Microbial Cell Factories, 2005; 4: 30-30 (más artículos en esta revista)

Caracterización de la transferencia entre el metabolismo oxidativo y fermentativo crecimiento de Saccharomyces cerevisiae por 13 C comparativa análisis de flujo

BioMed Central
Oliver Frick (o.frick @ mx.uni-saarland.de) [1], Christoph Wittmann (c.wittmann @ mx.uni-saarland.de) [1]
[1] Instituto de Ingeniería Bioquímica, Universidad de Saarland, POB 151150, 66123 Saarbrücken, Alemania

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

Una de las propiedades más fascinantes de la biotecnología importante organismo Saccharomyces cerevisiae es su capacidad de realizar simultáneamente la respiración y la fermentación a altas tasa de crecimiento, incluso bajo condiciones aeróbicas plenamente. En el presente trabajo, este fenómeno llamado efecto Crabtree se ha investigado en detalle por 13 C comparativa análisis de flujo metabólico S. Cerevisiae bajo crecimiento puramente oxidativa, respiro-fermentativo y predominantemente fermentativa condiciones.

Resultados

El cambio de metabolismo oxidativo a fermentativa crecimiento ha ido acompañado de cambios complejos de flujo de carbono a lo largo de todo el metabolismo central. Esto implicó un flujo reorientación de la vía pentosa fosfato (PPP) hacia la glicolisis, un aumento del flujo a través de la piruvato carboxylase, las vías y fermentativa malic enzima, una disminución del flujo a través del ciclo TCA, y una relocalización parcial de alanina biosíntesis de la mitocondria a la Citosol. S. Cerevisiae exhibido un by-pass de piruvato deshidrogenasa en todos los regímenes fisiológicas. Durante oxidativo crecimiento este by-pass se proporciona principalmente a través de la piruvato descarboxilasa, acetaldehído deshidrogenasa, acetil-CoA sintasa y el transporte de acetil-CoA en la mitocondria. Durante esta ruta fermentativa de crecimiento, sin embargo, fue saturada debido a la limitada capacidad de la enzima. En estas condiciones, las células expuestas alto flujo de carbono a través de una cadena de reacciones de la piruvato carboxylase, el transportista oxaloacetate y malic enzima. Durante puramente oxidativa crecimiento del PPP es suficiente por sí sola por completo a la oferta de NADPH anabolismo. Durante la fermentación, sólo el 60% de la requerida NADPH.

Conclusión

Llegamos a la conclusión de que, a fin de superar la capacidad limitada de piruvato deshidrogenasa, S. Cerevisiae posee diferentes metabólicas-por los pasos de la canal de carbono en la mitocondria. Esto implica la conversión de piruvato citosólico ya sea en acetil CoA oxaloacetate o intercompartmental seguido por el transporte de estos metabolitos. Durante todo el crecimiento oxidativa NAD isoformas específicas de acetaldehído deshidrogenasa y isocitrate deshidrogenasa catalizar reacciones en el correspondiente S. Cerevisiae, mientras que la oferta en virtud de NADPH fermentativa condiciones supone contribución significativa de fuentes distintas del PPP, como por ejemplo, NADPH específicos o acetaldehído deshidrogenasa isocitrate deshidrogenasa.

Antecedentes

La incipiente levadura S. Cerevisiae es un organismo importante biotecnológicas, por ejemplo para la producción de etanol [1], proteínas recombinantes [2], los antibióticos [3] o la biomasa [4]. Además es relevante como sistema modelo para estudiar el metabolismo debido a su alto grado de homología con otros organismos eucarióticos [5, 6]. Esto explica el gran interés en la comprensión de la función metabólica y la regulación de este organismo. S. Cerevisiae es capaz de realizar simultáneamente la respiración y la fermentación a altas tasas de crecimiento, incluso bajo condiciones aeróbicas plenamente [7, 8]. Este fenómeno llamado efecto Crabtree se visualiza en chemostat cultura de la S. Cerevisiae por un cambio hacia la formación de la biomasa fermentativa productos en el aumento de las tasas de dilución [8]. También otras especies de levadura muestran este comportamiento [9]. A pesar de los numerosos estudios en el pasado [10 - 12], de forma clara y unívoca explicación de este fenómeno aún no ha sido siempre [13, 14]. El efecto Crabtree tiene consecuencias importantes para los procesos industriales destinados a la producción de biomasa de levadura, en donde la formación de los subproductos fermentativo es indeseable [15, 16]. Un potente método para investigar los sistemas metabólicos es de 13 C, el análisis de flujo metabólico que permite la cuantificación in vivo de la actividad de los trayectos y las reacciones [17 - 19]. En estudios recientes, que se llevó a la disposición espacial de las reacciones metabólicas en el citosol y la mitocondria compartimentos en cuenta, el análisis de flujo metabólico fue aplicado con éxito a S. Cerevisiae y relacionados con las cepas de levadura [20 - 27]. En el presente trabajo se investigó el cambio de metabolismo oxidativo a fermentativa crecimiento en S. Cerevisiae por la cuantificación de los flujos metabólicos a través de las reacciones en la central en el metabolismo de estos diferentes estados fisiológicos. Con este fin chemostat culturas con [1 - 13 C] glucosa como sustrato se cultivan en diferentes tasas de crecimiento en virtud de la glucosa aeróbica limitada a condiciones metabólicas e isotópicas de estado. El uso de un continuo presente, la cultura permite el ajuste preciso de la condición fisiológica de las células, es decir, la relativa actividad fermentativa de las vías.

