Saline Systems, 2005; 1: 8-8 (más artículos en esta revista)

Endoesporas de las bacterias halófilas de la familia Bacillaceae no aisladas de los suelos salinos japoneses podrán ser transportados por Kosa evento (Asia tormenta de polvo)

BioMed Central
Akinobu Echigo (dc0400017@toyonet.toyo.ac.jp) [1], Miki Hino (dc0400017@toyonet.toyo.ac.jp) [1], Tadamasa Fukushima (bioengtf@eng.toyo.ac.jp) [1] , Toru Mizuki (tmizuki@eng.toyo.ac.jp) [1], Masahiro Kamekura (mkamekura@mail.kikkoman.co.jp) [3], Ron Usami (bioeng@mail.cc.eng.toyo.ac. Jp) [1]
[1] Department of Applied Chemistry, Faculty of Engineering, Toyo University, 2100 Kujirai, Kawagoe, Saitama 350-8585, Japan
[2-2100 350-8585, Japón
[3] Noda Institute for Scientific Research, 399 Noda, Noda, Chiba 278-0037, Japan

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Resumen
Antecedentes

En general, los extremófilos se han considerado para sobrevivir en los ambientes extremos a los que se han adaptado para crecer. Recientemente muchos extremófilos han sido aisladas de los lugares en que no se espera que crezca. Alkaliphilic microorganismos han sido aisladas de muestras de suelos ácidos con pH 4,0, y thermophiles han sido aisladas de muestras de baja temperatura. Moderadamente numerosos microorganismos halófilos, que se define como aquellos que crecen en forma óptima los medios de comunicación que contiene 0.5-2.5 Molar (3-15%) NaCl, y halotolerant microorganismos que son capaces de crecer en medios de comunicación sin adición de NaCl y en la presencia de alta NaCl se han aislado de Ambientes salinos como salterns, sal de los lagos y el mar de arena. Ha sido tácitamente cree que los hábitats de halophiles capaz de crecer en medios de información que contienen más de un 20% (3,4 M) se limitan a los ambientes salinos, y no se han publicado informes sobre el aislamiento de halophiles de muestras de suelo ordinario de jardín.

Resultados

Hemos demostrado que muchas bacterias halófilas que son capaces de crecer en presencia de NaCl 20% son no habitar en ambientes salinos como la ordinaria de jardín, suelos, patios, campos y las vías de circulación en una zona que rodea Tokio, Japón. Los análisis de 16S rRNA de 176 secuencias de genes aislados sugiere que se les halophiles pertenecientes a los géneros de la familia Bacillaceae, Bacillus (11 aislamientos), Filobacillus (19 aislamientos), Gracilibacillus (6 aislamientos), Halobacillus (102 aislamientos), Lentibacillus (1 Aislar), Paraliobacillus (5 aislamientos) y Virgibacillus (17 aislamientos). Secuencias de 15 aislamientos mostraron similitudes inferior al 92%, lo que sugiere que pueden representar nuevos taxones dentro de la familia Bacillaceae.

Conclusión

El número total de bacterias al interior de las muestras de suelo se encuentran en un rango de 1,4 × 10 7 / g a 1,1 × 10 6 / g. Una décima parte del total de bacterias fue ocupado por endospore formadora de las bacterias. Sólo muy pocos de los endospore formadora de bacterias, aproximadamente 1 de cada 20000, son bacterias halófilas. La mayoría de las bacterias halófilas como endoesporas fueron sobrevivir en las muestras de suelo, en un rango de menos de 1 a alrededor de 500 / g de suelo. Las muestras recogidas de la costa en una ciudad frente a la Bahía de Tokio dio el número total de bacterias y aproximadamente 1000 endoesporas tiempo más pequeños que los de las muestras de suelo del interior. Halófilos número de bacterias por gramo, sin embargo, son casi los mismos que los de las muestras de suelo del interior. Una posible fuente de la endospore halófilos procedentes de Asia las tormentas de polvo se discute.

Antecedentes

Extremófilos son microorganismos adaptados a crecer en condiciones extremas, tales como el pH, temperatura, la salinidad y la ausencia de oxígeno [1]. Los representantes son acidophiles (Thiobacillus ferroxidans), alkaliphiles (Bacillus alcalophilus), hyperthermophiles (Thermoproteus tenax), la extrema halophiles (Halobacterium salinarum) y metanógenos (Methanobacterium formicicum). En general, se ha creído que sobreviven en los ambientes extremos a los que se han adaptado para crecer. Muchos extremófilos, sin embargo, se han aislado de los lugares en que no se espera que crezca. Alkaliphilic microorganismos fueron aisladas de muestras de suelos ácidos con pH 4,0, así como de los suelos neutros y alcalinos [2]. Thermophiles han sido aislados de ambientes de alta temperatura y también de las muestras de baja temperatura como el suelo, los alimentos, los excrementos del animal y el agua de mar [3]. Por ejemplo, Bacillus stearothermophilus (ahora Geobacillus stearothermophilus) y Clostridium thermoautotrophicus (ahora Moorella thermoautotrophica) fueron aisladas en suelo ordinario. Estrictamente anaerobios como metanógenos, sulfato-reductoras, y homoacetogens fueron aisladas de los arrozales durante el período de barbecho en seco, los suelos arables, y hasta el desierto de los suelos [4, 5]. Así, la idea de que el aislamiento de un organismo de un entorno determinado, no significa que el organismo que está creciendo en ambientes, pero sólo sobrevivir es ahora generalmente aceptada.

