Lipids in Health and Disease, 2005; 4: 25-25 (más artículos en esta revista)

HDL aumenta la oxidación de la LDL in vitro en hombres y mujeres

BioMed Central
T Solakivi (tiina.solakivi @ uta.fi) [1], O Jaakkola (olli.jaakkola @ uta.fi) [2], A Salomäki (anne.salomaki @ luukku.com) [3], N Peltonen (nina. Peltonen@surfeu.fi) [3], S Metso (saara.metso @ pshp.fi) [3], Lehtimäki T (terho.lehtimaki @ pshp.fi) [3], Jokela H (hannu.jokela @ wlanmail.fi ) [3], Nikkari ST (seppo.nikkari @ uta.fi) [1]
[1] Departamento de Bioquímica Médica de la Universidad de Tampere, la Escuela de Medicina, Tampere, Finlandia
[2] Instituto de Tecnología Médica, Universidad de Tampere, Tampere, Finlandia
[3] Laboratorio de Genética de la aterosclerosis, Departamento de Química Clínica, Hospital de la Universidad de Tampere, Tampere, Finlandia
[4] Departamento de Medicina Interna, Hospital de la Universidad de Tampere, Tampere, Finlandia

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Resumen
Antecedentes

Modificación oxidativa de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) es un acontecimiento clave en la hipótesis de la oxidación de la aterogénesis. Algunos experimentos in vitro han sugerido anteriormente que la lipoproteína de alta densidad (HDL) co-incubadas con LDL impide Cu 2 + inducida por oxidación de la LDL, mientras que otros estudios han observado el efecto contrario. Para aclarar el papel global de HDL, en este contexto, aislado de LDL, HDL 2 y HDL 3 de los sueros de 61 individuos de vida libre (33 mujeres y 28 hombres).

Resultados

Cuando el LDL aislado fue sometido a Cu 2 + inducida por oxidación, 2 y HDL 3 partículas de HDL aumentó la tasa de aparición y la concentración final de dienes conjugados de manera similar en ambos sexos. Tasa de oxidación se asoció positivamente con el contenido de ácidos grasos poliinsaturados de las lipoproteínas en que es positiva en relación con el contenido de linoleate y negativamente relacionado con oleato. Más grasas saturadas por lo tanto, protegidos de las lipoproteínas de daños.

Conclusión

Llegamos a la conclusión de que el HDL in vitro no protege de la oxidación de LDL, sino que se oxida más rápido, de hecho, de todas las lipoproteínas debido a su composición en ácidos grasos, que es la promoción de la oxidación.

Antecedentes

Los estudios epidemiológicos muestran una correlación inversa entre la lipoproteína de alta densidad (HDL) y la concentración de riesgo de desarrollar enfermedad arterial coronaria [1]. Según una hipótesis ampliamente aceptada, su HDL o sustracciones desempeñar un papel importante en el reclutamiento y el transporte de colesterol de los tejidos periféricos al hígado para la excreción, una serie de eventos conocido como transporte reverso del colesterol [2]. Otras propiedades de la relación HDL antiaterogénico sus funciones a sus efectos antioxidantes. Algunos estudios han demostrado que la co incubación de LDL con HDL en presencia de cobre divalente impide la modificación oxidativa de las LDL [3]. En algunos informes de este hallazgo no se pudo confirmar, y de hecho se ha demostrado in vitro que el HDL se oxida más rápido que otras lipoproteínas [4]. Cuando el HDL es oxidatively modificadas, que altera a una forma que causa la acumulación de colesterol en los macrófagos. [5]. Se ha sugerido que la inflamación sistémica prooxidante da lugar a las partículas de HDL y proinflamatorias [6]. Oxidatively modificados HDL se encuentra en arteroesclerótica placas de aorta humana [7]. Oxidatively modificados HDL ya no es capaz de remover el colesterol de las células, y que ello fortalezca la oxidación del LDL [8].

Los hallazgos contradictorios sobre el papel de las HDL sobre la oxidación del LDL in vitro puede deberse más bien a las pequeñas poblaciones de estudio, y la informó de la heterogeneidad entre la cinética de oxidación de las lipoproteínas de los preparativos in vitro [9], que podría deberse a las distintas propiedades intrínsecas de las lipoproteínas. En el presente trabajo presentamos los resultados de un estudio del efecto de HDL sustracciones y ex vivo de género en la oxidación de la LDL de una población de 61 saludables de vida libre seres humanos.

