Filaria Journal, 2005; 4: 11-11 (más artículos en esta revista)

Un método basado en citometría de flujo para el estudio de la embriogénesis y la reacción inmunitaria a las etapas en embriogénicas filarial parásitos

BioMed Central
Bikash Ranjan Sahu (bikash_sahu@rediffmail.com) [1], Alok Das Mohapatra (Aloklight@rediffmail.com) [1], Arindam Majumder (marindum@rediffmail.com) [1], Pradip K Das (dasp@cal2.vsnl . Net.in) [2], Balachandran Ravindran (balaravi@sancharnet.in) [1]
[1] Division of Immunology, Regional Medical Research Centre, Indian Council of Medical Research, Chandrasekarpur, Bhubaneswar, 751023, India
[2] Division of Microbiology, National Institute of Cholera and Enteric Diseases, Kolkata, 70000, India

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Resumen
Antecedentes

A falta de hosts intermedios animal, el proceso de embriogénesis conduce a la fecundidad de las mujeres adultas filarias es muy crítica para la persistencia de estos parásitos en humanos obliga a las comunidades. Embriogénesis en mujeres adultas filarial parásitos implica la fertilización de óvulos o espermatozoides y ovocitos por su posterior desarrollo en móviles microfilarias en el interior de la cavidad uterina de gusanos. Desarrollo de ensayos para la vigilancia de la embriogénesis en los gusanos de mujeres adultas es un requisito crítico en la investigación filariasis - filarias se sabe que el puerto de endosimbiontes como Wolbachia que desempeñar un papel importante en la fecundidad. Tetraciclina o doxiciclina trato de los anfitriones infectados elimina eficazmente los endosimbiontes resultante en la inhibición de la embriogénesis en femenino gusanos. Actualmente, la inhibición de la embriogénesis en adultos filarias sólo pueden ser controlados por el examen microscópico de in vitro cosechado intrauterino etapas.

Métodos

Filarias de mujeres adultas de las especies bovina filarial parásitos, Setaria digitata se obtuvieron de la peritoneo de los animales infectados y intrauterino etapas fueron cosechadas en medio de cultivo y se analizaron para adelante y de dispersión por parte flowcytometry utilizando una BD FACS Calibur. Las diferentes poblaciones se gated, ordenados e identificados por microscopía de fase. La unión de las lectinas a biotina feto etapas se vigila por medio de la etiqueta sistema Avidina FITC y supervisado por citometría de flujo con acceso de las poblaciones. Del mismo modo, la unión de anticuerpos humanos en suero a filarial intrauterino etapas se vigila por medio de la etiqueta FITC anti-inmunoglobulinas humanas.

Resultados

La parte con interés y de dispersión para intrauterino trazada 3 etapas distintas poblaciones etiquetados como R1, R2 y R3. Las tres poblaciones fueron ordenados y que se identificó a) totalmente extendidas microfilarias, b) primeras y c) las etapas finales de desarrollo de los huevos, respectivamente. Lectinas como Germen de Trigo crioaglutininas o Concanavalina-A se encontró que se fijan fuertemente a las etapas de huevo y menos prominente a intrauterinos microfilarias. De igual manera la unión de los anticuerpos en el suero filarial a las tres etapas intra-uterino también podría ser cuantificados con precisión.

Conclusión

El manuscrito informes de una novela basada en la utilización de citometría de flujo para controlar la progresión de la embriogénesis en adultos filarias. Aparte de la cuantificación relativa de las diferentes etapas de desarrollo intra uterino, el ensayo permite cuantitativos vinculantes de las lectinas y anticuerpos a cada una de las etapas intrauterino. Tal vez ahora sea posible cuantificar los niveles de anticuerpos en infectados y hosts inmune para controlar la fecundidad de lucha contra la inmunidad en la filariasis - el ensayo de este modo puede ser usado como una herramienta poderosa para el desarrollo de fármacos y en estudios inmunológicos en la filariasis humana y experimental.

Antecedentes

La filariasis linfática crónica debilitante causas hidrocele y / o linfedema en alrededor de 40 millones de personas en todo el mundo - cerca de 120 millones de personas se encuentran infectadas con el nematodos, alrededor del 90% con W.bancrofti y el resto con B.malayi, principalmente en los países tropicales. Las larvas infectantes (L3) de los mosquitos entrar en el mamífero hospedador, y convertirse en hombres y mujeres adultos en la etapa de parásitos linfáticos. Después del apareamiento la hembra adulta gusanos en libertad a miles de microfilarias (Mf) que entran a la circulación de la sangre para el futuro desarrollo de los mosquitos. A falta de hosts intermedios animal, el proceso de embriogénesis conduce a la fecundidad de mujeres adultas de los gusanos es muy crítica para la persistencia de estos parásitos en humanos obliga a las comunidades.

Morfológicamente, las diferentes etapas de desarrollo intrauterino son discernible en la cavidad uterina de la mujer adulta gusanos. Huevos o ovocitos con los espermatozoides después de la fecundación se transforman en móviles de microfilarias y son puestos en libertad por la mujer adulta gusanos [1]. Actualmente, no se dispone de herramientas para cuantificar las diferentes etapas de desarrollo de la embriogénesis que no sean aproximados de puntuación por microscopía [2, 3]. Desarrollo de los ensayos precisos para el seguimiento de mujeres adultas en la embriogénesis gusanos tienen el potencial para hacer frente a cuestiones cruciales en la investigación filariasis - filarias se sabe que el puerto de endosimbiontes como Wolbachia, que desempeñan un papel importante en la fecundidad de los adultos filarias [3, 4]. Tetraciclina o doxiciclina trato de los anfitriones infectados elimina eficazmente los endosimbiontes resultante en la inhibición de la embriogénesis en femenino gusanos [5]. La inhibición de la embriogénesis en humanos infectados puede ser anfitriones anotó sólo mediante la vigilancia de disminución de pérdidas de periféricos microfilaremia-linfático vivienda etapa parásitos adultos no son accesibles para su estudio. Sin embargo, en modelos animales experimentales de las mujeres adultas gusanos pueden ser cosechadas y disecados in vitro y las etapas intrauterino puede ser de aproximadamente anotado por microscopía [2, 3]. En esta comunicación se describe el método basado en citometría de flujo para el estudio de la embriogénesis en mujeres adultas filarias. La utilidad de este método para cuantificar unión de las lectinas y anticuerpos frente a las diferentes etapas del feto filarial parásitos también ha sido evaluada.

Métodos
Preparación de intrauterinos etapas para citometría de flujo

De mujeres adultas filarias, Setaria digitata se obtuvieron de la peritoneo del ganado en un matadero cerca de estéril alfa - MEM con 1% de glucosa, penicilina-100 unidades / ml, estreptomicina-100 μ g / ml gentamicina-50 μ g / ml y anfotericina - B 2,5 μ g / ml y se transportan al laboratorio y se utiliza en el mismo día. Individual gusanos adoptadas en un petridish fueron lavados tres veces (x3), en medio estéril y disecados en trozos pequeños de unos 5 ml de medio y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. Las grandes piezas fueron removidas y soporte de intrauterinos etapas han sido recolectados, lavados en el MEM y final pellet de células en suspensión en 1 ml de fluido de vaina y analizados utilizando un flowcytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson, EE.UU.), utilizando el software Cell Pro Quest . Los datos (5000 eventos) fueron adquiridos para adelante y lado de dispersión usando los siguientes valores: FSC, de tensión y de la cooperación Sur-Sur E00, voltaje 340. Las tres poblaciones fueron ordenados y con acceso mediante un clasificador FACS moderada bajo la configuración de la fidelidad. Las suspensiones ordenadas fueron centrifugadas a microscópicas diapositivas utilizando un cytospin y observado bajo un microscopio de contraste de fases para la identificación de organismos en el fraccionamiento poblaciones.

Colección de sangre para sueros de los casos humanos de la filariasis

La sangre de los sueros fueron obtenidos de pacientes con enfermedad crónica de la filariasis (elefantiasis / hidrocele) y portadores de microfilarias filariasis Bhubaneswar cerca de las zonas endémicas, tal como se describe anteriormente por nosotros [6]. Sera almacenados a -20 ° C se diluyeron en PBS con 1% de BSA y se utiliza para atar a intrauterinos etapas como se describe más arriba.

Preparación de los sueros inmunes contra intrauterino etapas

Cinco Mastomys coucha fueron inmunizados con tres dosis (15 días aparte), de las etapas intrauterinos (50000 células por dosis) en adyuvante completo de Freund y sueros de la sangre se recogió entre los días 40-45 y la prueba de anticuerpos de reactividad a intrauterino etapas como se describe más arriba .

Purificación de microfilarias circulantes de sangre infectada

Microfilarias (Mf) de la sangre humana se purificaron utilizando 5 μ M poro membranas de policarbonato, tal como se describe anteriormente por nosotros [6]. Nocturna muestras de sangre recogidas de W.bancrofti infectados o portadores Mf el día muestras de sangre de animales infectados S.digitata se utilizaron para la purificación - Mf lavados en buffer Tris-EDTA se tomaron en vaina fluido y analizadas por citometría de flujo para adelante y como parte de dispersión Se ha descrito anteriormente.

Lectina vinculante ensayo

La suspensión (500 μ l), que contiene alrededor de 10000 intra uterino en etapas 7,2 PBS con 1% de BSA se mezclaron con 500 μ l de 4 μ g / ml o 1 μ g / ml de biotina de Ventajas de Windows Original (L-5142, Sigma Chemical Co, EE.UU.). Simlarly dos diluciones, 500 o 2000 veces diluida con biotina Con-A (BA-16, Genie Bangalore, India) se han utilizado y las suspensiones se incubaron a RT de 45 min. Las células fueron lavadas en PBS y x3 adoptadas en 0,5 ml de PBS con 1% de BSA a los que 0,5 ml de 250 veces diluido sistema Avidina - FITC (S-3762, Sigma Chemical Co, EE.UU.) y se añadió incubadas durante 30 min a TA . La suspensión se lavan de nuevo tres veces en PBS y las muestras tomadas en 1 ml de fluido de vaina y 5000 se adquirieron los acontecimientos. Las tres poblaciones fueron gated intensidad de fluorescencia y se lee mediante un láser de 488 nm. El porcentaje de reactividad de las lectinas en comparación con el sistema Avidina-FITC controles se calculó utilizando el software CellQuest Pro.

Unión de los anticuerpos de ensayo

La suspensión (500 μ l), que contiene alrededor de 10000 UI etapas en PBS-BSA se mezclaron con 500 μ l de 50 veces diluido o Mastomys sueros humanos (normal, así como los animales vacunados) y se incuba a RT de 45 min. Las células fueron lavadas x3 y tomado en 0,5 ml de PBS-BSA a los que 0,5 ml de 250 veces diluido etiquetados FITC anti-inmunoglobulina humana (F-6506, Sigma Chemical Co.USA) o 50 veces diluido FITC etiquetados IgG anti-ratón Se añadió y se incubaron durante 30 min a TA. La suspensión se lavan en PBS x3 y organismos se tomaron en 1 ml de fluido de vaina para la adquisición de los acontecimientos de 5000 FACS Calibur. Las tres poblaciones fueron gated intensidad de fluorescencia y se lee mediante un láser de 488 nm. El porcentaje de reactividad, así como la intensidad media de fluorescencia se calcularon para unión de los anticuerpos y en comparación con FITC etiquetados segundo anticuerpo conjugado controles utilizando software CellQuest Pro.

Resultados
Adelante y lateral de dispersión y la identidad de las etapas

Figs 1a y 1c muestran el punto de parcelas intrauterino etapas en adelante y los lados por dos representante de dispersión gusanos adultos; respectivos mapas se muestra en la Fig 1b y 1d. Tres distintas poblaciones de organismos, R1, R2, y R3 podría ser identificados. Las tres poblaciones se encuentran constantemente en varios gusanos, aunque el número relativo de dispersión en cada varió entre gusanos como se muestra en la Fig 1. Mf purificado de S.digitata y W.bancrofti (de la sangre) mediante el uso de membranas de filtración nucleopore dispersos R1 exclusivamente en la región lo que indica que los organismos de esta región son microfilarias (Fig 2a y 2b respectivamente). Los organismos de dispersión en los tres grupos fueron purificados por la clasificación en una FACS Calibur clasificador y examinó bajo un microscopio de contraste de fases: Figs 10 y 11 muestran organismos en la población sin clasificar que contienen una mezcla de principios y finales de etapas de desarrollo de los huevos, así como Mf totalmente extendidas, mientras que la Fig 12 y 13 revelan pura Mf de S.digitata ordenados R1 en la población de confirmar los datos presentados en el gráfico 2a y 2b. R2 organismos en la puerta se encontraron primeras etapas de desarrollo de los huevos (figura 8], mientras que las fases finales de desarrollo se encuentra en la población R3 (Fig. 9].

Lectina vinculante a intrauterinos etapas

Dos lectinas, Germen de Trigo Agglutinin (WGA) y Conconavalin-A (Con-A), que reaccionan específicamente principalmente con N-acetil-D-glucosamina y D-manosa residuos respectivamente (que están presentes en varios parásitos doquier la filarial incluyendo parásitos), fueron Elegido como marcadores en este estudio para evaluar la citometría de flujo basado procedimiento de ensayo. El intrauterino etapas incubadas con biotina de Ventajas de Windows Original o Con-A se analizaron por fluorescencia utilizando solo color láser de 488 nm en los tres barrios privados población. Los antecedentes de reacción y media de fluorescencia reactividad de avidina-FITC (controles) para las tres poblaciones con acceso fue mínimo. La específica unión de Ventajas de Windows Original a las tres poblaciones se muestra en la Fig 7 bis-f. Hubo una dosis dependiente vinculante de Ventajas de Windows Original a intrauterinos etapas - Fig 7d concentraciones más bajas, e & 7f], vinculado proporcionalmente menos de concentraciones más altas, como se muestra en histogramas en la Fig (7 bis, b & 7c]. De igual manera una dosis dependiente vinculante de la Con-A de las etapas intrauterino también puede ser demostrado (Fig 3 bis-f]. Tanto las lectinas obligado significativa (> 95%) a principios y finales de etapas de desarrollo de los huevos (R2 y R3, respectivamente) - su reactividad a intrauterinos Mf (R1) fue, sin embargo, no es elevado.

Unión de los anticuerpos a la intra-uterino etapas

La unión de anticuerpos en humanos y en Bancroftian filariasis S.digitata Mastomys suero inmune a las etapas del desarrollo intrauterino podría estudiar también. Los resultados de un solo color de fluorescencia utilizando láser de 488 nm en las tres poblaciones con acceso en dos Mastomys sueros se muestran en la figura 4. Los antecedentes vinculantes de IgG anti-ratón-FITC conjugado con acceso a las tres poblaciones R1, R2, y R3 era muy mínima. El perfil vinculante de la validez de los sueros inmunes fueron similares a los controles mientras que el conjugado importante unión de los anticuerpos a los huevos intrauterino (R2 y R3 poblaciones) se pudo demostrar en el suero inmune (Fig 4 bis-f], además, la reacción fue similar se muestra en Otros tres Mastomys suero inmune también (datos no presentados). La unión de anticuerpos humanos en suero a la filariasis etapas intrauterino también puede ser mostrado por el ensayo. El ensayo de dos sueros elefantiasis de los casos se muestra en la Fig 5a-f. Importante unión de los anticuerpos a intrauterino etapas, en particular a las etapas de huevo se pudo demostrar.

Aunque los anticuerpos humanos en suero no se unen así a intrauterinos Mf, muy importante unión de los anticuerpos a seleccionar una pequeña población de Mf es demostrable por el ensayo (Fig. 5a y 5d]. La media de los niveles de anticuerpos en nueve pacientes con filariasis crónica se cuantificaron (fig. 6]. Los niveles se expresaron como porcentaje de reactividad y la media geométrica de la intensidad de fluorescencia, como se muestra en la Fig 6a y 6b, respectivamente. El anticuerpo y lectina vinculante en este estudio se limita principalmente a la reactividad de estas moléculas a la superficie de intrauterinos etapas en directo desde las etapas fresca obtenida de gusanos de mujeres adultas se utilizaron para los análisis. Fijación con formaldehído y permeabilising células resultó en la unión de los anticuerpos a los componentes intracelulares también (datos no presentados).

Discusión

Embriogénesis es central para la biología de helmintos y podría ser un eficaz objetivo de la elaboración de estrategias de intervención para bloquear la transmisión de helmintos parásitos de mamíferos anfitriones. Inmunológica en estudios humanos, así como la filariasis experimental, en gran medida han sido dirigidas a las respuestas de acogida contra larvas, adultos y microfilarias etapa parásitos [7, 8]. Sin embargo, muy pocos estudios se han ocupado de los antígenos expresados en / sobre la etapa intrauterina en desarrollo [9]. Consideramos que la falta de disponibilidad de los ensayos sensibles de realizar estudios sobre las respuestas de anticuerpos a intrauterino etapas como una de las razones de esos un número limitado de estudios. El gran tamaño de las etapas intrauterino (alrededor de 50 μ M en las fases de huevo y cerca de 160 μ M en Mf) no limitan la aplicabilidad de este ensayo, ya que no novela especial en la modificación flowcytometer se requiere, las dimensiones estándar de flowcell facilitada por los fabricantes en FACSCalibur Modelo fue suficiente para llevar a cabo los ensayos. Prevemos una amplia aplicación para este nuevo flowcytometry método basado en la vigilancia de la embriogénesis, así como unión de los anticuerpos a intrauterinos etapas de la filariasis de investigación: a) eliminación de los endosimbiontes en humanos anfitriones por doxiciclina requiere de la administración de drogas durante un período de varias semanas (5), y hay una necesidad para el desarrollo de nuevos fármacos anti-rickettsias para bloquear la embriogénesis / fecundidad en adultos filarias; el nuevo método descrito en esta comunicación puede ser efectivamente utilizado para la detección de un gran número de posibles compuestos / drogas, b), aunque Doxiciclina y la tetraciclina se han demostrado para eliminar endosimbiontes en adultos filarias, precisa la etapa intrauterina en la que se bloquea la embriogénesis no se conoce y puede ahora ser estudiada con este nuevo ensayo, c) citocinas como la IL-4 y las moléculas de inmunidad innata tales Como TLR-4 se ha demostrado que desempeñan un papel en la regulación de la producción experimental de la microfilaremia en hosts [4, 10]. Adultos filarias ahora pueden ser implantados en ratones deficientes realizados para la expresión de genes específicos de citoquinas o transgénicos para esas moléculas de acogida para supervisar su papel en la embriogénesis; d) filarial varios antígenos han sido clonado, secuenciado y expresado en los últimos años y algunos han sido utilizados como Putativo vacunas en modelos experimentales [11], e) de alta reactividad de anticuerpos en el suero humano filariasis seleccionar a una población de Mf (Fig. 5a y 5b] puede deberse a los antígenos expresados en polimórficos Mf vaina descrito por nosotros hace varios años (12 ). El novedoso procedimiento que se describe aquí podría ayudar en la clasificación selectiva de la población, tales reactiva Mf para el análisis genético de los antígenos filarial polimórficos. El efecto de la inducción de la respuesta inmune a esas moléculas recombinantes en la embriogénesis pueden ser estudiadas a través del ensayo descrito en esta comunicación, e) la filariasis en las comunidades humanas se presentan con una variedad de rasgos clínicos y parasitológicos. La infección se caracteriza por la presencia de distribuir Mf y / o antigenemia y enfermas temas mostrar aguda y / o crónica de las manifestaciones clínicas. Los estudios sobre la respuesta inmune de estos pacientes a las diferentes etapas de desarrollo a saber., Larvas, el parásito adulto y Mf han indicado diferencias significativas entre los grupos [resumen en el [7]]. El nuevo ensayo se informó en esta comunicación se puede esperar que ahora permiten la cuantificación de las respuestas de anticuerpos a diferentes intrauterinos etapas de filarial parásitos humanos en la filariasis. Los principios de la citometría de flujo se han utilizado recientemente para la separación y la vigilancia de la muerte / supervivencia de los nematodos C.elegans otro [13]. Tal vez ahora sea posible para estudiar la muerte celular programada de desarrollo intra-uterino en etapas filarial parásitos.

Un bovina filarial parásito S.digitata se ha utilizado para el establecimiento del nuevo sistema de ensayo en el estudio. El ensayo podría utilizarse también para microfilarias de W.bancrofti (purificado de los sujetos infectados endémicas). Sin embargo, es esencial para evaluar la utilidad de este método basado en flowcytometry para otros de uso más común filarial parásitos, a saber., Brugia malayi, Brugia pahangi, Dirofilaria immitis, etc Litomosoides sigmodontis

Conclusión

El manuscrito informes de una novela basada en la utilización de citometría de flujo para controlar la progresión de la embriogénesis en adultos filarias. Aparte de la cuantificación relativa de las diferentes etapas de desarrollo intra uterino, el ensayo permite cuantitativos vinculantes de las lectinas y anticuerpos a cada una de las etapas intrauterino. Tal vez ahora sea posible para controlar los niveles de anticuerpos en la infección, así como inmune a los anfitriones intrauterinos etapas de desarrollo que podría convertirse en un parámetro para la vigilancia de la inmunidad anti-fecundidad en la filariasis, el ensayo, por lo tanto, puede ser utilizado como una herramienta de gran alcance para el desarrollo de drogas Y en los estudios inmunológicos en la filariasis humana y experimental.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

BRS: Realización de la parte experimental de los trabajos, incluidos los ensayos usando flowcytometer, compilado los datos y escribió el proyecto de manuscrito.

ADM: Realización de la parte experimental de los trabajos, incluidos los ensayos usando flowcytometer, realizó la inmunorreactividad.

AM: Purificada las etapas utilizando el clasificador de flowcytometer, realizado cytospin y capturaron imágenes de contraste de fases para la población ordenados.

DCP: Participó en los experimentos que impliquen la utilización flowcytometer el clasificador y el uso de confocal y microscopía de contraste de fases

BR: Concebida la idea, diseñado experimentos, interpreta los datos y completó el manuscrito

Agradecimientos

El Centro Regional de Investigación Médica, Bhubaneswar cuenta con el apoyo de subvenciones del Consejo Indio de Investigación Médica, Nueva Delhi. Los autores gracias Prof Rick Maizels, Universidad de Edimburgo, Reino Unido, de la lectura crítica del manuscrito. BRS con el apoyo de un indo-alemán concesión de ICMR ADM cuenta con el apoyo y con un Junior de Becas de Investigación de la Universidad de Becas Comisión, de Nueva Delhi. Los autores gracias al Director del centro, Dr.SKKar de un apoyo sostenido.