Halófilos microorganismos se adaptan a condiciones de alta salinidad y requieren una cierta concentración de NaCl para su óptimo crecimiento [6, 7]. Ellos han sido aislados de diversos medios salinos, como la sal de los lagos (por ejemplo, el Mar Muerto, el Great Salt Lake), salterns, solar sales de la sal del subsuelo y la formación. Extremadamente microorganismos halófilos requieren alta concentración de NaCl para su crecimiento, con un óptimo de las concentraciones de 2.5-5.2 M (15-30%). Haloarcula vallismortis y Haloterrigena turkmenica por ejemplo, se han aislado de la sal piscina Valle de la Muerte, California, y los suelos salinos De Turkmenia, respectivamente [8, 9]. Moderado halophiles se definen como aquellos que crecen en forma óptima los medios de comunicación que contiene 0.5-2.5 M (3-15%) NaCl, como Halomonas maura aislado de un saltern en Marruecos, y Marinococcus halophilus aisladas de las arenas del mar [10, 11]. Halotolerant microorganismos poseen la capacidad de crecer en medios de comunicación sin adición de NaCl y también en la presencia de altas concentraciones de NaCl. Por ejemplo, Halobacillus salinus aislado de un lago salado en Corea es capaz de crecer sin adición de sal y en los medios de comunicación que contienen hasta 23% de NaCl [12].

¿Halophiles que habitan en ambientes salinos no como un suelo de jardín, patios y sobre el terreno? Bacillus clarkii, B. Agaradhaerens y B. Pseudofirmus son ejemplos de halotolerant bacterias aisladas de muestras de suelo que mostraron ser tolerante hasta el 16% o el 17% de NaCl [13]. Sin embargo, ha sido tácitamente cree que los hábitats de halophiles capaz de crecer en medios que contienen concentraciones más altas, digamos que el 20% (3,4 M), se limitan a los medios salinos, [14, 15], y no se han publicado informes sobre el aislamiento De los microorganismos capaces de crecer en el 20% o más altas concentraciones de NaCl ordinario, no muestras de suelo salino. En 1980 Onishi et al. [14] investigadas exhaustivamente la aparición de bacterias halófilas, en más o menos salina muestras recogidas en el Japón. Adoptaron de enriquecimiento de la cultura en un medio que contiene 4 M (23,4%) NaCl, un habitual de concentración para el cultivo de Halobacterium spp. 168 cepas aisladas que, por último, pero no el enriquecimiento se obtuvo de un tercio de las 287 muestras de la arena y el mar, algas marinas recogidas en el mar. Ellos no incluyeron muestras de suelo ordinario de jardín. Cabe señalar que no pigmentadas haloarchaeon cepa 172P1 (designados más tarde como Natrialba asiática [16]] se aisló en su estudio de la playa de arenas secas con sales granular adjunto.

En este estudio, se definió "bacterias halófilas", por conveniencia, como los microorganismos que forman colonias en placas de agar medio de un complejo con 20% de NaCl añadido, y ha demostrado que son bacterias halófilas no habitan en ambientes salinos, como los suelos de jardín ordinario , Los astilleros, los campos y las vías de circulación en una zona que rodea Tokio, Japón. Análisis filogenético de los aislamientos sugirió que se halophiles pertenecientes a los géneros de la familia Bacillaceae.

Resultados
El aislamiento de bacterias halófilas de muestras de suelo

Las muestras de suelo (0,5 g cada una) tomadas de 360 plazas repartidas en placas de agar que contiene 20% de NaCl, con pH ajustado a 5,0, el 7,0 y el 9,0 respectivamente. El pH de las muestras de suelo osciló entre 5,0 y 6,0. Después de la incubación de las placas por 3 semanas a 37 ° C, colonia formaciones se observaron en 132 muestras de suelo (círculos rojos en la Fig. 1], por lo menos en una de las tres placas de agar. El número de colonias por placa de un rango de 1 a 51 placas a 40 el 1 de la placa. La suma de las colonias ascendió a 49 desde el medio de pH 9,0, 534 de la mediana del pH 7,0, y 61 desde el medio de pH 5,0. Mediante la inspección de cada plato, representante colonias fueron recogidos y trasladados a nuevas placas y purificada por enchapado de diluciones seriadas. Algunas cepas no forma gradual en las colonias frescas placas. Cuando las colonias no crecen en fresco 20% NaCl placas, la concentración de NaCl se redujo a 15 o 10%. Se observó que el 26 cepas no crecen en presencia de 20% de NaCl. De acuerdo con nuestra definición de este trabajo, estas cepas no son "bacterias halófilas", pero estas cepas fueron incluidos en la caracterización más (véase el debate).

Por último, se obtuvieron 176 cepas (Tabla 1): 27 cepas del 23 muestras en medio alcalino (pH 9,0), 139 cepas de 120 muestras en medio neutro (pH 7,0), y 10 cepas de las 9 muestras en medio ácido (pH 5.0) . Endoesporas fueron observados por microscopio después de la tinción de esporas [17]. Estas cepas se han mantenido a 5 ° C en placas de agar, de 10% de NaCl.

Por otra parte, de las 228 muestras de suelo (negro círculos en la Fig. 1], alrededor de dos tercios de las 360 muestras recogidas, las colonias no apareció en ninguna de las tres placas de diferentes valores de pH. No hubo distintas sesgo en la distribución de los círculos rojo y negro. Con el fin de estimar si esas muestras de suelo de hecho no contienen microorganismos capaces de crecer en el 20% de NaCl, dos muestras del suelo fueron recogidas al azar, y 0,5 g cada sobre se ha repartido a 10 placas de agar de pH 7,0. El número de colonias por placa varió de 0 a 3 placas de 1 a 5 en la placa, que asciende a 14 en la muestra 1. Desde otro muestra los números fueron de 0, el 3 de las placas a 4, el 1 de la placa, que asciende a 14 colonias. Estos datos pueden sugerir que bacterias halófilas capaces de crecer en el 20% de NaCl habitan cualquier muestras de suelo, por lo menos con una frecuencia de 1 cfu (unidades formadoras de colonias) / g de suelo, en el área de la investigación que hemos realizado.

Anaeróbica halophiles

Cinco muestras de suelo que dieron considerable número de colonias de la aeróbica culturas fueron repartidas mediante placas de agar (pH 7,0) y se incubaron en jarra anaeróbica durante 3 semanas. No se observaron colonias en absoluto, mientras que el 30 a 40 colonias de la misma aparecieron muestras de suelo incubados en condiciones aeróbicas.

Crecimiento gama de concentración de NaCl y pH en el líquido de los medios de comunicación

De las 27 cepas aisladas en el medio alcalino, 21 cepas no crecen en los medios de comunicación sin NaCl, y todos excepto uno (cepa N º 31) mostró un crecimiento óptimo en pH alcalino, 8.5-9.5, en presencia de 10% de NaCl. Por otro lado, alrededor del 78% (116/149 cepas) de las cepas aisladas en neutral y ácidos se han mostrado los medios de comunicación sean capaces de crecer sin adición de NaCl, y todas las cepas mostró un crecimiento óptimo a pH 6,5-7,5 (Tabla 1].

En total, 176 cepas fueron divididos en 3 grupos. Cepas del grupo Iy grupo II puede ser clasificado como moderadamente bacterias halófilas, de acuerdo con la clasificación propuesta por Kushner et al. [6].

Grupo I (54 aislamientos) mostró un crecimiento óptimo entre 1,7 y 2,6 M NaCl, y no el crecimiento, en ausencia de NaCl añadido.

Grupo II (62 cepas) mostró un crecimiento óptimo entre 0,9 y 1,7 M NaCl, y el crecimiento en la ausencia de NaCl añadido.

Grupo III (60 aislamientos) mostró un crecimiento óptimo entre 0 y 0,9 M NaCl, y el crecimiento en la ausencia de NaCl añadido.

Provisional de identificación de los aislamientos de 16S rRNA secuencias de genes

Secuencias de amplificación de PCR-16S rRNA genes fueron determinados (alrededor de 500 nucleótidos), y las 176 cepas fueron identificadas provisionalmente mediante la comparación de secuencias de depositado en bases de datos (Tabla 1]. Síntesis de la identificación provisional se presentan en la Tabla 2.