Resultados

Antecedentes características de los hombres y mujeres que participan en el estudio se muestran en la Tabla 1. En comparación con las mujeres, los hombres tienen mayores índices de masa corporal, niveles séricos de colesterol total, así como las concentraciones de LDL y apoB. Los varones tienen más pequeñas de LDL de menor tamaño y la concentración de suero y HDL apoA-I que las mujeres.

La composición de ácidos grasos de ultracentrifugally aislados LDL, HDL 2 y HDL 3 fracciones fueron analizados por cromatografía de gas líquido (Tabla 2]. No se encontraron diferencias de género en las cantidades totales de ácidos grasos saturados, ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados de las LDL, HDL 2 y HDL 3. El peroxidizability calculado los índices también fueron similares en hombres y mujeres. En ambos sexos este índice aumentó significativamente de LDL a HDL 2 a HDL 3 (p <0,001, Wilcoxon coincide con la prueba de pares).

La oxidación de la LDL de todos los temas dio lugar a las típicas conjugado diene vs tiempo de las curvas, donde las diferentes fases de la formación de peróxido de hidromasaje son claramente discernibles. Co incubaciones de LDL, ya sea con 2 o HDL HDL 3 producidas bifásica con perfiles más rápida oxidación en el inicio, seguido por un ritmo más lento y por último, una fase más rápida propagación. Los perfiles de espera similar en todos los participantes.

Co incubación de LDL con 2 o HDL HDL 3 disminuido la media de tiempo que transcurre diene en la formación de las mujeres y los hombres (Cuadro 3]. Asimismo, la tasa media de propagación y la máxima concentración diene aumentado significativamente en la presencia de HDL. Estos parámetros de oxidación no fue diferente entre las mujeres y los hombres.

De regresión múltiple por pasos hacia adelante se realizó un análisis para estimar el efecto de los lípidos y factores relacionados con el metabolismo de las lipoproteínas de la oxidación de los parámetros. Predictores para el análisis multivariado se seleccionaron sobre la base de un primer análisis de correspondencias utilizando coeficientes de correlación de Spearman. Los modelos resultantes formado patrón consistente de los predictores. Los resultados de los modelos para las mezclas de LDL + HDL 2 se muestran en la Tabla 4. Los resultados fueron similares para las mezclas de LDL y HDL 3, y de LDL por sí solo (no se muestra). En estas incubaciones, un aumento en el tiempo que transcurre está relacionada con la concentración de glucosa en sangre en ayunas, y una disminución en el tiempo que transcurre está relacionada con la peroxidizability índice. Tasa de oxidación se asoció positivamente con el contenido de AGPI lipoproteínas. Concentración máxima de dienes fue positivamente relacionada con el contenido de linoleate y de la relación de LDL a apoB, y negativamente relacionado con oleato.

Aunque la media de tiempo que transcurre es más corta en la presencia de 2 o HDL HDL 3, había nueve sujetos que habían ya tiempo que transcurre cuando HDL 2 fue co incubadas con LDL. Se analizaron, si existen diferencias entre estos nueve sujetos y el resto del grupo de estudio que podría explicar el aumento del tiempo que transcurre. Estos nueve temas tuvieron un índice significativamente menor peroxidizability de HDL 2 (88,0 ± 12,3 vs 95,4 ± 9,5, p <0,05) que el resto del grupo. Su LDL desfase tiempo fue un poco más corta (55,7 ± 4,7 vs 61,0 ± 7,7 μ mol / l / min, p <0,05) y de su concentración de glucosa en sangre en ayunas fue menor (4,1 ± 0,5 vs 4,5 ± 0,5 mmol / l, p < ; 0,05).

