad al menos por dos razones: en primer lugar, la respuesta inmune es desregulada por citoquinas y alteración de la presentación antigénica, en segundo lugar, las células se propone servir como incubadoras del virus [46].

Células de monocitos linaje recientemente se han reconocido como un modelo fundamental para el estudio de virus de acogida debido a las interacciones singular capacidad de estas células para cruzar a la actualidad endocytosed antígenos, especialmente en el contexto de chaperón proteínas [47]. Profundizar en la comprensión de la respuesta de choque térmico durante la infección con el virus vaccinia puede mejorar las estrategias de aplicación de la vaccinia recombinante genoma en la expresión génica, la vacunación y la terapia génica.

Declaración de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

AK monocitos llevado a cabo el aislamiento y la cultura, y participó en los inmunoensayos, KG participado en el diseño del estudio y se llevó a cabo el análisis RT-PCR, KS participó en el gel de cambio llevado a cabo el análisis y la inmuno análisis, JD participó en la inmunoensayos, HR concebido El estudio, participaron en su diseño y coordinación, participó en el cambio de gel de análisis y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de subvención 6P04A 02116 de la Comisión de Investigaciones Científicas (Varsovia, Polonia).