Thrombosis Journal, 2005; 3: 16-16 (más artículos en esta revista)

Hacia una normalización de la evaluación de la generación de trombina: La influencia del factor tisular, las plaquetas y la concentración de fosfolípidos en los valores normales de Thrombogram-Thrombinoscope ensayo

BioMed Central
Grigoris T Gerotziafas (gerotziafasgrigoris@hotmail.com) [1], François Depasse (f.depasse @ lablcl.com) [2], Joël Busson (j.busson @ lablcl.com) [2], Lena Leflem (f.depasse @ Lablcl.com) [2], Ismail Elalamy (ismail.elalamy @ htd.ap-hop-paris.fr) [1], Meyer Samama M (Mmsamama@aol.com) [1]
[1] Service d'Hématologie biológico, Hôpital Hôtel-Dieu de París, Francia
[2] LCL, Ivry sur Seine, Francia

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Resumen
Antecedentes

La generación de trombina ensayo se desarrolló hace varios años para imitar los mecanismos fisiológicos de coagulación pero tenía importantes limitaciones. Thrombogram-Thrombinoscope ensayo utilizando un fluorogenic sustrato, permite la obtención de la generación de trombina en las curvas no defibrinated plasma rico en plaquetas (PRP) de una forma totalmente automatizada.

Métodos

Hemos normalizado la metodología de Thrombogram-Thrombinoscope y Evaluación de la precisión de los parámetros de la generación de trombina (período de tiempo, la concentración máxima de trombina [Cmax], el tiempo requerido para alcanzar Cmax [Tmax] y el potencial endógeno de la trombina ETP) utilizando diferentes concentraciones de humana recombinante Factor tisular, plaquetas o fosfolípidos. Valores normales de la generación de trombina ensayo se establecieron en óptimas condiciones experimentales.

Resultados

En presencia de bajas concentraciones TF (dilución final de tromboplastina en plasma: 1/1000-1/2000) el ensayo mostró Thrombogram intra-e inter-ensayo ensayo coeficientes de variación inferior al 9%. La generación de trombina parámetros mostraron una importante variabilidad interindividual y los coeficientes de variación osciló entre el 18% y el 50%. PRP en el período de tiempo que, Cmax y Tmax, pero no el PTE, fueron influenciados por la concentración TF. Parámetros de la generación de trombina, no fueron influidos por las variaciones de la concentración de plaquetas de 50 × 10 9 / l a 400 × 10 9 / l. La adición de fosfolípidos sintéticos procoagulante en PPP fuertemente influenciado todos los parámetros de thrombogram. Para todos los parámetros de un umbral thrombogram efecto se observa en la presencia de concentraciones phspholipid igual o superior a 4 μ M. En congelados el PRP y el período de tiempo que el Tmax se redujo significativamente y se aumentó la Cmax comparado con la dulce PRP, pero la ETP, el intradía y de la inter-ensayo de los coeficientes de variación fueron similares en ambos ensayos de los sistemas.

Conclusión

Thrombogram-Thrombinoscope ensayo realizado en frescos o congelados en el PRP tiene una precisión aceptable, con una baja entre ensayo y ensayo intra-coeficiente de variación. La concentración de la TF es determinante para los valores normales de los parámetros estudiados de la generación de trombina. Cuando se realiza el ensayo en el PPP, la generación de trombina parámetros están influenciados por la concentración de fosfolípidos sintéticos procoagulante. La óptima condiciones experimentales se han obtenido en la presencia de 1 / 1000 de la dilución final de tromboplastina, un recuento de plaquetas superior a 50 x 10 9 / l y una síntesis de fosfolípidos concentración mayor de 4 μ M.

Antecedentes

El mundial de los tiempos de coagulación (es decir, tiempo de protrombina y del tiempo parcial de tromboplastina) son habitualmente utilizados para la evaluación de la coagulación de origen humano, pero ignoran el procedimiento de la generación de trombina, ya que en el momento de la formación del coágulo sólo el 3% de la protrombina se activa [1, 2]. Esta es una observación constante tanto en condiciones normales de plasma o en la presencia de los agentes antitrombóticos (es decir, fondaparinux o enoxaparina) [3]. El mundial de los tiempos de coagulación son obligatorias para la detección de deficiencias de factores de la coagulación y el monitoreo biológico de tratamiento con heparina no fraccionada y coumarins pero que tienen un valor muy limitado en la detección de síndrome de hipercoagulabilidad estados [1, 2]. Por otra parte, no son significativamente influenciadas por la presencia de concentraciones terapéuticas de la LMWHs o indirecta, tales como los inhibidores de FXa fondaparinux [3]. La medición de la actividad anti-Xa en el plasma de pacientes tratados con LMWHs tiene un limitado valor predictivo de la evolución clínica [4] y, en algunos pacientes la población (es decir, ancianos o pacientes obesos), el anti-Xa los niveles en plasma están poco correlacionadas con la Administrado dosis de HBPM [5, 6].