Discusión

Se encontró que el co incubación de 2 o HDL HDL 3 con LDL en presencia de Cu 2 + traducido en la reducción de la media que transcurre el tiempo y la aceleración de la tasa de oxidación en comparación con la de incubación de LDL solo. Si transcurre el tiempo o la tasa de propagación son considerados como los índices de resistencia a la oxidación, este resultado contradice el papel de HDL como antioxidante. Nuestros resultados están en línea con los estudios realizados por Bowry et al. [4], Suzukawa et al. [10], Schnitzer et al. [11], Ohmura et al. [12] y Raveh et al. [9], que han llegado a la conclusión de que el HDL es más fácil que las LDL oxidadas. En otros estudios, ha HDL parecen ser menos propensos a la oxidación, e incluso para proteger a los LDL contra la oxidación inducida por cobre [3, 13 - 15]. En el estudio de Kontush et al. [16] todas las sustracciones de HDL exhibido una capacidad limitada para proteger LDL en las primeras etapas de oxidación. En fases posteriores, las pequeñas partículas de alta densidad HDL son los más potentes inhibidores de la oxidación del LDL bajo condiciones ligeramente oxidativo. Si firmemente oxidativo condiciones se utilizaron [5 μ mol / l Cu 2 +), ninguna de las HDL sustracciones ofrecido ninguna protección a las LDL. Los resultados fueron bastante similares si la subespecie fueron aisladas de suero o plasma EDTA-a pesar de sus muy diferentes paraoxonase actividades paraoxonase lo que sugiere que puede haber tenido un pequeño papel en la inhibición. En nuestro estudio la HDL 2 resta de la mayoría de los sujetos tenían propiedades que el aumento de la aparición de la fase de propagación. Sin embargo, en esta fase 9 participantes se retrasó en presencia de una moderada concentración de Cu 2 + haciendo hincapié en que la variación individual de las características intrínsecas de las lipoproteínas no puede pasarse por alto.

En total, cinética de los diferentes investigadores, los análisis de los efectos de las HDL en cobre inducida por peroxidación de las LDL son difíciles de comparar. (A) En primer lugar, las concentraciones de colesterol LDL y HDL han sido incoherentes y sus diversas formas de expresión se ha visto sobre la base de proteínas, lípidos totales, masa total, el colesterol o la concentración de fosfolípido, la concentración molar o número de partículas. Las investigaciones sobre la cinética de oxidación de las lipoproteínas de Raveh et al. [9] y Ziouzenkova et al. [17] demostró que el tiempo y la tasa de propagación dependen de la concentración de LDL. (B) En segundo lugar, las concentraciones de cobre También existen diferencias entre los experimentos. Esto tiene profundas implicaciones, ya que se ha demostrado en experimentos cinéticos que el tiempo y la tasa de oxidación se correlacionan con la concentración de cobre hasta que se llegue a saturar la concentración [9, 16, 18]. Sin embargo, hasta que se disponga de datos más, hay razones para pensar que el número de sitios de unión de cobre de las lipoproteínas no es constante sino que varía [18]. (C) En tercer lugar, la proporción de cobre a la lipoproteína ha variado entre los estudios. Se ha encontrado que el perfil cinético de la oxidación del LDL respuesta a los cambios en la concentración de cobre, y que el familiar monofásicos, auto acelerar perfil obtenido es sólo cuando la concentración de cobre es relativamente alta [17]. Todos los compuestos de la cinética de las curvas en nuestro estudio tenían una forma bifásica. La primera fase de rápida oxidación, de tal perfil, si se observa con el HDL o el LDL, se ha interpretado que se producen a través de un mecanismo mediado-tocoferol [9] en la que la vitamina E actúa como prooxidante. Debido a que la tasa de oxidación está regulado por la proporción de sujetos de cobre / lipoproteína como se ha señalado anteriormente, la adición de LDL a HDL debería, en teoría, han alargado el tiempo de oxidación y reducción de la tasa en lugar de ella, ya que el HDL obligados parte del cobre. Obviamente, muchos factores están involucrados en la determinación de los resultados de este tipo de experimento. Por otra parte, es evidente que los ex vivo oxidación experimentos con lipoproteínas de exigir la normalización.

