Journal of Inflammation (London, England), 2005; 2: 13-13 (más artículos en esta revista)

Inversión de la colitis experimental en ratones la actividad de la enfermedad tras la administración de un IL-10 adenoviral vector

BioMed Central
Makoto Sasaki (msasaki@lsuhsc.edu) [1], Michael J Mathis (jmathi@lsuhsc.edu) [2], Merilyn H Jennings (mjenni@lsuhsc.edu) [1], Paul Jordania (pjorda1@lsuhsc.edu) [3], Yuping Wang (ywang1@lsuhsc.edu) [4], Tomoaki Ando (tando@lsuhsc.edu) [1], Takashi Joh (jalexa@lsuhsc.edu) [5], J Steven Alexander (jalexa @ lsuhsc . Edu) [1]
[1] Department of Molecular and Cellular Physiology, LSU Health Sciences Center, Shreveport, LA, 71130-3932, USA
[2] Department of Cell Biology and Anatomy, LSU Health Sciences Center, Shreveport, LA, 71130-3932, USA
[3] Departamento de Gastroenterología, del Centro de Ciencias de la Salud LSU, Shreveport, LA, 71130-39322, EE.UU.
[4] Departamento de Obstetricia y Ginecología, Centro de Ciencias de la Salud LSU, Shreveport, LA, 71130-39322, EE.UU.
[5] Departamento de Medicina Interna y Bioregulation, Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences, Nagoya, Japón

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Resumen

Genéticos deficiencia en la expresión de la interleucina-10 (IL-10) se asocia con la aparición y progresión experimental de enfermedad inflamatoria intestinal (EII). La importancia clínica de la expresión de IL-10 es apoyada por estudios que muestran que el aumento de inmune-IL-10 previene la inflamación y daño de la mucosa en modelos animales de colitis y en la colitis humanos. La interleucina-10 (IL-10), un anti-inflamatorio endógeno y inmunomoduladora de citoquinas, se ha demostrado que la inflamación y prevenir algunas lesiones en animales y estudios clínicos, pero la eficacia de la IL-10 tratamiento sigue siendo insatisfactoria. Se encontró que la administración intra-peritoneal adenoviral de IL-10 en ratones revertir significativamente la colitis inducida por la administración de un 3% DSS (sulfato de dextrano), de un modelo común de la colitis. Adenoviral IL-10 (Ad-IL10) transfectadas ratones desarrollaron niveles elevados de IL-10 (394 + / - 136 pg / ml) dentro de la cavidad peritoneal, donde se expresó el adenovirus. Es importante destacar que, cuando se administra en el día 4 (después de la inducción de la colitis w / DSS), Ad-IL10 redujo significativamente la actividad de la enfermedad y la pérdida de peso y totalmente impedido histopatológico de las lesiones en el colon día 10. Mecánica, en comparación con el Ad-nulo y DSS ratones tratados, Ad-IL10 y DSS-ratones tratados eran capaces de reprimir la expresión de MAdCAM-1, una molécula de adhesión endotelial asociado a la EII. Nuestros resultados sugieren que la Ad-IL10 (adenoviral IL-10), la terapia genética del intestino o peritoneo puede ser útil en el tratamiento clínico de la EII, ya que se demostró que este vector puede invertir el curso de una inflamación del tubo digestivo y los marcadores de inflamación.

I. Introducción

Las moléculas de adhesión celular endotelial ( 'ECAMs') desempeñan papeles esenciales en el desarrollo de la inflamación crónica mediante la contratación de los glóbulos blancos, especialmente linfocitos, a los tejidos. ECAMs varias formas de apoyo a la adhesión de leucocitos incluyendo material rodante, firme adhesión y la extravasación [1]. Infiltración de los tejidos de leucocitos es una característica común de muchos estados inflamatorias crónicas que incluyen la enfermedades inflamatoria intestinal (EII), la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (CD). En la fijación de la EII, la expresión de ECAMs como ICAM-1, VCAM-1 y MAdCAM-1 se observó en modelos experimentales de colitis, y también en el colon inflamado humanos en la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa [2 - 6].