Resultados
El crecimiento y formación de producto S. Cerevisiae

Con el fin de determinar la exacta condiciones experimentales necesarias para establecer el interés de los estados fisiológicos, chemostat culturas se llevaron a cabo en las distintas tasas de dilución entre 0,10 y 0,45 h -1 h -1 (Figura 2]. S. Cerevisiae exhibieron el comportamiento típico de crecimiento de este organismo en cultivo continuo, que se caracteriza por una transición de la puramente metabolismo oxidativo a baja tasa de crecimiento para el metabolismo fermentativo a alta tasa de crecimiento. En una tasa de crecimiento por debajo de μ = 0,20 h -1 el metabolismo de la S. Cerevisiae es puramente oxidativa, indicada por la ausencia de productos de la fermentación de biomasa y un alto rendimiento. A las tasas de crecimiento más altas el efecto era inducido Crabtree, que se muestra por una mayor formación de etanol y acetato. Por este medio, la contribución relativa de la fermentación para el aumento de la actividad metabólica con aumento de la tasa de crecimiento. En μ = 0,30 h -1 alrededor del 25% de la glucosa utilizada fue dirigida a la fermentación, lo que indica una todavía principalmente respirative metabolismo. Hacia mayores tasas de dilución de la fracción de glucosa fermentativa vías canalizadas en el aumento de hasta un valor de más de 50% a los de μ = 0,40 h -1.

Tracer experimentos con [1 - 13 C] glucosa como única fuente de carbono

Selección de cultivos con chemostat [1 - 13 C] glucosa como sustrato se llevaron a cabo para el esclarecimiento de los flujos metabólicos. Por este medio, tres distintas tasas de dilución, en representación puramente oxidativa-(0,15 h -1), mixto respiro-fermentativo (0,30 h -1), y principalmente el metabolismo fermentativo (0,40 h -1) fueron seleccionados para los estudios de flujo. El etanol resultante rendimiento en estas condiciones fue 0,0, 0,5, y 1,1 mol de etanol (mol glucosa) -1, respectivamente. El stoichiometric datos obtenidos de los 13 C culturas y de acuerdo con los correspondientes valores de la inicialmente realizada cultivos (Tabla 3]. Los principales son los subproductos de etanol, el acetato y glicerol. En todos los casos el balance de carbono fue casi cerrado subrayando la alta consistencia de los datos. Etiquetado de los patrones de aminoácidos de la proteína celular, analizó después del 5 de tiempos de residencia, se mantuvo constante en 4 muestras tomadas en intervalos de 1 h de la cultura, es decir, el error relativo de la masa isotopomer fracciones fue típicamente por debajo del 1%. Esto indica que las células se encuentran en estado de equilibrio isotópico. Para cuantificar los flujos metabólicos un 13 C, se aplicó el modelo de flujo que involucra metabolito y isotopomer equilibrio. El modelo utilizado considera plenamente características específicas del metabolismo subyacente, por ejemplo, reacciones bidireccional, en la etiqueta de codificación simétrica moléculas, 13 C incorporación de CO 2 o de los isótopos de origen natural [28]. Para cada escenario de un amplio conjunto de datos de 13 C etiquetado de datos (Tabla 4] y stoichiometric datos (Cuadros 2, 3] se utilizó para calcular los flujos.

Los flujos metabólicos

El flujo obtenido distribuciones de S. Cerevisiae creciente en diferentes estados fisiológicos se muestran en la Figura 3. Los flujos se ofrecen a valores relativos normalizado específico correspondiente a la tasa de captación de glucosa. El examinado S. Cerevisiae cepa reveló el típico comportamiento vinculado con el pasar de la respiración a la fermentación con el aumento de la tasa de crecimiento. Se trataba de una reorientación de flujo de la ACT hacia el ciclo fermentativo vías. Además de las anteriormente descritas, bien conocidos cambios, un número adicional de los flujos de la vía, sin embargo, afectados por el cambio del régimen fisiológicas.