El estudio de la generación de trombina, ya sea realizado con ensayos de coagulación de la base o con sustratos cromogénicos y es un viejo instrumento que se utiliza en la coagulación de la sangre de investigación [7 - 12]. En él se describen todas las fases del proceso de generación de trombina (inicio, la amplificación y la inhibición de la generación de trombina, así como la cantidad de integrantes generó la trombina). De acuerdo con el sistema experimental utilizado, la generación de trombina puede verse influida por la mayoría de los factores que desempeñan un papel en la coagulación de la sangre. Sin embargo, la generación de trombina utilizada para la evaluación de un laborioso y prolongado método. La versión más sofisticada de la generación de trombina ensayo utilizando un sustrato cromogénico Hemker desarrollado por el grupo es menos exigente que el tiempo de la anterior, ya que es totalmente automatizado acompañado con un software para el cálculo del área bajo la curva de la generación de trombina (potencial endógeno de la trombina) [13]. La limitación más importante experimental de este ensayo es que se puede hacer sólo en defibrinated pobres de plasma de plaquetas (PPP). Así, al menos, dos componentes importantes de la coagulación de la sangre (es decir, las plaquetas y el fibrinógeno / fibrina) estuvieron ausentes [14].

El Thrombogram-Thrombinoscope ensayo es un paso adelante para el estudio del proceso de coagulación de la sangre debido a que, utilizando un fluorogenic sustrato, que permite la obtención de la generación de trombina en las curvas no defibrinated plasma rico en plaquetas (PRP) de una manera totalmente automatizada [15]. Un creciente cuerpo de evidencia indica que Thrombogram-Thrombinoscope ensayo puede ser una herramienta útil en el diagnóstico de síndrome de hipercoagulabilidad congénita o adquirida estados, y es lo suficientemente sensible, en pacientes con diátesis hemorrágica [16, revisado en 17]. Thrombogram también es sensible a la presencia de agentes antiplaquetarios y antitrombóticos [3, 18].

Hasta ahora, existe una importante heterogeneidad en cuanto a la validez de las condiciones de análisis y la experimentación de sistemas para la evaluación de thrombogram. Además, el potencial endógeno de la trombina es el único parámetro de thrombogram que ha sido sistemáticamente validados [19 - 21]. Otros parámetros de la curva de la generación de trombina dado por Thrombogram-Thrombinoscope ®, como el período de tiempo que la aparición de la generación de trombina, la concentración máxima de trombina generada y el tiempo necesario para alcanzar la concentración máxima de trombina no han sido validados.

Normalización de la generación de trombina mediante la Thrombogram-Thrombinoscope ® método es necesario para la amplia utilización clínica de la prueba. El objetivo de este estudio fue determinar la influencia de preanalítica y circunstancias en el Thrombogram-Thrombinoscope ensayo. Examinamos la intra-ensayo, el ensayo interinstitucional y entre los distintos coeficientes de las variaciones de la generación de trombina período de tiempo, la concentración máxima de trombina (Cmax), el tiempo necesario para lograr el máximo de la generación de trombina (Tmax) y la trombina endógena Potencial (ETP) en alimentos frescos y en PRP congelados PRP tras activar factor tisular (TF) en el plasma vía de los voluntarios sanos y los valores normales establecidos para cada parámetro de la thrombogram. También estudiamos la influencia de la condición experimental como el TF, concentración, y la de plaquetas o fosfolípidos concentración en cada parámetro de la curva de la generación de trombina dado por el thrombogram.