Entre las moléculas de adhesión hasta reguladas en la EII, MAdCAM-1, la molécula de adhesión de células mucosas, se piensa que es preeminente en el desarrollo de la inflamación crónica del tubo digestivo. MAdCAM-1 normalmente se expresa en el intestino, y su expresión es dramáticamente amplificadas durante la inflamación [2, 3]. La importancia funcional de la mayor aparición de MAdCAM-1 en la EII cuenta con el apoyo de varios informes que muestran que immunoneutralization de cualquiera de MAdCAM-1 o de su ligando, la integrina α4β7, atenuar la inflamación y daño de la mucosa en modelos animales de la colitis [7 - 9]. Sin embargo, como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra otros ECAMs, especialmente VCAM-1, y también puede reducir la actividad de la enfermedad en modelos de colitis, la literatura sugiere que MAdCAM-1 es probablemente necesario, pero no suficiente para la máxima penetrancia de experimentación clínica y, probablemente, también la EII [ 10 - 13].

Sobre la base de estos resultados, es evidente que una mejor comprensión de los mecanismos que regulan ECAM expresión, en especial la de MAdCAM-1, podrían ayudar a diseñar los tratamientos para la mejora de la colitis.

Se ha sugerido que la activación patológica de la mucosa del sistema inmunológico en respuesta a los antígenos es un factor clave en la patogénesis de la EII. Además, los cambios en la migración de leucocitos y la producción de citoquinas parecen contribuir a la perpetuación de la EII [14]. Sobre la base de los avances modernos, recombinante anti-citoquinas inflamatorias (es decir, la IL-10) el tratamiento que actualmente se está desarrollando para la colitis experimental y humana IBD. IL-10 producida por los macrófagos y monocitos parece limitar la inflamación crónica [15 - 17], a través de varios mecanismos, entre ellos la inhibición de la liberación de varios factores inflamatorios (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α, GM - MCA, GCSF), la supresión de los factores determinantes de la célula adhesivo (molécula MHC clase II, β7), y por el bloqueo de la inducción de ICAM-1 [18 - 24]. Por el contrario, IL-10 gene-knockout mice desarrollar una colitis crónica que es muy similar a la EII [25]. IL-10 de tratamiento pueden reducir la inflamación en varios modelos de la colitis y la EII humanos [26, 18 - 34]. Sin embargo, la eficacia clínica de la administración sistémica de IL-10 en pacientes con leve a moderada enfermedad de Crohn activa no ha sido tan eficaz como se esperaba [31 - 34]. Además, la eficacia de la administración de IL-10 en modelos de ratón colitis es variable y modelo específicos [35].

Hemos descrito previamente exógenos que IL-10 in vitro puede bloquear la expresión de MAdCAM-1 en respuesta al TNF-α, y atenúa la adhesión de los linfocitos a los ganglios linfáticos endotelio derivados en virtud de estimular las condiciones de citoquinas a través de la inhibición de NF-kB [36]. El propósito del presente estudio fue demostrar que la inducción de la expresión endotelial de IL-10 a través de un IL-10 de vectores de expresión atenúa MAdCAM-1 en respuesta a la expresión de TNF-α con optimismo y sugiere la posibilidad de que-de citoquinas Th2 orientados terapia génica en la EII .

II. Resultados
A. Medición de la concentración de IL-10 en los líquidos de lavado peritoneal de la transfectadas

A la pantalla de la eficacia de adenovirus mediada la producción de IL-10 en ratones transfectadas, que mide la concentración de IL-10 en el peritoneo en lavaged sin tratar, en adeno-'null los animales tratados y en adeno-IL-10 transfectadas ratones. No había humanos detectables de IL-10 en la señal no transfectadas lavado de fluidos (control), ni hubo ratón detectó IL-10 (datos no presentados). Sin embargo, el líquido de lavado adenoviral la IL-10 transfectadas ratones mostraron un gran y significativo aumento de la IL-10 la concentración (395 ± 136 pg / ml a las 48 h después de la IL-10 transfección de genes (Figura 1]. Es importante destacar que la IL - 10 no se detectó en las muestras de suero de estos ratones.

B. La reducción de la actividad de la enfermedad en adeno gen IL-10 transfectadas ratones

Una combinatoria índice de la enfermedad, o la enfermedad acticvity índice (DAI), que se define como heces de sangre, heces, y la pérdida de peso [37] se utilizó para analizar el beneficio terapéutico de genes adenoviral entrega. Hemos encontrado que, en comparación con adeno-nula o sin tratar ratones, la IL-10 adenoviral transfección después de la inducción de genes de la enfermedad clínica revertir el curso de la enfermedad inducida por DSS (Figura 2].

C. Órgano de cambio de peso en adeno gen de IL-10 en ratones transfectadas colitis

El efecto antiinflamatorio de adenoviral IL-10 la transferencia de genes de ratones fue analizado en la colitis experimental inducida por la alimentación oral de 3% de sulfato de dextrano (DSS, MW ~ 40-50 kD) en el transcurso de 10 días, y el peso corporal diario registrada . Alimentando el comportamiento no fue alterada (medido por el peso de los alimentos consumidos "pellets", los datos no presentados). Cambio de peso corporal en respuesta a DSS fue muy diferente a adeno-nulo en ratones días 8, 9 y 10, pero no diferente de adeno IL-10 animales tratados (Figura 3], en consonancia con el rescate progresivo de peso observado en los ratones no tratados.

D. Colón acortamiento en el Departamento de Servicios Sociales y la colitis adenoviral IL-10

Animales alimentados DSS presentó acortamiento de colon en comparación con los controles, un efecto que fue eliminado por adenoviral IL-10 la transferencia de genes (Figura 4].

E. Adenoviral IL-10 reduce significativamente histopatología Resultado DSS en la colitis

Tal vez el más notable hallazgo de este estudio es la histopatológico adeno-efecto de la IL-10 en gut histopatología. Los animales que habían recibido adenoviral vector IL-10 mostró que virtualmente no hay pruebas de que se haya inflamación (Figura 5c], aunque adeno-null animales mostraron lesiones importantes en respuesta a DSS (Figura 5b], en comparación con los controles (Figura 5a]. Curiosamente, el nivel de inflamación medido en histopatológicamente adenoviral IL-10 ratones tratados dado DSS fue inferior a la que realmente mide de controles y puede sugerir que en el intestino normal, es persistente, el bajo nivel basal de la inflamación, que es normal, pero que Esta leve inflamación puede ser suprimido por la administración de suplementos adicionales con citocinas Th2 por ejemplo, la IL-10 (Figura 6].

F. Inmunohistoquímica para MAdCAM-1

Tinción de colon secciones de la presencia de MAdCAM-1 mostraron ocasionales manchas de control de tratados en las secciones. En los ratones tratados nula adenovirus receptor DSS, colon secciones muestran una fuerte y evidente aumento de MAdCAM-1 tinción positiva (indicado con flechas blancas en la figura 7b] respecto de los controles (Figura 7], que no se observa en adeno-IL-10 / DSS muestras tratadas (Figura 7c]. Análisis de la imagen revela un gran y significativo aumento de la tinción de los vasos de 40.33 + / - 2,79 (n = 38) en los controles a 399 + / - 58,5 (n = 49), lo que se redujo significativamente por el tratamiento con adeno-IL-10 (79,4 + / - 22,8, n = 12) (p <0,05, prueba Dunnetts).

III. Discusión

Experimental colitis producidas por el Departamento de Servicios Sociales, se piensa que comparten muchas características importantes con las formas humanas de la enfermedad inflamatoria intestinal. Anteriormente hemos demostrado que una preventiva inducción de la interleucina-10 (utilizando un vector de expresión basado en el plásmido) dentro de las células endoteliales atenuar de manera significativa la expresión de MAdCAM-1, un importante determinante adhesivo que contribuye al desarrollo humano de la EII, en respuesta A TNF-a [38]. Estos efectos pueden ser debido a la mayor barrera función endotelial [39], o a los efectos sobre las moléculas de adhesión, por ejemplo MAdCAM-1 y otras moléculas de adhesión endoteliales [4]. Esto es aún más el apoyo de los estudios in vivo en los que los animales genéticamente deficientes en IL-10 con colitis espontánea desarrollar muchas de las características de la EII humana y los estudios clínicos en que la IL-10 ha mostrado algún beneficio en el tratamiento de la EII humanos [40].

Aunque muchos tratamientos experimentales han demostrado ser efectivo en la prevención de la inducción de la colitis experimental, que ha supuesto, resulta más difícil reducir el nivel existente de la enfermedad inflamatoria intestinal, ya que el proceso de la enfermedad puede ser muy complejo y difícil de controlar mediante la modificación de una Único mediador. Sin embargo, los modelos que pueden demostrar atenuación efectiva de las enfermedades existentes pueden proporcionar los más relevantes e importantes modelos de cómo las enfermedades humanas pueden ser tratados [41].

Nos mostró que un IL-10 adenoviral vector de expresión es capaz de producir niveles muy elevados de IL-10 en el compartimiento peritoneal, la mayor parte de lo que parece a permanecer limitada a la cavidad peritoneal, ya que la IL-10 no se detecta en el plasma o suero Muestras siguientes adenoviral transfección. Expresión de MAdCAM-1 se ha observado también en el cerebro, y en el corazón; sobre la base de estas conclusiones, se ha sugerido que MAdCAM-1 podría desempeñar funciones en la inflamación crónica de estos órganos y [42, 43].

En condiciones normales de la biología y en especial durante la enfermedad inflamatoria intestinal activa, MAdCAM-1 puede ser esencial para el realojamiento de linfocitos al tejido linfoide asociado mucosa (MALT) [5, 44]. Desde MAdCAM-1 normalmente se expresa principalmente en el intestino microvasculatura, y se amplifican de manera espectacular durante la EII, se ha sugerido que el aumento de expresión MAdCAM-1 contribuye a la etiología de la EII a través de su capacidad para dirigir homing de los linfocitos al intestino. Esta noción es así el apoyo de varios informes que muestran que los anticuerpos dirigidos contra cualquiera de MAdCAM-1, o de sus linfocitos ligando, la integrina α4β7, varias atenuar de manera significativa los índices de daño intestinal en modelos experimentales de colitis [8, 46]. Además, los estudios clínicos realizados por Feagan et. Al (2005) indican que un anticuerpo humanizado contra α4β7, un importante MAdCAM-1 ligando administrados a los pacientes con colitis ulcerosa activa, de manera efectiva la reducción de la severidad de la enfermedad en comparación con los pacientes que recibieron el placebo [47].

Varios estudios han indicado que T helper (Th1) respuestas inmunes tienen un papel importante en el desarrollo de la EII [48 - 50]. Además, la desregulación de las redes de citoquinas Th1 participa en la respuesta inmune-dominante en la EII. Entre las citoquinas Th1, TNF-α se piensa que es tal vez la más importante de citoquinas responsables de la conducción de la aparición y evolución de la EII. Debido a esta función primordial de TNF-α en la EII, anti-TNF-α terapia de anticuerpos ha sido muy utilizado con éxito en la EII para reducir las lesiones de colon y de expresión de la EII ECAMs en [51].

IL-10, una citoquina producida por los macrófagos activados y Th2-células T tipo, ha crucial efectos inhibitorios sobre el tipo Th-1 respuesta inmune, así como en la presentación de antígeno-función de los monocitos y macrófagos [15, 16]. IL-10 parece desempeñar un papel importante en la prevención de la aparición de la EII, ya que los animales deficientes en IL-10 desarrollar colitis espontánea, y los bajos niveles de IL-10 se correlacionaron positivamente con recidivas de la enfermedad de Crohn [25, 52]. Sin embargo, a diferencia de TNF-α terapias, la administración de IL-10 recombinante (rIL-10) muestra escasa eficacia. Esto puede reflejar el hecho de que el TNF-α terapias de EII tienen por objeto de manera eficiente la limpieza de TNF-α, mientras que la IL-10 debe aumentar terapias IL-10 y IL-10 recombinante es probablemente demasiado rápidamente retiradas de la circulación después de la administración in vivo para producir Una protección uniforme [53]. Por otra parte, la IL-10 genes transferencia de tecnología ha sido utilizada con éxito en algunos modelos de colitis, sin embargo, su eficacia es variable. Una de las razones de esta variabilidad puede ser que el final de IL-10 en suero concentración de la transfección de genes de ratones está por debajo del umbral mínimo necesario para la protección de intestino [53, 54]. Por lo tanto la orientación del gen de IL-10 a la inflamación del colon o de su compartimento idealmente deberían explotar los tejidos (es decir, gut) específicos de los promotores a los órganos de control selectivo de la tecnología de la transferencia de genes, promotores específicos endoteliales y también de órganos específicos de la inyección intra-arterial de vector para activar algunos genes En lugares específicos [55].

La administración de IL-10 in vitro evita que el TNF-α estimula la expresión de MAdCAM-1 y también bloquea la adhesión de los linfocitos a las células endoteliales en el mismo nivel que el tratamiento dexametasona, en la actualidad un elemento clave en la terapia EII [36]. Si bien se ha demostrado anteriormente que la entrega de la IL-10 para el endotelio in vitro es de protección contra el TNF-α [36], in vivo administración de IL-10 puede ser menos eficaz [33]. Por lo tanto los métodos como endoteliales transfección in vivo de genes efectivamente pueden mantener las concentraciones de IL-10 en la superficie endotelial para lograr finalmente no obtuvo protección por vía intravenosa con la administración de IL-10.

El índice más importante de la eficacia de la mediación gen recombinante de IL-10 en la ejecución de la EII es la inhibición efectiva de los linfocitos-interacción mediada por endotelio MAdCAM-1. En este experimento, la inducción de IL-10 en el endotelio bloqueado eficazmente inducida por TNF-α MAdCAM-1 y expresión α4β7 dependientes de la adhesión de linfocitos SVEC sobre las células endoteliales. Aunque no hemos utilizado tejidos específicos de los promotores, su uso podría permitir incluso mayor órgano selectivo transgén entrega.

Los resultados indican que, linfática o intestino endotelial transfección con citocinas Th2 como la IL-10 puede ser un método eficaz para reducir los síntomas asociados importantes con EII.

IV. Experimental procedimientos
A. Adenoviral IL-10 la transferencia de genes
B. Evaluación clínica de la colitis

Los ratones fueron C57B6 ratones, los hombres que se obtuvieron a los 6-8 semanas de edad, y se utiliza en 8-10 semanas de edad, con un peso promedio de 23 g al comienzo de los experimentos. Los animales fueron alimentados ya sea el agua o el 3% DSS que se describió anteriormente, [56]. En todos los animales, el peso, de sangre en las heces, presencia de sangre y heces bruto coherencia se determinará diariamente a lo descrito previamente [37]. Índice de actividad de la enfermedad (DAI) fue determinada por la combinación de resultados de a) la pérdida de peso b) las heces y la coherencia c) sangrado (dividido por 3). Cada puntuación se determinará de la siguiente manera, el cambio en el peso (0: <1%, 1: 1-5%, 2: 5-10%, 4:> 15%), sangre en las heces (0: negativo, 2: positivo ) O hemorragia en cifras brutas (4), de heces y de la coherencia (0: normal, 2: heces blandas, 4: diarrea) que se describió anteriormente [57]. Corporal, la pérdida se calcula como el porcentaje de diferencia entre el peso corporal y el peso corporal real en cualquier día en particular. Normalmente, en el Departamento de Servicios Sociales colitis animales perderán 10-15% del peso corporal en el transcurso de 10 días. La aparición de diarrea se define como el moco o materia fecal adherida a la piel anal. La presencia o ausencia de diarrea se puntuó como 1 ó 0, respectivamente, y la puntuación acumulada de diarrea se calculó mediante la adición de la puntuación de cada día y dividiendo por el número de días de exposición. La rectorragia fue definida como diarrea que contiene sangre visible / o moco bruto rectorragia y anotó como se describe para la diarrea. Se detectó sangre oculta usando el 'Coloscreen' (Helena Laboratories, Beaumont, TX). Al final de estos estudios, los ratones fueron anestesiados con altas dosis de ketamina / xylazina (200 ul / animal) con dióxido de carbono asfixia anteriores a la recogida de los tejidos.

C. MadCAM -1 inmunohistoquímica

3 mm secciones de tejido fueron congelados en el PTU y 15 compuestos que incluyen um congelados recogidos en las secciones 1% recubiertos de gelatina de diapositivas. Las secciones fueron incubadas en diluidos 1:100 primaria anti-ratón anticuerpos MAdCAM-1 en el 0,1% de leche en polvo en PBS por 12 h, lavar 3 × en este buffer, incubadas en 1:1000 cabra anti-rata Cy3 anticuerpo marcado por 1 h, 3 × lavada y luego montadas en Vectashield (Vectorlabs, Burlingame, CA). Las imágenes fueron analizadas para la tinción de los vasos (zona), utilizando la imagen de J paquete de software (NIH, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/].

E. análisis morfológicos

Los ratones fueron asesinados el día 10 del experimento, los órganos eran removidos y fijados en el 3,7% de fosfato tamponada formaldehído. Secciones de los dos puntos distal se cortan en trozos de 1 cm y luego incorporados en epon / aryldite (Ted Pella). General histológico evaluación y puntuación se llevó a cabo en las secciones teñidas mediante hematoxilina y eosina.

F. histológico de puntuación

Histológico de puntuación se realizó en operador ciego utilizando la normalización de las secciones histológicas sistema de puntos descrito por Cooper et al., Que se utiliza habitualmente para el puntaje histológico de la EII gravedad [57]. Una puntuación de 0 refleja epitelio normal, sin embotamiento, cripta apariencia normal, baja infiltración de monocitos, y la baja o ausente infiltración de neutrófilos. Tres secciones de serie de cinco a seis diferentes sitios de colon (que representan hasta 18 secciones por ratón) se examinaron a 200 × magnificación, la parte más afectada fue anotado, ulceración que se considera la peor lesión. Una puntuación de 1 indica la pérdida de las células epiteliales único, leve embotamiento del epitelio, la única de la infiltración de células inflamatorias criptas, leve infiltrado de neutrófilos y monocitos; un puntaje de 2 significa la pérdida de múltiples células epiteliales (de los parches), evidente aplanamiento de la epitelios , Cryptitis, y un moderado incremento de los neutrófilos y monocitos; un puntaje de 3 indica franca ulceración del epitelio cripta con abscesos y un notable aumento de los monocitos o neutrófilos.

G. Análisis estadístico

Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar. Los datos se analizaron mediante comparaciones múltiples. Probabilidad (P) de los valores <0,05 se consideró significativo.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Autor 1 (MS) llevó a cabo los estudios en animales, Autor 2 (JMM) preparó el adenovirus se utilizan en estos estudios. Autor 3 (MHJ) y 6 (TA) participaron en el procesamiento visual de muestra y análisis. Autores 4 (PJ) y 5 (YW) ayudó a concebir y diseñar los estudios en animales. Autor 7 (TJ), 5 (YW) y 8 (JSA) concebido y diseñado el estudio.

Agradecimientos

Los autores desean dar las gracias a Sra Nicole Walker por su excelente asistencia editorial con este manuscrito.