Discusión

En el presente trabajo comparativo 13 C metabólicas análisis de flujo de S. Cerevisiae en diferentes estados fisiológicos definidos reveló que la transición de la oxidativo a fermentativa utilización de la glucosa, se refleja en importantes cambios en el flujo a lo largo de todo el metabolismo central de carbono. Las diferentes condiciones fisiológicas, es decir, puramente oxidativa, mixto respiro-fermentativo y principalmente crecimiento fermentativa fueron establecidos por la variación de la tasa de dilución en chemostat cultura. Por este medio, en la medida de la fermentación podría ser precisamente ajustada y ejecutar metabólicas e isotópicas en estado de equilibrio.

Hemos observado anteriormente descrito la transición de la respiración a la fermentación, como se indica por la reorientación del flujo de la ACT ciclo vías hacia la fermentación [8]. Se hace, sin embargo, claro en el presente estudio, que los cambios de la normativa vinculada a la transición metabólica no se limitaban a estas reacciones, pero afecta a un número adicional de las vías.

(I) El cambio metabólico tenido un fuerte efecto en el flujo de particionado entre glicolisis y PPP. Considerando que, a las puramente metabolismo oxidativo, el mayor flujo de carbono se canalizó en el PPP, lo contrario se observó para el metabolismo fermentativo. Los datos del presente trabajo, junto con anteriores estudios de flujo de S. Cerevisiae en diversas condiciones muestran claramente que el flujo de particionado entre glicolisis y PPP es la tasa de crecimiento dependiente (Figura 4A]. Una relación similar se encuentra para el flujo de particionado y el rendimiento de la biomasa. La reducción de la biomasa de rendimiento a altas tasas de crecimiento resulta en una reducción de la demanda de erythrose 4-fosfato, ribosa 5-fosfato y NADPH, respectivamente, que son todos suministrados por el PPP [45]. En el presente trabajo una cantidad importante de carbono es reciclado de los productos fitosanitarios en la glicolisis a través de la fructosa 6-fosfato y glyceraldehyde 3-fosfato por la reacción reversible de la PPP. Esto indica que la demanda de NADPH, pero no para los precursores de carbono, determinó el flujo hacia el PPP. Un examen detallado de la NADPH metabolismo se da a continuación. Anteriores estudios enzimáticos de S. Cerevisiae en la cultura chemostat reveló que la actividad in vitro, es decir, la capacidad, de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa aumentaron ligeramente con la tasa de dilución entre 0,1 y 0,4 h -1 h -1 [9]. La reducción del flujo PPP es, por lo tanto, no se debe a una falta de capacidad de la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa. En comparación con otros estudios de la relativa PPP flujo observado en virtud puramente oxidativa de crecimiento fue ligeramente superior [27]. Debido al hecho de que este flujo parámetro se podrá determinar con precisión relativamente alta (Cuadro 5], parece probable que las diferencias en las condiciones de cultivo o las cepas utilizadas son responsables de esto.

(Ii) piruvato descarboxilasa, la enzima clave del metabolismo fermentativo, se encontró que ya funcionan en una gran actividad en las condiciones en el que la fermentación alcohólica se ausente (Figura 3]. La importante cantidad de acetaldehído formado en estas condiciones es totalmente convertido en acetil CoA citosólico que es utilizada ya sea para anabolismo o transportadas en la mitocondria. Estos resultados refutan la percepción común de que sólo una pequeña fracción de piruvato se canaliza a través de la fermentativo by-pass a bajo flujo glicolítico [30], sino más bien apoyo especulaciones anteriores sobre los flujos de todo el piruvato nodo vinculado a la Crabtree efecto en S. Cerevisiae [7]. Con base en los perfiles de enzima, sustrato afinidades y piruvato nivel intracelular chemostat estudiado en el cultivo de S. Cerevisiae en variadas tasa de dilución se supone que previamente piruvato descarboxilasa podría ser activa incluso durante puramente metabolismo oxidativo conduce a la formación de acetil CoA citosólico y su transporte en la mitocondria. El aumento de piruvato nivel de crecimiento observado durante fermentativa [7] también podría ser una explicación para la reorientación de flujo observado mitocondrial a citosólicas alanina biosíntesis.