Ratios de bacterias halófilas total de las bacterias

El número total de bacterias (ufc en las placas sin NaCl) y bacterias halófilas se determinó en seis muestras de suelo del interior; tres muestras habían 30-40 colonias en el 20% de NaCl placas de agar (pH 7,0), y tres muestras acababa de 1 colonia En el mismo medio. Como se muestra en la Tabla 1, el número de ufc en las placas varió de 340 × 1000 × 1000 a 28, con lo que el total de bacterias al interior de las muestras de suelo se encuentran en un rango de 1,4 × 10 7 / g (340000 × 20 × 2) 1,1 × 10 6 / g (28000 × 20 × 2). En líneas generales, una décima parte del total de las bacterias fueron ocupados por endospore formadora de las bacterias, y sólo muy pocas de las que forman las bacterias endospore-, aproximadamente 1 de cada 20000 o más células, son bacterias halófilas. Cuadro 3 (A] también sugiere que la mayoría, si no todos, de las bacterias halófilas sobreviven como endoesporas en las muestras de suelo, en un rango de menos de 1 a alrededor de 500 / g de suelo.

En otro experimento, 0,5 g de una muestra de suelo se suspendió en 2 ml de cloruro de sodio estéril al 10%, y se calienta a 80 ° C. Después de una incubación de 0, 5, 10, 30, y de 60 minutos, tres alícuotas 0,1 ml fueron tomadas, difusión, el 20% de NaCl medio agar (pH 7,0), y se incubaron durante 2 semanas. Los datos en el cuadro 4 se indica claramente que el número de ufc (bacterias halófilas) mostraron disminución poco después del calentamiento durante 60 min, lo que indica una vez más que la mayoría de las bacterias halófilas como endoesporas sobrevivir en el suelo.

Bacterias halófilas en la acumulación al aire libre?

La acumulación al aire libre (polvo, arena fina, etc) se obtuvieron de lugares tales como los tejados de los edificios, veranda, coches, y cortezas de los árboles, donde las lluvias torrenciales que lavar los anteriores. Número de células bacterianas y endoesporas actual varía entre el 0,8 × 10 6 a 7,6 × 10 6 / g y de 89 × 10 3 a 812 × 10 3 / g, respectivamente. No colonias, sin embargo, se observaron sobre todo placas de NaCl 20% (pH 5,0, 7,0 y 9,0) de 0,5 g de muestras, incluso después de 8 semanas de incubación. Incubaciones repetidas acumulaciones recogidas al aire libre de 2 semanas después de las lluvias no se dan en todas las colonias.

Bacterias halófilas en la costa del suelo (arena)

Se recogieron muestras de seis de tres puntos de la costa de Tateyama, en la prefectura de Chiba, una ciudad frente a la Bahía de Tokio (Fig. 1]. Las muestras fueron suspendidos, calentada a 80 ° C, y sometida a conteo de colonias. Cuadro 3 (B] muestra claramente que el número total de bacterias y endoesporas fueron aproximadamente 1000 de tiempo más pequeños que los de las muestras de suelo del interior. Número de bacterias halófilas, sin embargo, son casi los mismos que los de las muestras de suelo del interior.

NaCl contenido de las muestras

Cl Los análisis de contenido de las muestras de suelo sugiere que NaCl contenido de las muestras de suelo tomadas de cerca de la costa fueron tan alta como 15-20 mg NaCl / g, mientras que el interior de 360 muestras de suelo contenidas menos de 1 mg NaCl / g.

Haloarchaea en muestras de suelo?

La placa de agar con 20% de NaCl utilizados en el presente estudio se basó en la media N º 168 recomendado por JCM (Japón Colección de microorganismos) para el cultivo de haloarchaea. Todos los de la rosa a café colonias que se podrían haloarchaea fueron recogidos, pero que todos ellos pertenecían a la familia Bacillaceae. Haloarchaea Para cerciorarse de que no están presentes en las muestras de suelo, por lo menos hasta el límite de detección, muestras de suelo fueron esparcidos sobre placas de agar, de 20% de NaCl, pH 7,0 y 9,0, suplementado con 30 μ g / ml ampicilina. En general, el número de colonias se redujo a menos de una décima parte de los obtenidos en los platos sin ampicilina. De cinco muestras de suelo de 107 muestras analizadas, cuatro colonias se obtuvieron en los platos de pH 7,0, y 12 colonias de los de pH 9,0. No parecía colonia de siete muestras de costa en Tateyama. Las colonias fueron trasladados a los medios de comunicación que contienen líquido ampicilina, y 10 cepas que crecieron fueron objeto de extracción de ADN y mediante amplificación por PCR utilizando tanto bacterias y archaeal 16S rRNA gen primer sets. Todos ellos obtuvieron bandas de amplificación sólo con primers bacteriana, lo que sugiere que no eran sino haloarchaea albergar bacterias halófilas plásmidos con genes de β-lactamasas.

Discusión

Definición de "halophiles moderado", "la extrema halophiles" y "halotolerant" ha sido durante mucho tiempo dada por Larsen [18] y Kushner & Kamekura [6]. En este trabajo se define "bacterias halófilas", por conveniencia, como los microorganismos capaces de formar colonias en placas de agar que contiene el 20% (3,4 M) NaCl añadido. En rigor, existen moderada halophiles que no fueron capaces de crecer en presencia de 20% de NaCl.