Estudios anteriores han demostrado que hay varias propiedades intrínsecas de las lipoproteínas que pueden afectar a su susceptibilidad a la oxidación. Lipoproteína contenido en antioxidantes [19, 20], la composición de ácidos grasos [21, 22], la presencia de diferentes enzimas [13] y el tamaño de las LDL y HDL [16, 23] son algunos de los factores que han demostrado tener un impacto sobre los parámetros de oxidación , Especialmente en la ex administración de suplementos de estudios. Además, a largo plazo habitual de las dietas con diferente contenido en ácidos grasos han demostrado influir en la susceptibilidad de oxidación de LDL [24]. Se analizó la composición de ácidos grasos de la LDL, HDL 2 y partículas de HDL 3. Los ácidos grasos son muy intercorrelated, y, por tanto, su utilización en el análisis multivariante como predictores es problemático. Hemos tratado de superar esta dificultad de unir a la información en los perfiles de ácidos grasos en un único plazo - el índice peroxidizability - el que se describe el conjunto de la reactividad de los ácidos grasos hacia especies reactivas del oxígeno [25]. Los resultados (Tabla 4] muestran que este índice fue significativamente mayor en ambos HDL 2 y HDL en LDL 3 que en los hombres como en las mujeres, lo que sugiere que las partículas de HDL pueden ser más susceptibles a la oxidación de LDL. Esta opinión fue reforzada por las conclusiones que en el análisis de regresión múltiple peroxidizability índice de LDL, HDL 2 o HDL 3 en combinación con la concentración de glucosa en sangre en ayunas son los mejores predictores del tiempo que transcurre cuando el LDL se oxida solo o en mezclas con 2 o HDL HDL 3, respectivamente. Además, nuestro hallazgo de un menor índice de peroxidizability en aquellos temas cuyo desfase alargado en el tiempo la presencia de HDL2 está en línea con la sugerencia de que la tasa de oxidación se rige por la proporción de cobre obligado a oxidables lípidos [26]. Los resultados de nuestros experimentos confirman también las conclusiones de estudios anteriores y sugieren que la proporción de ácidos grasos poliinsaturados, así como los de ácido linoleico y ácido oleico [27 - 29] se relacionan con la tasa de oxidación y de la cantidad de dienes formado durante en Vitro oxidación. No tenemos listo explicación de por qué la concentración de glucosa había una correlación positiva con el tiempo que transcurre de oxidación sobre todo porque todos los temas se normoglycemic. Se ha demostrado que el LDL aisladas de pacientes con mal control de la diabetes tipo I es más susceptible a la oxidación inducida por cobre de LDL de los sujetos de control [30]. En consecuencia, se ha sugerido que la LDL glicada podrían ser particularmente propensos a la oxidación. Sin embargo, nuestro resultado está más en consonancia con los resultados obtenidos en bien controlados los diabéticos tipo I, donde glucosilada LDL dio un desfase de tiempo más largo que el de nonglycated LDL [31].

Conclusión

En conclusión, nos informan de que el tiempo transcurre, la mayor tasa de propagación para la formación de dienes y de la cantidad de dienes formado por Cu 2 + inducida por oxidación de la LDL solo o en la presencia de 2 o HDL HDL 3 no difieren entre sanos Hombres y mujeres, a pesar de diferencias significativas en las concentraciones de lípidos. Nuestros hallazgos no apoyan la idea de que la co incubación de LDL con HDL en presencia de cobre divalente impide su modificación oxidativa. Más bien, nuestro apoyo a las conclusiones anteriores de que los resultados in vitro HDL se oxida más rápido de todas las lipoproteínas [4], en parte debido a su composición en ácidos grasos, que es la promoción de la oxidación.

Métodos
Temas

61 individuos sanos de los estudiantes de medicina y personal del Departamento de Ciencias Médicas de la Universidad de Tampere y Hospital de la Universidad de Tampere se ofreció voluntariamente. El rango de edad de los sujetos fue de 20 a 58 años. 33 eran mujeres y 28 eran hombres. Todos los participantes llenaron un cuestionario, en donde se le dio énfasis a su estado de salud (enfermedades y el uso de la medicación), además de la conducta relacionada con la salud (tabaquismo, consumo de alcohol y vitaminas). Diez sujetos fueron fumadores actuales y dos se abstuvieron de alcohol. Concentración de glucosa en sangre en ayunas fue ≤ 5,7 mmol / l en todas las materias. Nueve mujeres y dos hombres informaron de la utilización de vitaminas y 12 mujeres utilizan preparados hormonales. Los resultados de dos de los participantes fueron posteriormente retirados de análisis informó de las enfermedades a causa de este modo, se mantuvo 59 temas. Todos los participantes dieron su consentimiento por escrito para el estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital de la Universidad de Tampere.