(Iii) Se encontró evidencia sustancial de la actividad in vivo de la enzima malic, como se informó anteriormente por S. Cerevisiae [29, 35]. Además podemos mostrar un fuerte aumento del flujo de malic enzima, cuando el pasado de las células de la oxidación puro metabolismo fermentativo. El flujo a través de la enzima malic aumento casi lineal con el aumento de la tasa de crecimiento (Figura 4C]. Aunque el presente trabajo y estudios anteriores difieren, por ejemplo, en relación con la cepa investigados, el valor de pH o de la condición de nutrientes, el flujo a través de malic enzima es alta en general, el aumento de la tasa de crecimiento. Como única excepción de un menor flujo de 7% se observó para malic enzima en un lote cultura de la S. Cerevisiae cultivadas en la glucosa [27]. Esto podría resultar de las mencionadas diferencias en la configuración experimental o general, la alta incertidumbre para la cuantificación de este parámetro de flujo (Tabla 5]. La función fisiológica exacta de la enzima en malic S. Cerevisiae hasta ahora había sido bastante intrigante [27]. También este estudio en realidad no proporcionan una visión de la satisfacción de la función de la enzima malic. Lo que por lo menos se puede afirmar que el flujo a través de malic enzima parece estar relacionada con el flujo a través de la piruvato carboxylase citosólicas y la oxaloacetate transportista. Se podría concluir que el aumento de la actividad de la enzima malic resultados indirectamente del flujo de redirección en el nodo citosólicas piruvato.

(Iv) Los flujos obtenidos permitir una inspección más detallada de la NADPH metabolismo durante el cambio metabólico. Por este medio, cabe señalar que el análisis realizado flujo no incluye un saldo de NADPH. Las reacciones a través de los flujos de abastecimiento de NADPH reacciones fueron determinadas sólo de la adecuación de los datos de etiquetado y el metabolito saldos que se detallan a continuación. Generalmente S. Cerevisiae pueden contratar diferentes enzimas para la formación de NADPH de la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y 6-phosphogluconate deshidrogenasa en el PPP [31], NADPH acetaldehído deshidrogenasa específicos [32], y NADPH deshidrogenasa isocitrate específicos [33]. También malic enzima es potencialmente capaz de suministrar NADPH [34]. Claras diferencias como resultado de las diferentes condiciones fisiológicas (Figura 5]. Se relaciona con la fuerte disminución de la producción de biomasa, la NADPH anabólicos disminuyó con el aumento de la demanda de la tasa de crecimiento. En cierta medida esto es atenuada por el mayor contenido de proteína S. Cerevisiae en la alta tasa de crecimiento y el proporcional aumento de la demanda stoichiometric NADPH (Tablas 1, 2]. Hemos encontrado, además, que las fuentes de NADPH variado con el estado fisiológico.

Durante puramente oxidativa crecimiento del PPP puede por sí sola cuenta de la demanda total de anabólicos NADPH. En estas condiciones adicionales NADPH suministro por otras reacciones, no parece necesario. Porque no intercompartmental sistema de transporte de NADPH que se ha descrito para S. Cerevisiae, es probable que también mitocondrial enzimas están involucradas en el suministro de NADPH. Un posible candidato es mitocondrial NADPH deshidrogenasa isocitrate específicos [33]. Esta enzima puede, sin embargo, representan sólo una fracción determinada del total del flujo a través del ciclo TCA. Un exclusivo de la actividad específica isocitrate NADPH deshidrogenasa pueden ser excluidos. Suponiendo que esta cantidad total de la NADPH suministrados sería casi dos veces mayor que la demanda anabólicos. Así llegamos a la conclusión de que en gran medida, a NADH mitocondrial específica isoenzimas de deshidrogenasa isocitrate contribuir a la ACT durante el ciclo de flujo oxidativo crecimiento de S. Cerevisiae.

Bajo predominantemente fermentativa utilización de la glucosa, sólo alrededor del 60% del total requerido NADPH fue proporcionada por el PPP. Esta es una indicación adicional de una fuente NADPH citosólico necesario durante el metabolismo fermentativo en S. Cerevisiae. S. Cerevisiae posee varias isoenzimas de acetaldehído deshidrogenasa con diferente especificidad de NADH y NADPH [35]. Posiblemente, la contribución relativa de las distintas isoenzimas con cambios en el conjunto de la fermentación, de manera que en vez de NADH principalmente bajo crecimiento oxidativo, también se forma NADPH. Recientemente se descubrió que especialmente NADPH dependiente acetaldehído deshidrogenasa isoformas participan en la fermentación anaeróbica de S. Cerevisiae [35]. El aumento de la formación de NADPH por acetaldehído deshidrogenasa probablemente conducirá a un aumento del nivel intracelular de NADPH, conocida para inhibir las enzimas PPP glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y 6-phosphogluconate deshidrogenasa [31]. La reducción del flujo PPP, por lo tanto, no sólo puede ser causado por la reducción de la demanda de anabólicos, sino también por la activación de vías alternativas para la NADPH citosólico de suministro.