Es la distribución de las bacterias halófilas y Archaea restringido?

Desde bacterias halófilas han sido reconocidos a vivir en el Mar Muerto [18], numerosos microorganismos halófilos y halotolerant, tanto aeróbicas y anaeróbicas, las dos bacterias y Archaea, han sido aislados de ambientes salinos. Gracias a la entusiasta dedicación de A. Oren sobre microorganismos halófilos [7], se sabe que las bacterias halófilas no se limitan a la clase Bacilli (Bacillus sensu lato), pero distribuidos a través de las clases de cianobacterias, α -, β -, γ -, y Δ-proteobacteria, Clostridia, Actinobacteria Flavobacterias, etc Aunque Oren define la "halófilos", como la tolerancia y el 10% (100 g / L) NaCl en su libro [7], algunos de los microorganismos halófilos son capaces de crecer en el Presencia de 20% de NaCl. También sabemos que todos los microorganismos que fueron aislados intencionalmente halophiles como son los habitantes de los ambientes salinos. Por otro lado, algunas bacterias del suelo son capaces de tolerar altas concentraciones de NaCl. Por ejemplo, Bacillus clarkii, B. Agaradhaerens, y B. Pseudofirmus son tolerantes hasta el 16% o el 17% de NaCl [13]. Para el mejor conocimiento de los autores de este documento, no se han publicado informes sobre el aislamiento de microorganismos capaces de crecer en el 20% o más altas concentraciones de NaCl ordinario no salina muestras de suelo. Ha sido tácitamente cree que los hábitats de halophiles capaz de crecer en medios con más del 20% se limitan a los medios salinos, [14, 15].

Bacterias halófilas son aisladas de muestras de suelo

En el presente estudio, hemos demostrado que las bacterias halófilas que son capaces de crecer en presencia de NaCl 20% son en casi todos los que habitan en ambientes salinos no como ordinaria los suelos de jardines, patios, campos y las vías de circulación en una zona que rodea Tokio. Se aislaron 176 cepas, y el análisis de sus secuencias parciales de genes del 16S rRNA mostró que algunos de ellos poseen similitudes más alto que el 94,8% con los de Bacillus haloalkaliphilus [20], Filobacillus milosensis [21], Gracilibacillus halotolerans [22], Halobacillus karajensis [ 23], Halobacillus litoralis [24], Halobacillus trueperi [24], Lentibacillus salicampi [25], Paraliobacillus ryukyuensis [26], Virgibacillus halodenitrificans [27], Virgibacillus marismortui [28] y Virgibacillus picturae [29]. La mayoría de las cepas de estas especies han sido aisladas de los ambientes salinos, y se informó de que se halófilos, capaz de crecimiento en el 20% de NaCl. Todas las cepas de especies de los géneros de la familia Bacillacea se endospore formadores, excepto Bacillus saliphilus [30]. Secuencias de 15 aislamientos (14 aislamientos de medio alcalino, y un medio aislado de neutro) mostraron similitudes menos de un 92% a cualquier depositado secuencias, por lo que pueden representar nuevos taxones dentro de la familia Bacillaceae. Por razones desconocidas (s), las células de algunas colonias de las placas de aislamiento inicial no crecer cuando se transfiere a nuevas placas, pero creció en placas con menores concentraciones de NaCl. Algunos factores de crecimiento presentes en el suelo pueden ser responsables de este fenómeno [31].

Un gran número de bacterias halófilas del grupo I (no crecen sin adición de NaCl) se mostraron como alkaliphilic, y la mayoría de los grupos II y III, que creció sin adición de NaCl, se neutrofílica. El haloalkaliphiles, alkaliphilic bacterias halófilas y [2], se han encontrado principalmente en el extremo ambientes salinos y alcalinos, que se distribuyeron en los lagos del Valle del Rift del Este de África, soda lagos de los Estados Unidos y Mongolia Interior de China, etc

Muy interesante es el hecho de que ninguna de las cepas de bacterias halófilas mostró similitudes con microorganismos halófilos ninguna de las categorías mencionadas anteriormente, salvo el endospore formadora de Bacillus sensu lato. Sigue siendo una posibilidad, sin embargo, que las colonias de bacterias halófilas distintos Bacilli sobre placas de agar, lamentablemente, escapó de ser recogido para la purificación. Otra posibilidad es que esas bacterias halófilas perdido la capacidad de formar colonias en las placas de agar particular hemos utilizado durante las reiteradas transferencias en la depuración de los procedimientos, o que simplemente no forma colonias debido a unsuitableness de la composición de las placas de agar.

¿Son los halófilos Bacilli indígenas a la tierra?

- Formadores de esporas de la familia Bacillaceae eran fácilmente aislado de una serie de entornos por la suspensión de una muestra de agua y calefacción a 80 ° C durante 10 a 30 minutos, incluso desde entornos que no guardan relación con sus necesidades de crecimiento. Por ejemplo, un thermophile Geobacillus stearothermophilus fue aislada de un suelo ordinario, y muchos de los alkaliphilic Bacillus especies han sido aisladas de los suelos que no eran particularmente alcalinos [32]. Ahora sabemos que aproximadamente una décima parte del total cultivable bacterias presentes en suelo ordinario se endospore formadora de las bacterias, sólo muy pocos de ellos eran bacterias halófilas, y la mayoría de los sobrevivientes fueron bacterias halófilas como endoesporas. Asimismo, la distribución exacta de los llamados "los microorganismos del suelo" de cada taxón puede fluctuar dependiendo de los suelos y también de la temporada, del número de células de alkaliphiles metanógenos y han demostrado ser una orden de 10 4 a 10 5 / g de Neutral suelo [2, 4]. El número de endoesporas de las bacterias halófilas varió de menos de 1 a 500 / g en nuestros experimentos. Una pregunta es "¿endoesporas de las bacterias halófilas indígenas a la tierra, y si no, ¿de dónde venimos?" Aquí recordamos que (i) NaCl contenido de las muestras de suelo tomadas de cerca de la costa que figuran tan alta como 15-20 Mg NaCl / g, mientras que el interior de 360 muestras de suelo contenidas menos de 1 mg NaCl / g, y que (ii) el número de bacterias halófilas de endoesporas fueron casi los mismos en el interior de las muestras de suelo y muestras de arena la orilla del mar. Estos hechos indican claramente que la endoesporas de las bacterias halófilas no son ni de la mar ni de minutos nicho altamente salina producida por la evaporación del agua de mar sobre la costa. Entonces, ¿dónde están?

Bacterias en Asia polvo?

Aunque no tenemos confirmación de los datos en la actualidad, podemos especular que las bacterias halófilas han sido transportados por occidentales, ya sea como células vegetativas o como endoesporas de las indígenas ambientes muy salinos, como la sal de los lagos en Mongolia Interior o salterns enfrenta Mar Amarillo o Mar Oriental (Mar de Japón) en Corea. De hecho, varios nuevos géneros y especies se han aislado de estas zonas recientemente. Se ha comprendido que Eolias polvo (polvo de minerales) y de las tormentas de arena están azotando el noreste de Asia [33]. Las tormentas se originan en el árido interior partes de China y Mongolia y el golpe a través de la península de Corea y el Japón. Se cree que las masas de aire frío procedentes de Siberia látigo desiertos y hacia el este los suelos después de la seca de invierno continental. Los polvos patadas hasta en el jet stream se llevan por la corriente occidentales del continente a través de Asia, en el Mar de Japón y el Océano Pacífico y llegar a la tierra en los principales Estados Unidos en tan sólo cinco días. Está demostrado que el polvo llegue incluso a Hawai, que es más de 6000 km de distancia [34, 35]. China tormentas de arena se denominan Huangsha en China, "Asia polvo" o Whangsa en Corea, y "arena amarilla" o Kosa evento en Japón. Los autores de este estudio creen que las bacterias, por lo menos sus endoesporas, prosperando en los lagos de sal, soda lagos, y los suelos salinos que rodean en la árida región han sido llevadas a Japón durante miles de años junto con los polvos minerales. Un transporte de larga distancia de esporas de hongos por los vientos en todo el Canal Inglés se demostró por Hirst et al. [36]

Células de la no endospore formadora de bacterias halófilas y arqueas halófilas (véase más adelante) en la floreciente medios salinos, que se dirigiera a Japón por el oeste junto con el endoesporas, pero moriría más tarde o más temprano después de su llegada al suelo, al menos a causa de La hipotónica condiciones causadas por las lluvias.

¿Cuánto tiempo han prosperado en el suelo?

Si por encima de la especulación es correcta, la siguiente pregunta es "¿A qué están ahí densidad endoesporas de las bacterias halófilas en la arena amarilla y cuánto tiempo hace que sobrevivir en el suelo?" El hecho de que el polvo acumulado durante varios días después de la última precipitación No se dan las colonias, el 20% de NaCl placas de agar sugiere que la frecuencia de la presencia de bacterias halófilas de endoesporas transportados por el oeste son muy bajos, y 40 colonias que apareció en la placa de agar son el resultado de la precipitación de la endoesporas por un tiempo muy largo Span. Endoesporas se sabe son capaces de sobrevivir durante bastante tiempo, por lo menos varias décadas, o incluso miles de años. Hay un famoso caso de que un endospore de bacterias estrechamente relacionadas con Bacillus sphaericus existentes se reavivó y cultivadas a partir de la extinta abdominal contenido de las abejas preservado durante 25 a 40 millones de años en ámbar enterrado Dominicana [37]. Una forma aún más espectacular se afirmaba que una bacteria estrechamente relacionados con Virgibacillus marismortui fue aislado de inclusiones fluidas en cristales de sal de roca Pérmico, más de 250 millones de años [38]. Aunque no hay datos bien documentados sobre la longevidad de endoesporas en el suelo, se puede esperar que por lo menos pueden sobrevivir durante décadas.