Extracción de muestras de sangre

El ayuno (12 h), se tomaron muestras de sangre en tubos adecuados (Vacuette, Greiner) de la vena antecubital en una posición sentada después de un descanso de 15 minutos usando el mínimo estasis. Las muestras para el aislamiento de las lipoproteínas LDL y de tamaño determinación se han tenido en pre-EDTA tubos refrigerados, que se puso de inmediato en hielo. El plasma se separó después de la centrifugación (Heraeus, 2000 xg, +4 º C). EDTA plasmas se complementaron con sacarosa (0,6% w / v concentración final). Este procedimiento ha demostrado preservar LDL de la oxidación de al menos dos meses y la curva de oxidación no difiere de la de una muestra fresca [32]. Todas las muestras que se mantuvieron congeladas a -70 ° C hasta el análisis. De sangre en ayunas se determinó la concentración de glucosa en sangre capilar de glucosa usando Hemocue Analyzer (Hemocue, Ängelholm Suecia).

Análisis de Lípidos y Lipoproteínas

Colesterol, HDL colesterol, triacilglicerol, apoA-I y se midieron las concentraciones de apoB con Cobas Integra 700 analizador automático (Roche Diagnostics, Basel, Suiza), utilizando reactivos y calibradores a lo recomendado por el fabricante. Colesterol LDL se calculó de acuerdo a Friedewald. Lp (a) fueron analizados por radioinmunoensayo (Pharmacia, Uppsala, Suecia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de Lipoproteínas

Lipoproteínas fueron fraccionados por ultracentrifugación isopycnic gradiente de densidad usando un rotor Beckman SW40 Ti L60 en una centrífuga Beckman (36000 rpm, 40 horas, 10 ° C). 2,0 ml de plasma se mezclan suavemente con 4,0 ml de d 1,35 g / l NaCl-KBr solución en un polyallomer 14 × 95 mm tubo. La mezcla fue sucesivamente más capas con 4,5 ml de solución de sal de anuncios 1,006 y 1,0 ml de agua destilada. Los gradientes fueron fraccionado, tal como se describe [33] y el 0,4 ml fracciones fueron recogidos. Los pertenecientes a las fracciones LDL, HDL 2 y HDL 3 se agruparon sobre la base de la curva de absorbancia. Una parte de las fracciones se agruparon inmediatamente congelado a -70 ° C y una parte se utilizó para la oxidación de los experimentos.

Oxidación de Lipoproteínas

La susceptibilidad de las LDL y de las mezclas de LDL y HDL in vitro a sustracciones de cobre-oxidación catalizadas se evaluó por el método descripto en [34], en su versión modificada de Esterbauer et al. [35]. LDL (50 μ g de proteína / ml ≈ 0,1 μ M) se incubaron ya sea solo o mezclado con autólogo HDL 2 (50 μ g de proteína / ml ≈ 0,35 μ M) o HDL 3 (50 μ g de proteína / ml ≈ 0,53 μ M). La concentración de proteínas se determinaron utilizando el método de Markwell et al. [36]. Oxidación se inició mediante la adición de 10 μ l de CuSO4 a una concentración final de 1,65 μ M Cu 2 +. El espectrofotómetro fue operado por computadora (UVWinlab 2.1). Este programa también recogió datos de la absorbancia en intervalos de 2 minutos durante la oxidación. Varios característica índices se obtuvieron a partir de la resultante de curvas de absorbancia frente al tiempo [32]. Para el control de la oxidación in vitro, procedimiento que preparó una piscina como se describe LDL [37] y se almacena a -70 ° C en 0,15 M-NaCl / 1 mM EDTA solución que contiene 0,6% de sacarosa. Un control LDL fue analizado en cada oxidación plazo. La inter-ensayo coeficiente de variación para el tiempo de retraso fue de 3,1%. Esta preparación LDL también se utilizó como una norma en electroforesis en gel de gradiente.

Análisis electroforético de lipoproteínas de tamaño

Para la estimación del tamaño de las partículas de lipoproteínas en plasma-EDTA muestras nondenaturing hemos utilizado el método de electroforesis en gel de gradiente de Krauss y Burke [38]. Sin embargo, los geles de poliacrilamida 2-16% fueron emitidos en el seno de acuerdo a las instrucciones dadas por Pharmacia (Uppsala, Suecia), tal como se describe [39]. Una muestra de control de plasma (partículas de diámetro pico de 27,00 nm) almacenados a -70 ° C, se incluyó en cada gel. La inter-ensayo coeficiente de variación durante los años de estudio fue de 1,1%.

Composición de ácidos grasos de las lipoproteínas

La composición de ácidos grasos de la ultracentrifugally aislados LDL, HDL 2 y HDL 3 fracciones fueron analizadas por capilar de la cromatografía de gases. Los lípidos se extrajeron con cloroformo / metanol, particionado, y la fase de cloroformo se seca bajo el N 2 [40]. Los lípidos fueron transesterified con H 2 SO 4 en seco metanol en 85 ° C durante 2 h bajo el N 2. A raíz de la adición de agua, ésteres metílicos de los ácidos grasos se extrajeron con éter de petróleo y analizados en un Shimadzu GC-14A cromatógrafo de gases (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón) con un detector de ionización de llama utilizando un Supelco SP 2560 columna capilar (100 m , 0,25 mm ID, 0,20 μ m de espesor película). El gas portador fue helio. La temperatura de la columna se realizó a 180 ° C durante 15 min y, posteriormente, programadas para aumentar a los 3 ° C / min hasta 230 ° C y que se celebró en esta temperatura durante 40 min. El individuo ácidos grasos fueron identificados con la ayuda de un estándar de la mezcla de ésteres metílicos (lípidos normas 189-15 y 189-17, Sigma). Las zonas se midió con un Shimadzu C-R4A Chromatopac Integrator y los resultados se expresaron como porcentaje de la suma de todos los ácidos grasos de 14:0 a 24:1. Como muestra de control que utiliza un grupo aislado de HDL que se mantuvo congelado a -70 ° C. El ensayo entre los coeficientes de variación de los porcentajes de los diferentes ácidos grasos varió de 0,3 a 4,4%. A partir de las composiciones de ácidos grasos, los índices se calcularon las siguientes: ácidos grasos saturados (SAFA) = Σ (%) de ácidos grasos saturados, ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) = Σ (%) de ácidos grasos monoenoic; ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) = Σ (%) de ácidos grasos poliinsaturados; peroxidizability índice (PI) = [(Σ mol% monoenoic AF × 0,025) + (Σ mol% dienoic AF × 1) + (Σ mol% trienoic AF × 2) + (Σ mol% Tetraenoic AF × 4) + (Σ mol% pentaenoic AF × 6) + (Σ mol% hexaenoic AF × 8)] [25].

Análisis Estadístico

Los resultados se expresan como medias ± desviación estándar. Plasma triacilglicerol y Lp (a) fueron utilizados como sus logaritmos, pero informó de que sus resultados originales. Las comparaciones se realizaron por análisis de varianza y covarianza o de Mann-Whitney U-test. Para par sabia comparaciones de Wilcoxon se utilizó la prueba coincide con pares. Univariante las asociaciones entre las variables se analizaron mediante coeficientes de correlación de Spearman. Predictores para el análisis multivariado se seleccionaron sobre la base de análisis de la correlación. El análisis multivariado se realizó mediante la regresión lineal por pasos adelante técnica. El Statistica para Windows (versión 5.1) paquete de software (Statsoft Inc, Oklahoma, EE.UU.) se utilizó para el análisis estadístico.

Lista de abreviaturas

HDL, lipoproteínas de alta densidad, LDL, lipoproteína de baja densidad; SAFA, ácidos grasos saturados; MUFA, ácidos grasos monoinsaturados;, AGPI, ácidos grasos poliinsaturados; PI, peroxidizability índice

Contribuciones de los autores

TS y DO concibe el estudio, participaron en su diseño, realizó el análisis estadístico y redactó el manuscrito, el PN y AS llevó a cabo el análisis de laboratorio, MS previsto y analizado el cuestionario de salud, TL, HJ y STN participó en la coordinación de la Estudio y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores gracias Marita Koli, Marja Jousimies y Marjo Virkki para la asistencia de expertos de laboratorio. Este estudio fue apoyado por el Fondo de Investigación Médica del Hospital de la Universidad de Tampere (TS, DO, TL, HJ, STN), el finlandés Fundación de Investigaciones Cardiovasculares (TL) y la Asociación finlandesa de Bioquímicos Clínicos (TS).