(V) La idea de la limitación de las reacciones, que participan en el complejo flujo reorientación durante el cambio metabólico, puede ser absoluta derivada de los flujos de carbono. Como se puede calcular la relación de los flujos y la tasa de absorción específica de glucosa (Figura 3] la transición del metabolismo oxidativo a fermentativa en S. Cerevisiae fue acompañado de un más de 5 veces más específico de la captación de glucosa del flujo. Es interesante ver, cómo el aumento de la afluencia de carbono se distribuye en toda la red metabólica. El flujo de carbono absoluta de enzimas que intervienen en la fermentación y el transporte de citosólicas acetil CoA en la mitocondria se muestra en la Figura 6A. Piruvato descarboxilasa exhibe un enorme aumento de flujo con el aumento de la tasa de crecimiento. Un panorama completamente diferente resultados de las enzimas catalizar la posterior pasos metabólicos, es decir, acetaldehído deshidrogenasa, acetil CoA sintasa y el transportista. La absoluta del flujo de carbono a través de acetil CoA sintasa se mantuvo constante para todos los estados fisiológicos investigados. Es evidente que esta enzima trabaja ya al máximo de su capacidad durante el crecimiento puramente oxidativa. La saturación de acetil CoA sintasa obviamente iniciado la secreción de acetato en el medio con el aumento de la tasa de crecimiento. Además una fuerte disminución de la acetil CoA nivel intracelular parece muy probable. La insuficiente actividad de esta enzima también consecuencias para el transporte intercompartmental acetil CoA. Como puede observarse, la absoluta flujo de carbono a través del transportador disminuido prácticamente a cero (Figura 6A]. La acetil CoA citosólico fue, de hecho, completamente canalizadas en las reacciones anabólicas. Probablemente, la retirada de reacciones citosólicas acetil CoA en anabolismo son favorecidas por una mayor afinidad de las enzimas catalizar. La insuficiente capacidad de acetaldehído deshidrogenasa y acetil CoA sintasa podría incluso limitar la oferta de acetil CoA citosólico de anabolismo, es decir, la formación de lisina y de los lípidos. En este sentido una disminución significativa de la actividad in vitro, es decir, la capacidad, de acetaldehído deshidrogenasa y acetil CoA sintasa fue previamente observados en el metabolismo oxidativo a cambio de metabolismo fermentativo [9]. Se llegó a la conclusión de que, probablemente, estas enzimas mostrar la limitación de las medidas que causan la secreción de etanol y acetato de alta en la tasa de crecimiento. El presente estudio proporciona una prueba más de que en realidad estas reacciones son puntos clave en lo que respecta al aumento de la producción de etanol y acetato. El mismo principio se puede aplicar para estudiar las reacciones aguas abajo de la piscina piruvato (Figura 6B]. El flujo de carbono absoluta de piruvato deshidrogenasa fue baja puramente oxidativa bajo crecimiento, pero no mostró ningún aumento adicional superior a la tasa de crecimiento, a pesar de la entrada en el flujo de carbono citosólicas piruvato piscina, y por lo tanto potencialmente disponible, fue mucho mayor. Esto indica que el piruvato deshidrogenasa ya opera al máximo de su capacidad durante respiro-fermentativo crecimiento en μ = 0,3 h -1. El exceso de carbono entrar en la piscina citosólicas piruvato es obviamente dirigida hacia piruvato carboxylase y fermentación. Probablemente también la activación de la síntesis citosólica alanina está relacionado con este fenómeno. Piruvato deshidrogenasa por lo tanto, muestra un nuevo cuello de botella. La insuficiente capacidad de piruvato deshidrogenasa parece tener una influencia en el transporte de piruvato en la mitocondria. Debido al hecho de que, durante el crecimiento fermentativo, que una fracción importante de mitocondrial piruvato ya es suministrado a través de malic enzima, la absoluta flujo de carbono de la piruvato transporte es menor (Figura 6B]. La absoluta del flujo de carbono a través de la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa aumentaron alrededor de 1,5 veces la tasa de dilución, cuando se aumentó de 0,15 h -1 a 0,4 h -1. En un estudio anterior se demostró que, vinculados a la misma tasa de cambio de dilución, el nivel intracelular de esta enzima se aumentó alrededor de 1,6 veces [9]. Obviamente, ambos de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y NADPH nivel están involucrados en la regulación del flujo de carbono en el PPP. En caso de acetaldehído deshidrogenasa y acetil CoA sintasa el limitado flujo de carbono a alta tasa de dilución parece estar relacionada con una disminución en el nivel de enzimas [9]. Además efectos inhibitorios, por ejemplo, de acetaldehído en acetaldehído deshidrogenasa [9], podrían estar involucrados. El presente estudio sugiere que la reorientación del flujo, a causa de la reglamentación vinculada a la red Crabtree efecto, conduce a una saturación de la capacidad, es decir, el flujo absoluto, de acetaldehído deshidrogenasa, acetil CoA sintasa, y piruvato deshidrogenasa. Es la limitación de estas enzimas que se encargan principalmente de la aparición de la producción fermentativa de los subproductos durante el crecimiento de S. Cerevisiae en la alta tasa de crecimiento.

Conclusión

Resumiendo, los cambios de la normativa vinculada a la transición metabólicos afectan a una serie de vías a lo largo de todo el metabolismo central de S. Cerevisiae. Se sabe que la levadura se somete a la participación de los diversos cambios por ejemplo, cambio de los niveles de la enzima, la tolerancia al estrés, o la morfología, el metabolismo cuando cambia de respirative a fermentativa crecimiento. Estos cambios son controlados complejos sistemas de regulación transcripcional de control, así como control post-transcripcional [36]. Una de las principales señales importantes para la regulación del metabolismo de la levadura bajo diferentes condiciones de nutrientes es la concentración de glucosa [37]. Como se observa la concentración de glucosa en el medio de hecho se incrementaron con el aumento de la tasa de crecimiento (Figura 2]. La sobre-conjunto de la glucosa en la represión del sistema era probablemente la principal señal que ha provocado los cambios observados en los flujos de carbono intracelular. Esto incluye observar la disminución de flujo a través del ciclo TCA con el aumento de la tasa de crecimiento, que probablemente se debe a la represión directa de la ACT sobre el ciclo de los genes a nivel transcripcional por el sistema de represión de glucosa [38]. Del mismo modo, el fuerte aumento de la tasa específica la captación de glucosa y el flujo glicolítico que es probablemente un resultado directo de la inducción transcripcional de los genes correspondientes [39]. Los estudios recientes sobre los flujos de los niveles transcripcional y puso de manifiesto que varias de las vías intracelulares en el S. Cerevisiae es probablemente regulada en el nivel post-transcripcional [36]. Análisis de flujo metabólico sola en sí misma como realizado en el presente estudio no puede distinguir entre los cambios de flujo controlado directamente o indirectamente afectados por la regulación por ejemplo, de reacciones interconectadas. Sin embargo, parece como una herramienta valiosa para evaluar cuantitativamente los cambios metabólicos en gran detalle y para proporcionar datos importantes para una mejor comprensión del metabolismo de S. Cerevisiae.

Métodos
Organismo y cultivo

S. cerevisiae ATCC 32167 se adquirió de la American Type Culture Collection y Strain (Manassas, EE.UU.). El mineral medio utilizado para el cultivo que figura 2 g / L de glucosa, 0,5 g / L (NH 4) 2 HPO 4, 1,0 g / L (NH 4) 2 SO 4, 0,05 g / L MgSO 4 7 H 2 O, 0,025 G / L de ácido cítrico, 0,5 g / L KCl, 0,03 g / L CaCl 2 2 H 2 O, 3 mg / L FeCl 3 6 H 2 O, 2,1 mg / L MnSO 4 H 2 O, 1,8 mg / L ZnSO 4 7 H 2 O, 0,5 mg / L CuSO 4 5 H 2 O, 60,3 mg / L de myo-inositol, 30 mg / L de Ca-panthotenate, 6 mg / L de tiamina HCl, 1,5 mg / L piridoxina HCl, 0,03 mg / L de biotina, y 50 mmol / L de fosfato buffer (pH 6.2). Todas las sustancias químicas fueron de grado analítico y adquirido a Fluka (Buchs, Suiza), Merck (Darmstadt, Alemania), o de Sigma (St. Louis, EE.UU.). En los estudios de seguimiento normal de la glucosa fue sustituido por un igual concentración molar de 99% [1 - 13 C] glucosa (Campro, Veenendal, Países Bajos). Cultivos se realizaron en un bioreactor operado continuamente (Meredos, Bovenden, Alemania) con una cultura volumen de 100 ml a 30 ° C y 500 rpm. La tasa de aireación se mantuvo en 100 mL / min por un controlador de flujo de masa (WMR Compact 4, Brooks Instruments, Veenendal, Países Bajos). Composición de los conductos de admisión y escape de gas se determina en línea por medio de la espectrometría de masas, tal como se describe anteriormente [40]. Para la cuantificación de flujo de la cultura fue operado con el trazador sustrato de residencia durante cinco veces, incluyendo la verificación en línea mediante una constante concentración de CO 2 en los gases de escape, a fin de que metabólicas e isotópicas de estado podría asumir. Las muestras fueron tomadas luego de la toma de corriente continua de los reactores y cosechada a 4 ° C. Sobrenadante, obtenido por centrifugación (16000 g, 5 min, Biofuge Pico, Heraeus, Hanau, Alemania), se utilizó para el análisis de metabolitos extracelulares. El pellet de células se utiliza para la 13 C etiquetado análisis por GC-MS.

Análisis de la biomasa y metabolitos extracelulares

Densidad óptica (OD 660) se midió a 660 nm (Novaspec II, Pharmacia, Freiburg, Alemania). Célula de masa seca (MDL) se determinó gravimétricamente después de dos veces el lavado, centrifugación (10 min, 4 ° C, 3940 g; Labofuge 400 R, Heraeus, Hanau, Alemania), y el secado a 80 ° C hasta peso constante. Una relación lineal de OD 660 = 0,52 [MDL g / L] se obtuvo. Enzimática de los kits de prueba se utiliza para la cuantificación de glucosa, glicerol, acetato (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y el etanol (Sigma Diagnostics, St Louis, EE.UU.) en el sobrenadante. Las concentraciones de 2-oxoglutarate, piruvato, succinate, fumarato y en el sobrenadante se analizaron por HPLC [40]. Composición de aminoácidos de la proteína celular de S. Cerevisiae se cuantificó por HPLC [41] después de la hidrólisis con 6 M HCl durante 24 horas a 105 ° C. La media del error relativo de la stoichiometric mediciones, es decir, la cuantificación de los coeficientes de rendimiento, fue del 3,7% (rendimiento de la biomasa), 4,0% (rendimiento de etanol), el 9,3% (acetato de rendimiento) y el 11,3% (glicerol rendimiento).

GC-MS análisis de aminoácidos proteinogenic

Medición de patrones de aminoácidos de etiquetado de hidrolizado de células se llevó a cabo por GC-MS en el modo de vigilancia selectiva de iones [42]. Por una serie de grupos de iones isotopomer todas las fracciones de masa de los no etiquetados (x 0) a la 13 C plenamente etiquetados (x n) la variante podría ser medida con buena intensidad de la señal y la precisión (Cuadro 4]. En consecuencia, un amplio conjunto de datos está disponible para el cálculo de los flujos metabólicos. El error de la medición relativa de una masa de la fracción isotopomer cuatro repeticiones en cada dilución tasa fue generalmente por debajo del 1%. Cabe mencionar que algunos aminoácidos no puede ser considerado para el cálculo de flujo. Se trata de triptófano, metionina, histidina y cisteína, que no dieron adecuado GC / MS señales, prolina, que exhibió isobárica de superposición, leucina e isoleucina y ambigua con la fragmentación de las vías debido a la similitud de las cadenas laterales de aminoácidos y el agente de derivatización.

Metabólicas red de S. Cerevisiae

La red metabólica de S. Cerevisiae, que comprende las principales rutas del metabolismo central de carbono (PPP, glicolisis, fermentativa vías, ciclo TCA, y anaplerosis) se muestra en la Figura 1. Como se observa, citosol y mitocondria son consideradas como compartimentos separados. El modelo consta de piscinas separadas para piruvato, y oxaloacetate acetil CoA en cada uno de los dos compartimentos, respectivamente. Anaplerotic carboxilación de piruvato se encuentra en el citosol [43]. El malic enzima mitocondrial se considera como reacción [34]. Además de las reacciones de transporte piruvato, y oxaloacetate acetil CoA se consideran para intercompartmental intercambio de carbono [21, 27, 44]. El transporte de piruvato se supone que unidireccional debido a su acoplamiento a la fuerza motriz de protones, mientras que el transporte y las reacciones de oxaloacetate acetil CoA se considera reversible [26]. La reacción catalizada por la glucosa 6-fosfato isomerasa y el TCA ciclo de reacciones interconverting oxaloacetate y fumarato se consideran medidas reversibles, en el que la reversibilidad de estas reacciones fue tomado de la literatura [27]. Además de las rutas metabólicas centrales, las vías hacia la biosíntesis de aminoácidos diferentes se aplican. En la mayoría de los casos la formación de aminoácidos se lleva a cabo por una sola vía, ya sea en uno de los dos compartimentos. Las excepciones son la biosíntesis de alanina y glicina. Por alanina biosíntesis un citosólicas y una vía mitocondrial se puso en práctica en el modelo. Además de la conocida vía mitocondrial, una citoplásmica alanina amino transferasa, la generación de alanina citosólica de piruvato, ha sido probado recientemente en la S. Cerevisiae [25]. Por glicina la ruta alternativa a través de threonine aldolasa [45, 46] se tuvo en cuenta, además de la síntesis de serina. Las siguientes ecuaciones de equilibrio de los metabolitos intracelulares se formularon para examinar la red usando la numeración de los flujos de la Figura 1.

Citosólico metabolito piscinas

La glucosa 6-fosfato: ν 1 - ν 2 - ν 3 + ν 4 - ν 5 = 0 (1)

Fructosa 6-fosfato: ν 3 - ν 4 - ν 6 + ν 8 - ν 9 + ν 10 - ν 11 = 0 (2)

Pentosa fosfato: ν 2 - ν 7 - ν 8 + ν 9 - 2 ν 12 + 2 ν 13 = 0 (3)

Erythrose 4-fosfato: - 8 + ν ν 9 + ν 10 - ν 11 - ν 14 = 0 (4)

Sedoheptulose 7-fosfato: ν 12 - ν 13 - ν 10 + ν 11 - ν 5 = 0 (5)

Glyceraldehyde 3-fosfato: ν 6 - ν 10 + ν 11 + ν 8 - ν 9 + ν 12 - ν 13 + ν 16 - ν 17 - ν 18 = 0 (6)

Dihydroxyacetone-fosfato: ν 6 - ν 15 - ν 16 = 0 (7)

3-Phosphoglycerate: ν 17 - ν 19 - ν 20 - ν 24 = 0 (8)

Serina: ν 20 - ν 21 - ν 22 = 0 (9)

Glicina: ν 22 - ν ν 29 + 23 = 0 (10)

Threonine: ν 28 - ν 29 - ν 30 = 0 (11)

Phosphoenolpyruvate: ν 24 - ν 25 - ν 26 = 0 (12)

Piruvato cyt: ν 26 - ν 27 - ν 32 - ν 33 - ν 34 = 0 (13)

Acetaldehído: ν 32 - ν 37 - ν 38 = 0 (14)

Acetato: ν 38 - ν 39 - ν 40 = 0 (15)

Acetil CoA cyt: ν 40 - ν 41 - ν ν 48 + 47 = 0 (16)

Alanina cyt: ν 33 - ν 42 = 0 (17)

Oxaloacetate cyt: ν 27 - ν 28 - ν 31 - ν ν 36 + 35 = 0 (18)

Mitocondrial metabolito piscinas

Piruvato mit: ν 34 - ν 43 - ν 44 + ν 50 - ν 51 = 0 (19)

Alanina mit: ν 43 - ν 45 = 0 (20)

Acetil CoA mit: ν 44 - ν 46 + ν 47 - ν 48 - ν 49 = 0 (21)

2-Oxoglutarate: ν 49 - ν 52 - ν 53 = 0 (22)

Succinate: ν 53 - ν ν 55 + 54 = 0 (23)

Oxaloacetate / Malate mit: ν 35 - ν 36 - ν 49 - ν 50 + ν 54 - ν 55 = 0 (24)

Para cada examinado estado fisiológico diferente, que dependen de la tasa de crecimiento, composición celular de S. Se consideró cerevisiae (Tabla 1]. La composición macromolecular de una célula de levadura en relación a la tasa de crecimiento fue calculada a partir de datos de la literatura [47 - 49]. La composición de cada macromolécula, sin embargo, se supone que debe ser el mismo para las diferentes condiciones de crecimiento [27]. El contenido y composición de lípidos, ácidos nucleicos, carbohidratos y fue tomado de la literatura [48, 49]. La composición de aminoácidos de la proteína celular fue determinado experimentalmente en este trabajo. Sobre la base de estos datos y el stoichiometry anabólicos vías de la levadura en la demanda de los distintos metabolitos precursores podrían ser calculado (Tabla 2] y utilizados como medir los flujos en el flujo de estimación de rutina, tal como se describe anteriormente [41].

Modelación matemática y el análisis de flujo

Flux cálculos se realizaron con 6,1 Matlab y Simulink 3.0 (Mathworks Inc, Nattick, EE.UU.), la combinación de equilibrio y metabolito isotopomer modelado. El enfoque utilizado realizado metabolito de equilibrio (ver balances de masa citado más arriba) durante cada paso de optimización considerando stoichiometric datos sobre la demanda de anabólicos precursores de la biomasa (Tabla 2] y la secreción de producto (Tabla 3]. El conjunto de los flujos mínimos que dio desviación entre experimentación y simulación de las fracciones de masa isotopomer se tomó como la mejor estimación para el flujo de distribución intracelular. Como error de criterio ponderado suma de los mínimos cuadrados se utilizó [41]. Dado que la estructura no lineal de isotopomer modelos pueden potencialmente llevar a los mínimos locales, múltiples initializations parámetro se utiliza para asegurar que el flujo de distribuciones obtenido representó un óptimo global. El análisis estadístico de los parámetros de flujo obtenido fue llevado a cabo por el análisis de Monte-Carlo, en el que azar, normal-distribuido ruido se añadió a la medición de los datos [41, 50].

Contribuciones de los autores

DE llevó a cabo el trabajo experimental incluido el chemostat cultivos, el 13 C los estudios de seguimiento y análisis de todos los involucrados.

CW diseñó el estudio y lleva a cabo todos los trabajos de cálculo que incluye la construcción de la red metabólica modelo de S. Cerevisiae, el software de aplicación, el cálculo de los flujos de carbono, y el análisis estadístico. Él redactado y compuesto el manuscrito.

Ambos autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Reconocemos el asesoramiento de Michael Hans en el los estudios de seguimiento realizados.