Halófilos cepas de la clase Bacilli de la falta de medios salinos

Recientemente, varios moderadamente bacterias halófilas, en representación de nuevas especies del género Halobacillus (97,1 a 98,4% a Halobacillus litoralis similitudes en el 16S rRNA secuencias de genes) fueron aislados de enriquecimiento de la cultura en un medio que contiene 20% de NaCl dañados muralla medieval pinturas y materiales de construcción En Austria [39]. Para el mejor conocimiento de los autores de este trabajo, esta es la única excepción de la de aislamiento de bacterias halófilas de la falta de medios salinos. Virgibacillus carmonensis, V. Necrópolis y V. Picturae aisladas de muestras de la formación de biopelículas en la pintura mural en España [28] son moderadamente halófilos con un crecimiento óptimo en la concentración de NaCl del 5 al 10%, pero no está claro si son capaces de crecer en el 20% de NaCl.

Conclusión

Una respuesta a la pregunta "¿Son las endoesporas de las bacterias halófilas indígenas a la tierra, y si no, ¿de dónde venimos?" Que se endoesporas de las bacterias halófilas NO son indígenas a la tierra, y que no son ni de mar ni Minutos de nicho altamente salina producida por la evaporación del agua de mar sobre la costa. Podemos especular que el endoesporas de las bacterias halófilas detectados en este estudio fueron los resultados de la precipitación en el largo plazo, durante años, al menos, del ambiente que han sido transportados por los indígenas de occidentales altamente ambientes salinos, como la sal de los lagos en Mongolia Interior Salterns o en Corea.

Métodos
Las muestras de suelos, la acumulación en los techos, etc, mar y arena

Un total de 360 muestras de suelo se recogieron en una zona (103 km por 126 km) que rodean Tokio, Japón (Tokio, Saitama-, de Chiba, Kanagawa-y de la prefectura de Ibaraki) (Fig. 1]. Cada muestra de suelo se tomó de superficies tales como jardines, campos, caminos y patios, que se separan entre sí por al menos 1 km. No existen ambientes altamente salina en la región, como salterns y lagos de sal. Por otra mano, el 6 de la acumulación de las muestras fueron tomadas del techo de un automóvil, los techos de tres edificios, y el mirador de la construcción de dos habitaciones en el campus de la Universidad de Toyo o de las ciudades cercanas. Algunas de las muestras fueron tomadas de la costa también de Tateyama, una ciudad del sur de la prefectura de Chiba que enfrenta la bahía de Tokio-(Fig. 1]. Cada muestra de suelo se recogieron en 50 ml tubos estériles FALCON (Becton Dickinson) con espátula estéril, y se mantuvo a temperatura ambiente hasta su uso.

Agar medios de comunicación para el aislamiento de bacterias halófilas y archaeal cepas

Un medio de cultivo complejo que figuran los siguientes ingredientes (por litro). 5,0 g casamino ácidos (Difco), 5,0 g de extracto de levadura (Difco), 1,0 g de sodio glutamato H 2 O, 3,0 g de citrato trisódico 2H 2 O, 2,0 g KCl, 0,2 g MgSO 4 7H 2 O, 36 mg de FeCl 2 4H 2 O, 200 g (3,4 M) NaCl y 20 g Bacto-agar (Difco), pH 7,2. Después del autoclavado, el pH se ajustó a 5,0, 7,0 o 9,0 mediante la adición de pre-calculados cantidades de estériles diluido H 2 SO 4 o Na 2 CO 3 soluciones. Las muestras de suelo (0,5 g cada una) se coloca directamente sobre las tres placas de agar de los distintos pH, que se extiende con espátula, y se incuba a 37 ° C durante 3 semanas en bolsas de plástico para evitar la desecación. Colonias fueron detenidos, trasladados a nuevas placas de agar pH de la misma, y se obtuvieron cultivos puros de galvanizado por diluciones seriadas y reiteradas transferencias de las placas de agar en el mismo medio. En algunos experimentos, las placas de agar de pH 7,0 y 9,0 fueron suplementados con 30 μ g / ml ampicilina selectivo para el aislamiento de cepas haloarchaeal.