Métodos
Reactivos

Albúmina de suero bovino (BSA) y Tris-HCl se obtuvieron de los laboratorios Sigma (St. Louis EE.UU.). Relipidated factor tisular recombinante (Hemoliance ® RecombiPlasTin) fue el Laboratorio de Instrumentación (Milán, Italia). El Hemoliance ® RecombiPlasTin reactivo fue reconstituido por adición de 5 ml de cloruro de sodio al 0,9%, y posteriormente diluido en buffer Hepes, pH 7.35 (que contiene 20 mM Hepes, 140 mM de NaCl y 5 mg / ml BSA) de los experimentos con la Thrombogram-Thrombinoscope ™ ensayo (Synapse bv, Maastricht, Países Bajos). La trombina calibrador también fue obtenida por Synapse bv (Maastricht, Holanda). El sustrato fluorogenic Z-Gly-Gly-Arg-AMC se obtuvo de Bachem (Bubendorf, Suiza). Heparina no fraccionada fue de Leo Laboratories, disponible en el comercio enoxaparina fue la preparación de los laboratorios Sanofi-Aventis (Paris, Francia) y de fondaparinux es de Glaxo Smith Klein (París, Francia). Fosfolípidos sintéticos (DOPS / DOPE / DOPC reconstituidos según las instrucciones del fabricante en una proporción 1:1:1,25) se obtuvieron a partir de Avanti Polar LipidsInC (Albaster, Alabama, EE.UU.).

Plasma humano normal

Sangre venosa se obtuvo de 22 voluntarios sanos, no tomar cualquier medicación, que están trabajando en nuestro laboratorio. La sangre fue recolectada con atraumatic antecubital veinipuncture, en siliconized tubos vacutainer (Becton Dickinson, Meylan, Francia), que contiene buffer citrato trisódico (0,129 mol / l, nueve partes de sangre y una parte de solución de citrato). Thrombogram-Thrombinoscope ™ ensayo se realizó en plasma rico en plaquetas (PRP), preparado después de la centrifugación de sangre total citrada durante 10 min a 150 g a temperatura ambiente. El PRP sobrenadante fue removido y el recuento de plaquetas se ajustó a 150 × 10 9 / l de dilución con PPP autólogo obtenido después de una nueva centrifugación de la sangre para los restantes 15 minutos a 2000 g. Para estudiar la influencia de la concentración de plaquetas en la generación de trombina parámetros, la concentración de plaquetas en el PRP, preparado a partir del 4 de voluntarios sanos, se ajustaron a, 10 × 10 9 / l, 50 x 10 9 / l, 100 × 10 9 / l, 150 × 10 9 / l, 400 × 10 9 / l de dilución con PPP autólogo. Para estudiar la influencia de la concentración de fosfolípidos en la generación de trombina de ensayo, congelados PPA normal de tres voluntarios fue de pinchos con un aumento de la concentración de fosfolípidos sintéticos procoagulante (0, 2, 4 y 8 μ M).

Thrombogram-Thrombinoscope ensayo

En cada uno de los pocillos de una placa de las microempresas, el 80 μ l de la estudiados plasma se mezclaban con 20 μ l de diluirse relipidated factor tisular recombinante (Hemoliance ® RecombiPlasTin) Laboratorio de Instrumentación (Milán, Italia). El RecombiPlasTin reactivo fue reconstituido por adición de 5 ml de cloruro de sodio al 0,9%, y posteriormente diluido en buffer Hepes pH 7,35; que contiene 20 mM Hepes, 140 mM de NaCl y 5 mg / ml de albúmina sérica bovina. La concentración de la TF no es dada por el fabricante y por esta razón TF se expresa como la dilución final de recombiplastin en el plasma. Los siguientes diluciones finales de recombiplastn se estudiaron: 1 / 200, 1 / 500, 1 / 1000, 1 / 2000, que corresponden a una serie de calculadas TF concentración del 3 pM a 30 pM en el plasma (TF niveles en RecombiPlasTin reactivo se midieron utilizando Ensayo de un método de ELISA Diagnóstico de América Inc; datos no presentados). No hay mucha variabilidad entre los preparativos de recombiplastin se observó (datos no presentados). Thrombogram También se realizó sin ningún tipo de adición de TF.

La generación de trombina fue provocada por la adición de una solución que contenga CaCl 2 (16,7 mM concentración final) y el sustrato fluorogenic (Z-Gly-Gly-Arg-AMC, 417 μ M concentración final). Un lector de placas fluorómetro (Fluoroskan Ascenso, ThermoLabsystems, Helsinki, Finlandia) y el software adecuado (Thrombogram-Thrombinoscope ™ ensayo; Synapse bv, