BMC Physiology, 2005; 5: 17-17 (más artículos en esta revista)

A corto plazo la administración de la hormona del crecimiento (GH) disminuye la presión arterial mediante la activación de eNOS / óxido nítrico (NO) en la vía masculina hypophysectomized (Hx) ratas

BioMed Central
C Henrik Nyström (henrik.nystrom @ fysiologi.gu.se) [1], Natalia Klintland (nkharitonova@hotmail.com) [2], Kenneth Caidahl (kencai@ki.se) [2], Göran Bergström (goran.bergstrom @ Hjl.gu.se) [1], Anna Wickman (anna.wickman @ fysiologi.gu.se) [1]
[1] Departamento de Fisiología, Instituto de Fisiología y Farmacología de la Academia Sahlgrenska, Universidad de Gotemburgo, PO Box 432, SE-405 30 Göteborg, Suecia
[2] Departamento de Fisiología Clínica, Hospital Universitario Sahlgrenska / SU, SE-413 45 Göteborg, Suecia

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Resumen
Antecedentes

El objetivo del estudio fue evaluar la grave y continua (de hasta 14 días de tratamiento) efecto de la hormona de crecimiento (GH) sobre la presión arterial (PA) y el reglamento para investigar la interacción entre la GH, el óxido nítrico (NO) y BP.

En un-GH completarse y complementarse hypophysectomized (Hx) las ratas macho, así como las ratas intactas, en reposo continuo presión arterial media (PAM) se midió usando telemetría. Baroreceptor actividad y las influencias de NO en el control de la PA se evaluaron durante la medición telemétrica. Además, el plasma y la orina basal de los niveles de nitrato y de la aorta la sintetasa del óxido nítrico endotelial (eNOS) se analizaron expresión. Función endotelial vascular, así como en la estructura del cuarto lecho vascular se estimó en vivo usando una constante corriente de la preparación.

Resultados

Hypophysectomy se asoció con una disminución MAPA (Alto x: 83 ± 3 vs Intacto: 98 ± 6 mmHg, p <0,05) y la frecuencia cardíaca (FC) (Hx: 291 ± 4 vs Intacto: 351 ± 7 beat / min, p < 0,05). Disfunción endotelial y la reducción de masa en la vasculatura del cuarto lecho vascular se encontró en Hx ratas. GH sustitución causado un nuevo descenso transitorio en el MAP y un aumento transitorio en materia de recursos humanos (14% y 16%, respectivamente, p <0,05). La reducción de la MAP que parecía ser dependiente de NO. Aórtica eNOS expresión es la misma. GH dado lugar a la sustitución de una alteración en la función baroreceptor. Dos semanas de tratamiento no se ha GH normalizar la PA, la estructura vascular y la función endotelial en la resistencia de los buques.

Conclusión

GH sustitución parece tener un efecto duradero en breve la reducción de la presión arterial a través de la activación de la NO-sistema. Una interacción entre GH, NO-sistema de regulación y BP se puede demostrar.

Antecedentes

Hipopituitarismo y adultos no tratados con hormona de crecimiento (GH) deficiencia (GHD) se asocia con disfunción endotelial [1], disminución sistémica de la formación de óxido nítrico (NO) [2] y aumento del riesgo de morbilidad y mortalidad cardiovascular [3], en comparación con el normal Población [4]. Hay disparidad de informes sobre el efecto en la presión arterial (PA) en esta condición; diferentes estudios han encontrado normotension, hipotensión o hipertensión en pacientes GHD-(para revisión ver [5]]. Reemplazo de hormona del crecimiento se ha demostrado que invertir muchos de los factores de riesgo cardiovasculares adversos asociados con GHD, incluida la disminución de la PA sistólica y diastólica, disminución de la resistencia vascular [6], el aumento del gasto cardíaco (CO), el aumento de la frecuencia cardíaca (FC) [2, 6 ], La mejora de la función endotelial [1, 7], y el aumento de la formación de NO [2].

Hypophysectomized (Hx) ratas expresar disminuido PA sistólica y presión arterial media (PAM), de CO y de recursos humanos en comparación con ratas intactas [8, 9]. Al igual que en humanos adultos GHD, estas ratas muestran disfunción endotelial y la disminución de la reactividad vascular [10, 11], mientras que la aorta óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) de expresión no se vea afectado [12]. Además, estas ratas también muestran disminución de los pesos corazón [12, 13], y la reducción de masa en la vasculatura muscular lecho vascular hypotropic sugiriendo una remodelación del sistema cardiovascular [13]. Una semana de GH en sustitución Hx ratas no da lugar a un cambio en la PA sistólica medida por la cola-brazalete técnica, mientras que en materia de recursos humanos, el peso del corazón y la aorta eNOS expresión son el aumento [12]. La resistencia de los vasos (arteria mesentérica) todavía demostrar disfunción endotelial [10]. Anteriores estudios sobre la regulación de BP Hx en ratas [10, 12, 13] han utilizado técnicas menos preciso para medir la PA es decir. Cola-brazalete técnica y, por tanto, mostró impreciso GH efecto sobre la aguda y permanente BP reglamento.

En el presente estudio tuvo como objetivo investigar la grave y continua (de hasta 14 días de tratamiento) efecto de la sustitución de la hormona de crecimiento sobre la presión arterial reglamento. Con el fin de medir el verdadero, este BP, se utilizó una técnica de la telemetría con implantables transmisores. Estamos también interesados en la investigación de la interacción entre la GH, NO y BP. Para ello se utilizó un bloqueador NOS y mide la aorta eNOS expresión, basal en plasma y orina los niveles de nitrato. Además, se examinó la actividad baroreceptor tanto al principio y al final después de inicio de tratamiento de GH. Al final del estudio, y la función endotelial vascular propiedades estructurales en los cuartos traseros se estudiaron in vivo utilizando una constante corriente de la preparación.

Resultados
La hormona de crecimiento causa una disminución transitoria en la presión arterial media y un aumento transitorio en la frecuencia cardiaca, Fig 1 y 2

Hypophysectomy per se, causó una disminución del 17% en el MAP y de recursos humanos antes de inicio de tratamiento hormonal (MAP; Intacto: 98 ± 6, Hx: 83 ± 3, GH: 81 ± 5, p <0,05 vs GH Intacto o Hx, Fig 1, en materia de recursos humanos; Intacto: 351 ± 7, Hx: 291 ± 4, GH: 295 ± 7, p <0,05 vs GH Intacto o Hx, Fig 2]. Ni el MAPA en materia de recursos humanos ni cambió cuando la Hx ratas fueron tratados con [GC + T 4] en comparación con los niveles pre-tratamiento o con ratas intactas (día -2, Fig 1 y 2]. La hormona de crecimiento causado una inmediata caída de la PAM por aproximadamente 14% (a 70 ± 4 mmHg, p <0,05 vs Hx, Fig 1], con un aumento concomitante en materia de recursos humanos por aprox. 16% (a 351 ± 6 beat / min, p <0,05 vs Hx, Fig 2]. Después de 14 días de terapia con GH, el MAP regresado a los niveles pre-tratamiento (día 14 = 81 ± 4 mmHg, Fig 1], lo que indica que la GH tiene un efecto transitorio sobre la regulación de BP. Del mismo modo, en materia de recursos humanos regresado a los niveles pre-tratamiento (pre-tratamiento = 319 ± 7 vs día 14 = 319 ± 8 beat / min, Fig 2]. La presión arterial media no ha variado en los dos Hx intacta y ratas durante el periodo de tratamiento (Alto x: 81 ± 3 a 83 ± 6 mmHg, Intacto: 98 ± 6 a 95 ± 6 mmHg). Además, ningún cambio en materia de recursos humanos se detectó en Hx intacta y ratas durante el periodo de tratamiento (Alto x: 291 ± 4 a 290 ± 6 beat / min, Intacto: 351 ± 7 a 368 ± 7 beat / min). A los 14 días, los recursos humanos, pero no MAP, fue cambiado de manera significativa entre los grupos (p <0,05 vs Hx GH, p <0,05 vs GH Intacto y p <0,05 vs Hx Intacto).

La hormona de crecimiento efecto en la disminución de la presión arterial fue NO dependientes, Fig 3 y 4
Aórtica eNOS expresión no fue afectado después de 14 días de la sustitución de GH

Hypophysectomy per se, no tuvo ningún efecto sobre los niveles de proteína eNOS aórtica (Intacto: 121 ± 31 vs Hx: 91 ± 26%). No hubo cambios significativos en la aorta eNOS expresión GH después de tratamiento en comparación con los dos Hx Intacto y ratas (GH: 110 ± 16%).

La hormona de crecimiento basal efectos en el plasma y la orina de nitrato y nitrato de limpieza

El nitrato de la orina fue menor, pero no disminuyó significativamente en el grupo Hx relación a la GH y la intacta (Hx: 216,16 ± 72,23, Intacto: 400,15 ± 94,65, GH: 641,1 ± 208,7 μ g M/ml/100 BW ns). Ambos Hx GH y ratas había significativamente más altos niveles de nitrato en plasma en comparación con ratas intactas (Hx: 79,4 ± 5,9, GH: 78,2 ± 5,7, Intacto: 46,4 ± 2,3 μ M, p <0,05 y entre Hx intacta y entre GH y intacta) . El nitrato de limpieza se calculó en todos los grupos, lo que demuestra que tuvo un aumento de GH en comparación con la limpieza Hx ratas, pero con similares ratas intactas (Hx: 1,8 ± 0,6, GH: 6,2 ± 2,0, Intacto: 6,2 ± 1,5 μ g l/min/100 , P <0,05 y entre Hx intacta y entre GH y intacto).

La hormona de crecimiento causado un debilitados baroreceptor actividad, Fig 5

El baroreceptor actividad, a prueba por fenilefrina, fue similar en las ratas intactas y Hx (Intacto: -0,94 ± 2,29, Hx: -2,35 ± 0,69 bpm / mmHg, la figura 5]. En contraste, GH dado lugar a una actividad baroreceptor debilitados (0,12 ± 0,82, p <0,05 vs Hx, Fig 5]. Cuando las ratas fueron pre-tratados con L-NAME, ninguno de los grupos diferían en baroreceptor actividad (Intacto: -2,41 ± 2,4, Hx: -2,23 ± 0,68, GH: -0,51 ± 0,40 bpm / mmHg).

La hormona de crecimiento aumenta de peso corporal

El BW de la Hx grupo no cambian con el tiempo, lo que indica una completa hypophysectomy (de la llegada del inicio del tratamiento: Intacto: 295 ± 11 a 391 ± 24 g, Hx: 251 ± 19 a 225 ± 13 g, GH: 256 ± 14 a 232 ± 15 g, p <0,05 entre Intacto y Hx, Intacto y GH en ambos puntos temporales). Después de 14 días de tratamiento, la [T 4 GC +] grupo no cambió en comparación con BW previamente tratados peso (Alto x: 232 ± 8 a 232 ± 7 g). Intacto El grupo aumentó en aprox. 2% en BW durante este período (391 ± 24 a 399 ± 28 g, NS). El aumento de GH en el grupo de armas biológicas en un 5% durante el período de tratamiento (de 256 ± 14 a 268 ± 19 g, p <0,05).

La hormona de crecimiento provocó un aumento del plasma de IGF-I

El plasma de IGF-I Hx disminuido en ratas por aprox. 85% en comparación con las ratas Intacto (Intacto: 1098 Hx ± 46 vs 164 ± 27 ng / ml, p <0,05). Hubo un aumento sustancial en el plasma de IGF-I tras 14 días de terapia con GH por aprox. 8 veces más (Alto x: 164 ± 27 vs GH: 736 ± 56 ng / ml, p <0,05). Las ratas tratadas con la hormona de crecimiento muestran una disminución significativa en el plasma de IGF-I en comparación con las ratas intactas (p <0,05).

La hormona de crecimiento efecto en el peso del corazón y los parámetros estructurales de la resistencia de los buques, en el cuadro 1 y la figura 6

El LV peso relativo no se ha modificado entre Hx intacta y animales. Sorprendentemente, hubo una pérdida significativa de peso en la LV GH después de la terapia por aprox. 2% (p <0,05 vs ratas Hx, Tabla 1]. La RV peso no fue cambiado entre los grupos (Cuadro 1].

El músculo esquelético Hx lecho vascular en ratas mostró una mayor sensibilidad (a la izquierda turno) a NA administrados por aprox. 22% en comparación con ratas intactas (Tabla 1], lo que indica un aumento de la sensibilidad de los adrenorreceptores á vascular. El tratamiento con GH dado lugar a una normalización de la sensibilidad NA (a la derecha turno) (Tabla 1]. La perfusión de la resistencia (PR) obtenidos en la máxima dilatación se redujo en aprox. 19% en ambos GH y Hx en comparación con el grupo de ratas intactas (Intacto: 1,94 ± 0,06, Hx: 1,16 ± 0,04, GH: 1,12 ± 0,08 g mmHg/ml/min/100 HQ seco, p <0,05 vs intacta y GH y Hx, Fig 6A]. Cuando se vasoconstricción inducida por medio de NA o con la angiotensina II + fenilefrina, y ambos Hx GH grupo mostró aprox. 42% y 40%, respectivamente, la disminución de la resistencia de respuesta en comparación con ratas intactas (Tabla 1]. Resistencia a cambios similares se obtuvieron en GH, Hx intacta y ratas después de máxima constricción fue inducida por BaCl 2 (Intacto: 61 ± 7, Hx: 26 ± 5, GH: 31 ± 4 mmHg/ml/min/100g HQ seco, p < ; 0,05 Intacto vs GH y Hx, Fig 6B]. La pendiente media calculada a partir de la presión individual de las curvas de flujo, obtenida durante el pleno también la relajación vascular, mostró similar magnitud de los cambios estructurales entre Hx, GH y ratas intactas (Intacto: 0,84 ± 0,04, Hx: 0,47 ± 0,02, GH: 0,44 ± 0,03 mmHg / HQ ml/min/100 g seco, p <0,05 vs Intacto GH y Hx, Fig 6C]. Tanto la GH y Hx ratas tratadas mostraron disfunción endotelial intacta en comparación con las ratas, demuestra por una disminución de la dilatación después de una dosis única de la acetilcolina (Intacto: 73 ± 1%, Hx: 65 ± 3%, GH: 61 ± 4%, Fig 6D] .

Discusión

Las principales conclusiones de este estudio son: (i) Hypophysectomy per se, causó una disminución del MAP y de recursos humanos, la disfunción endotelial y la reducción de masa en la vasculatura del cuarto lecho vascular. (Ii) La suplementación con [T 4 GC +] no cambió ninguno de los parámetros estudiados. (Iii) sustitución GH dado lugar a una disminución transitoria en el MAP y un aumento transitorio en materia de recursos humanos. (Iv) GH sustituido ratas presentaron una mayor respuesta MAPA después de la administración de L-NAME temprana en comparación con ratas intactas y Hx, lo que indica una activación transitoria de NO por GH. (V) a largo plazo GH tratamiento dio lugar a una alteración en la actividad baroreceptor. (Vi) 14 días de terapia con GH Hx ratas ni a la mejora de la función endotelial ni restaurado la estructura vascular. En su conjunto, la sustitución de GH parece tener un efecto duradero en breve la reducción de la presión arterial a través de la activación de la NO-sistema. El aumento transitorio en materia de recursos humanos es más probable mediada por una activación baroreceptor. Estos datos también indican que un período más largo de GH se requiere tratamiento para mejorar la función endotelial y de restaurar la morfología de la vasculatura. Por último, existe interacción entre la GH, NO-sistema de regulación y la presión arterial.

El efecto de la GH sobre la presión arterial

Terapia de la hormona de crecimiento a Hx ratas causó una inmediata y transitoria disminución de la MAP. Esta reducción en el MAPA parece ser dependiente de NO desde el L-NAME tratamiento MAPA causado una mayor respuesta que en ambos Hx intacta y ratas. "Creemos que este resultado puede reflejar un aumento de la actividad de eNOS y / o de expresión, lo que resulta en aumento de la biodisponibilidad del NO. Esto puede a su vez dar lugar a una disminución de la resistencia periférica total [6, 14], resultando en la reducción de MAP. La hormona de crecimiento y de IGF-I se ha demostrado que el aumento eNOS in vitro [15], así como para aumentar la eNOS expresión [12] y la formación de NO [2] in vivo.

Se ha sugerido que el tratamiento de GH puede estar asociada con un aumento en el volumen extracelular (VEC) [16 - 18]. Un mayor volumen de carga puede en teoría dar lugar a un aumento de la PA. Sin embargo, un estudio publicado anterior, el aumento de la concentración de sodio corporal y el aumento de GH después de la sustitución de la VCE GHD a los pacientes no se asociaron con un aumento de la BP [18]. En conjunto, esto sugiere que la carga de la VCE parece ser de menor importancia para la regulación de BP por lo menos en GH GHD pacientes tratados.

La GH activado NO-dependiente disminución de la MAP parece ser transitoria, ya 12 días de terapia con GH, se traduce en un aumento similar en el MAPA después de una sola dosis de L-NAME como lo hizo en los dos intacta y Hx animales. Este resultado es apoyado por la aorta sin cambios eNOS expresión en todos los grupos y el regreso del MAPA a los niveles pre-tratamiento en ratas tratadas con GH. El presente estudio mostró aumentos de nitrato de la orina después de 12 días de tratamiento de GH, lo que podría indicar que hay todavía algunos GH estimula la producción de la izquierda, si bien este aumento parece ser de menor importancia para la regulación de BP. El nivel de GH MAPA en ratas no regresó a la categoría en las ratas intactas. Es posible que la reducción observada de la resistencia de masas en los buques de los cuartos traseros lecho vascular podría ser la explicación. Folkow et al [13] han demostrado que las 6 semanas de tratamiento con GH y T 4 resultados en la normalización de la PA, así como un aumento de la masa vascular en el lecho vascular del cuarto. En más de GH-expresó ratones, el aumento de la masa vascular también ha sido descrito [19, 20]. Estos ratones muestran ya sea la hipertensión [19] o normotension [20]. Así pues, parece que la suplementación a largo plazo es necesaria para dar un efecto de la morfología vascular en la resistencia de los buques, así como para normalizar la PA. Sin embargo, el tratamiento con hGH Hx ratas para períodos de dos a tres semanas se ha informado de la obtención de anticuerpos contra GH [21]. Guiada por esta información, decidimos limitar el estudio a dos semanas.

Efecto de la hormona de crecimiento en el ritmo cardíaco y la actividad baroreceptor

En el presente estudio, la sustitución de GH resultados en forma inmediata y transitoria de aumento de los recursos humanos, que es, en parte, de acuerdo con otros estudios [2, 6]. Este efecto directo en materia de recursos humanos puede explicarse probablemente por un aumento de la actividad simpática que podría proceder de una mayor disparo de baroreceptors en respuesta a la disminución de MAP. Dos semanas de terapia GH dado lugar a una normalización de los recursos humanos. Este cambio transitorio en materia de recursos humanos se podría explicar por la desactivación de baroreceptors debido al aumento de la PA. Después de doce días de terapia con GH, baroreceptor actividad se carezcan de filo. El efecto de la debilitados baroreceptors más probable puede ser explicada de dos maneras; por pérdida de la estructura o por la de "restablecer". Ambos GH y Hx ratas demostraron una reducción de masa en la vasculatura del cuarto lecho vascular, pero sólo las ratas tratadas con GH muestran alteración de la función de la baroreceptors, lo que sugiere que la función de la debilitados baroreceptors no podía ser debido a la pérdida de la estructura en la baroreceptors GH en ratas. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la alteración de la función de la baroreceptors parece estar relacionada con "reajustar". Se ha sugerido que el NO parece actuar como un agente sympatholytic para modular el flujo simpático central [22]. Baroreceptor alteración de la actividad no parece ser NO-dependiente, ya que el efecto de la debilitados baroreceptors no ha cambiado después de L-NAME tratamiento.

Efecto de la hormona de crecimiento sobre adreno-receptores de la sensibilidad y la función endotelial

La hormona de crecimiento Hx ratas tratadas mostraron un derecho de cambio y / o normalización de la noradrenalina ED 50 en el valor de los cuartos traseros lecho vascular, que está de acuerdo con otros estudios [11, 13, 19]. A largo plazo de sustitución de GH en pacientes GHD se ha demostrado que la disminución de la actividad simpática muscular lecho vascular [23], mientras que la variabilidad de la frecuencia cardíaca muestra aumento de la proporción de sympato-tono vagal, la disminución de tono vagal y un aumento de tono simpático [24]. Esto podría indicar que el cambio de la derecha y / o normalización de la noradrenalina ED 50 en el valor del cuarto lecho vascular es causada por el aumento de tono simpático y cambiado la relación entre sympato-vagal y el tono vagal.

Es bien sabido que los pacientes GHD exposición disfunción endotelial [1, 25]. Este fenómeno ha sido detectado en ambos conductos [11] y la resistencia en los buques Hx ratas [10]. En consecuencia, en este estudio, la resistencia a los buques en el lecho vascular cuartos traseros también presentan disfunción endotelial en ratas Hx. Ni una semana [10] ni dos semanas de terapia GH traducido en la mejora de la función endotelial en la resistencia de los buques. Por el contrario, tanto los pacientes GHD GH complementado [7], así como GH Hx ratas tratadas [11] muestran la mejora de la función endotelial en el conducto buques. Esto sugiere que se requiere un tratamiento más largo para mejorar la función endotelial en la resistencia de los buques.

Conclusión

Hypophysectomy per se, se asocia con disminución de MAPA, en materia de recursos humanos y la pérdida de la estructura vascular. A la sustitución de la hormona de crecimiento Hx ratas da lugar a una disminución transitoria en el MAP y un aumento transitorio en materia de recursos humanos. Esta disminución transitoria de la MAP fue dependiente de NO. Tratamiento con hormona de crecimiento causado una alteración en la actividad baroreceptor. Dos semanas de terapia con GH ni la mejora de la función endotelial vascular ni restauradas parámetros. En resumen, la sustitución de GH parece tener un efecto duradero en breve la reducción de la presión arterial a través de la activación de la NO-sistema. Estos datos también indican que un período más largo de GH se requiere tratamiento para mejorar la función endotelial y de restaurar la morfología de la vasculatura. Por último, existe una interacción entre la GH, la presión arterial y el NO-sistema.

Métodos
Animales

Hombre rata Wistar fueron obtenidos de M & B (Ejby, Dinamarca). Las ratas se sometieron hypophysectomy aproximadamente a las ocho semanas de edad (aprox. 280-300 g) en M & B, una semana antes de la llegada a nuestras instalaciones. El protocolo se ajusta a las directrices sobre la conducta de los experimentos con animales expedido por la Junta Nacional Sueca para los animales de laboratorio y fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación Animal en la Universidad de Göteborg. Los animales fueron alojados a temperatura constante (20 ° C) a una humedad relativa de 50-60%. A 12 h oscuridad / luz ciclo se mantuvo con luces de encendido / apagado en 07,00 a 7,00 AM PM. Las ratas tienen libre acceso a la norma de pellets chow y el agua del grifo en todo el estudio. Todas las ratas fueron aclimatadas durante una semana antes del inicio del experimento. Peso corporal (BW) se midió a lo largo del estudio una vez a la semana.

Protocolo experimental

Dos diferentes protocolos experimentales se utilizaron.

La terapia de sustitución

En ambos protocolo 1 y 2 (ver más abajo), todos Hx ratas recibieron tiroxina (T 4, 20 μ g / kg / día) y glucocorticoides (GC, 400 μ g / kg / día) ([T 4 + GC]) por el tratamiento mini - Osmótica bombas sc (modelo 2004, Alza Pharmaceuticals, Palo Alto, CA, EE.UU.). Después de dos días de [T 4 GC +] tratamiento, la Hx ratas fueron divididas en dos grupos de los cuales uno fue tratado con GH (1 mg / kg / día) por una segunda mini-bomba osmótica sc (2ML2) durante 14 días.

Protocolo 1

Hypophysectomized ratas intactas y los controles fueron equipados con transmisores de telemetría para medición de la conciencia sin límites MAP y de recursos humanos durante 18 días (Intacto n = 5, n = 8 Hx, y GH n = 5). MAPA en materia de recursos humanos y se midieron dos días antes de inicio del tratamiento (día -2 a -4) y continuó a lo largo del inicio de la sustitución con [T 4 GC +] (Día -1 a 0) y el tratamiento con GH (Día 1-14) . Además de estas mediciones, dos se realizaron diferentes experimentos: 1) la actividad de la NO sistema fue evaluada por la administración aguda de L-NAME (principios, Día 3-4) y (tarde, el Día de 11-12), 2) Baroreceptor actividad fue evaluada por la administración aguda de la fenilefrina (día 11-12). Dos días de mediciones se registraron antes de la aparición de estos dos experimentos. A finales de los 14 días de protocolo, las ratas fueron anestesiadas, sacrificado y la sangre y los tejidos que se tomaron muestras para análisis adicionales.

Protocolo 2

Ratas en el segundo protocolo de la misma manera como fueron tratados en el protocolo 1, excepto que no implante los transmisores de telemetría (Intacto n = 14, n = Hx 12, y GH n = 12). En este protocolo, dos se realizaron diferentes experimentos; 1) el plasma y la orina se midieron las concentraciones de nitrato (día 10-12), 2) a finales de los 14 días de protocolo, la estructura vascular, así como la función endotelial en la cuarta parte posterior vascular La cama se evaluó in vivo utilizando una constante corriente de la preparación.

Experimental procedimientos
NO dependencia de protocolo

Para probar si el sistema no estaba involucrado en la GH dependen de la regulación de BP, un antagonista de NOS (L-NAME 15 mg / kg, sc) se dio durante dos ocasiones, antes de tiempo (3-4 días) y tardía (día 11-12 ). Salina se utilizó como control y en un volumen igual (0,1 ml / kg, sc). L-NAME y salina se dio en orden aleatorio.

Prueba de la actividad baroreceptor

Baroreceptor La actividad fue probado usando fenilefrina (300 μ g / kg, sc), después de un tratamiento previo con NaCl o L-NAME en el día 11-12. Tres horas después de fines de L-NAME o solución salina se les dio; todas las ratas recibieron una dosis única de la fenilefrina para generar un lento aumento gradual en el MAP y la correspondiente disminución baroreceptor suscitó en materia de recursos humanos dentro de los 60 segundos. L-NAME y NaCl se dio en orden aleatorio. Para determinar la dosis óptima de la fenilefrina, una curva dosis-respuesta se estableció en experimentos separados (datos no presentados).

Fin del experimento

El día 13-14 el ratas se recuperarse a base de referencia y las mediciones se realizaron. A los 14 días, las ratas fueron anestesiadas utilizando isoflurano y decapitado. Se recogieron muestras de sangre para análisis de IGF-I. El corazón y la aorta rápidamente fueron extirpados. El corazón fue separada en la izquierda (LV) (incluyendo septum), y los ventrículos derecho (RV) y pesado. La aorta fue recortado libre de grasa y tejidos adherentes, congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C para su ulterior análisis.

Las mediciones de IGF-I

Seleccionados al azar en las muestras de plasma de protocolo 1, el plasma de IGF-I Se analizó el contenido de un kit comercial RIA (Mediagnost, Reutlingen, Alemania) en ratas intactas (n = 3), Hx ratas (n = 5) y en GH (n = 5) las ratas tratadas [12].

Immunoblotting

Immunoblotting y técnicas de extracción de proteínas han sido descritas anteriormente [12]. En pocas palabras, la proteína se extrae de la aorta de ratas intactas (n = 5), Hx ratas (n = 8) y GH (n = 5) Hx ratas tratadas. El total de la concentración de proteínas fue determinada por un ensayo comercial de proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). 25 μ g de la aorta y el hígado de proteínas totales fueron cargados en cada carril de geles (10% NuPAGE ® Bis-Tris geles; Novex, San Diego, CA, EE.UU.). Los geles se corren durante 90 minutos en tensión constante (150 V). Peso molecular normas (Ver Blue ®; Novex, San Diego, CA, EE.UU.) se utilizaron en cada gel. Las proteínas se transfirieron a una polyvinyldifluoride (PVDF) membrana (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Las membranas fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal de ratón contra la eNOS (dilución 1:1000; Transduction Laboratories, Lexington, KY, EE.UU.). Inmunorreactivas proteína fue visualizado por quimioluminiscencia utilizando un conjugado de fosfatasa alcalina-secundaria de anticuerpos (dilución 1:30000; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) y CDP-Star ® (Tropix, Bredford, MA, EE.UU.) como sustrato. Las membranas fueron expuestas a la película ECL (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) a temperatura ambiente durante 1-5 minutos y las películas fueron desarrollados posteriormente. Semi mediciones cuantitativas de las proteínas de la immunoblots fueron hechas por densitometría (Fluor-S ™ Multimager, Cantidad Uno ver. 4.1.0, Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). La densidad óptica (DO) de cada grupo se midió. Lane que contiene extracto de hígado se utiliza como referencia en cada gel.

Nitrato de mediciones

Los animales fueron alojados individualmente en jaulas metabólicas. Durante el primer día de la medición, las ratas tuvieron libre acceso a agua de la llave y el nivel de pellets chow. Durante el segundo y el tercer día en las jaulas metabólicas, el ayuno fue inducida en animales de más de la noche con libre acceso a agua destilado. Esto fue con el fin de evitar la interferencia de los alimentos y el agua en la medición de nitrato [26]. Toma de agua, volumen de orina y se midieron BW. Durante el último día de las mediciones, se recogió la orina durante 24 horas, pesadas y congeladas para seguir el análisis de nitratos. Al final del protocolo, una muestra de sangre de aproximadamente 200 μ l fue extraído de la cola vena. Toda la sangre se centrifugó y se recogió el plasma congelado y para profundizar el análisis.

El plasma y la orina de nitrato de análisis

El plasma y la orina se analizaron muestras de total concentración de nitratos mediante una cromatografía de gases / espectrometría de masas como método anteriormente descrito [27]. En pocas palabras, después de las muestras había sido preparado, las muestras fueron inyectadas en un cromatógrafo de gases Varian 3400 equipado con un 30 m BPX-5 columna capilar operado con un programa de temperatura (60-240 º C). A Varian Saturno II sirvió como espectrómetro de masas que operan en el detector de iones positivos / ionización química modo de utilizar el metano como el gas reactante y selectiva la vigilancia de la masa equivalente m / z 124 para nitrato endógeno y la masa equivalente m / z 125 para el 15-N etiquetados Interno. Basal de la orina y las concentraciones plasmáticas de nitrato y nitrato de liquidación se calcularon.

Hemodinámico análisis de la resistencia de los vasos de diseño

Las características estructurales de la vasculatura del músculo esquelético hemodinámicamente se analizaron utilizando un método que se ha descrito en detalle previamente [13]. En resumen, las extremidades traseras aislados aleatoriamente de las ratas tratadas y no tratadas Perfusión de los pares en la aorta a través de una cánula. El perfundido consistía en un 2% de oxígeno-dextrano solución Tyrode, a los que el 0,5% de albúmina sérica bovina (Sigma Chemicals, St Louis, MISS, EE.UU.) se han añadido. Se midió la presión de perfusión a través de la arteria cannulated cola. La extremidad posterior lecho vascular fue inicialmente de máxima dilatación de las pupilas por las repetidas inyecciones de papaverina (3 mg total), con flujo constante de 10 ml/100 g extremidades traseras. Presión de la corriente de las curvas durante la máxima dilatación se construyeron, modificando la velocidad de la bomba de perfusión. Durante este flujo constante condición, la noradrenalina (NA) en el aumento de las concentraciones se añadió a la perfundido (20-64 μ g). En máxima NA constricción, una inyección de acetilcolina (0,01 mg, la dosis correcta se puso a prueba por las curvas de dosis-respuesta, no se muestran los datos) se le dio. Por último, la angiotensina II (200 ng), fenilefrina (4 mg) y BaCl 2 (150 mg) fueron inyectados. Noradrenalina curvas de dosis-resistencia se construyeron vascular de la extremidad posterior camas, y el 50 ED valor se calculó. Tras el experimento, los cuartos traseros se secaron a 70 ° C durante 48 horas y pesado. El peso en seco de la sede se utilizó para normalizar el cálculo de los parámetros hemodinámicos.

Hormonas, soluciones y drogas

Las siguientes hormonas se utilizaron; Thyroxine (T 4, L-tiroxina; Nycomed, Oslo, Noruega); glucocorticoides (GC, cortisol fosfato; Solu-Cortef, Upjohn, Puurs, Bélgica), de hormona de crecimiento humana (hGH, Pharmacia, Estocolmo, Suecia). Tiroxina, glucocorticoides y hGH fueron disueltos en el 0,9% de NaCl.

La composición (en mM) 2% de la solución Tyrode dextrano utilizado en experimentos de la infusión fue de Na + 148,0, Cl - 133,4, K + 4,3, Ca 2 + 2,5, Mg 2 + 0,8, HCO 3 25, H 2 PO 4 0,5 , D-glucosa 5,6.

Los siguientes fármacos se utilizaron: la acetilcolina (Sigma); receptores de la angiotensina II (Sigma); fenilefrina (Sigma); Noradrenalin (Sigma); ω N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, Sigma); dexametasona (Sigma); Papaverine (Sigma).

Análisis estadístico

Los valores se expresan como media ± SE. Los análisis estadísticos de BW, plasma de IGF-I, eNOS expresión, de plasma y orina basal de nitrato y nitrato de limpieza, la sede de todos los datos, la PA y la FC comparaciones entre los grupos y porcentajes cambios después de L-NAME tratamiento se realizaron utilizó un modelo lineal seguida Por Tukey's como una prueba post-hoc. Efectos hormonales en la BP y la HR se calculó mediante el uso de prueba "t" pareada de una media de 24 horas de antelación al inicio del tratamiento en comparación con el promedio de 24 horas después de inicio del tratamiento. L-NAME efecto sobre BP porcentaje se calculó comparando los 10 valores pre-tratamiento y el 10 de los valores post-tratamiento. Individual valores k se calculó cuando se estudió la actividad barorecteptor.

Contribuciones de los autores

HCN: participó en el diseño del estudio, realizado algunos análisis estadístico, la adquisición de datos, análisis e interpretación de datos, participó en la redacción del manuscrito

NK: llevó a cabo la medición de nitrato

KC: participado en la redacción del manuscrito

GB: participó en el diseño del estudio, que participan en la redacción del manuscrito

AW: hizo contribución sustancial a la concepción y el diseño, el análisis y la interpretación de los datos, el análisis estadístico realizado, la adquisición de datos, la redacción del manuscrito

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final

Agradecimientos

La revisión crítica del manuscrito por el Dr Yrsa Bergmann Sverrisdottir es muy apreciada. Los autores se agradecen a la Sra Gunnel Andersson excelente para ayudar a la implantación de la sonda telemétrica. Este estudio fue apoyado por el Consejo de Investigación sueco (GB; 12580, KC; 14.231), el sueco Nacional del Corazón y Pulmón fundación (GB, KC), la memoria de Lars Hierta (AW), el Rey Gustaf V: s la Reina Victoria fundación (AW), la fundación Emelle (AW), el sueco Hypertension Society (AW, HN), la Sociedad Sueca de Medicina (AW), la fundación de Tore Nilsson para la Investigación Médica (AW), la fundación de Västra Götalands Regionen (KC), y la fundación de Eva y Oscar Ahrén (HN). El sueco Corazón y Pulmón fundación y SWEGENE contribuido a la posición post-doctoral de Anna Wickman.