Determinación de la gama de crecimiento

El crecimiento fue determinado por vacunar a las culturas pre-purificado de las cepas en tubos de ensayo de 30 ml cada uno con 3 ml de líquido de los medios de comunicación con diferentes concentraciones de NaCl (0, 0,9, 1,7, 2,6, 3,4, 4,3 y 5,2 M, pH 7 o 9) y el pH ( 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 y 10,0, en presencia de NaCl 1,7 M) y se agita a 37 ° C con 120 rpm. El crecimiento fue supervisado por tomar 0,1 ml de caldo de la cultura y periódicamente la medición de absorbancia a 660 nm.

Las mediciones de los números del total de las células bacterianas, bacterias halófilas, y la formación de bacterias endospore -

Para la estimación del número de unidades formadoras de colonias y bacterias halófilas presentes en la muestras de suelo, 0,5 g de muestras se suspendieron en 2 ml de agua destilada estéril o solución de NaCl al 10%, diluida en serie con la misma solución, y de 0,1 ml cada una fue propagación Sobre placas de agar o sin adición de NaCl de 20% de NaCl, respectivamente, pH 7,0, seguido de incubación a 37 ° C durante 2 semanas. Separe los experimentos, el 9 de muestras de suelo han demostrado que el aumento de las concentraciones de NaCl placas de agar para el recuento de colonias (0, 5, 10, 15 y 20%) sólo se redujo el número de ufc El número total de endospore formadora de las bacterias fueron determinados después de un tratamiento térmico De la suspensión del suelo a 80 ° C durante 60 min, seguido de la dilución y en la difusión de las placas sin adición de NaCl. Resistencia al calor de endoesporas se sabe que difieren en diferentes cepas de Bacillaceae y depende de la concentración de NaCl durante el calentamiento [40, 41].

Espora-tinción

Endosporas formaciones de los aislamientos fueron examinados con un microscopio de contraste de fase (× 1000) o después de la tinción de esporas-de acuerdo con el método de Wirtz-Conklin [17].

Anaeróbica crecimiento

Para la detección de bacterias halófilas anaeróbico, 5 muestras de suelo fueron esparcidos sobre la placas de agar como se ha descrito anteriormente, y se incuba a 37 ° C en un frasco anaerobio utilizando un reactivo deoxygenation, Anaero Pauch Anaero, y Anaero Pack rectangular Jar (Mitsubishi Gas Chemical Co ., Inc, Tokio).

Análisis filogenético

Total AND fueron extraídos por el método de Cline et al. [42]. Los genes del 16S rRNA fueron amplificados por PCR y secuenciados directamente mediante el uso de la ABI PRISM BigDye Terminator ® v3.1 Ciclo de Secuenciación Kits (Applied Biosystems) con los siguientes primers adelante y atrás para Bacterias: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '(posiciones 8 -- 27 de acuerdo a la numeración de Escherichia coli) y 5'-GACTACCAGGGTATCTAATC-3 '(posiciones 805-786) de la ABI PRISM ® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). En algunos experimentos, el texto completo del 16S rRNA genes fueron amplificados por PCR adelante con el básico y una inversa ejemplo: 5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3 '(posiciones 1510-1492). Arqueales cartilla se establece 5'-ATTCCGGTTGATCCTGCCGG-3 '(posiciones 6-25 de acuerdo a la numeración de E. coli) y 5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3' (posiciones 1540-1521). El más cercano conocido familiares de los organismos secuenciados fueron determinados por la secuencia búsquedas en bases de datos. Estas secuencias y los de las cepas conocidas relacionadas obtenerse en el Banco de Datos de ADN de Japón [43 - 45] fueron alineados utilizando el CLUSTAL W Múltiples Programa de Alineación de secuencia [46]. El árbol filogenético fue reconstruida por los vecinos a participar en el método [47] y fue evaluada por arranque de muestreo [48].

Estimación del contenido de NaCl, pH, contenido de agua y de muestras de suelo

Diez gramos de cada muestra de suelo se suspendió en 100 ml de agua destilada, se agita durante 1 h, y sobrenadantes fueron obtenidos por centrifugación. NaCl contenido en las muestras de suelo se calculó mediante la determinación de Cl en el suelo, extracción por el método de Mohr [49]. El pH del suelo se determinó extraer con un pH-metro. Contenido de agua fue determinada por la medición de la disminución de peso después de la calefacción 1 g de muestra de suelo a 120 ° C durante 1, 2 y 3 horas.

Contribuciones de los autores

AE llevó a cabo el aislamiento y caracterización de las cepas, la secuenciación de genes del 16S rRNA, análisis, el diseño del estudio, y redactó el manuscrito.

MH llevado a cabo el aislamiento y caracterización de las cepas.

TF participó en el diseño del estudio.

TM participó en el diseño del estudio.

MK participó en el diseño del estudio y redactó el manuscrito.

RU dirigió la investigación y redactó el manuscrito.

Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Parte de este estudio ha sido el apoyo de una subvención para el Siglo 21 el Centro de Excelencia de los programas organizados por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón, desde el año 2003.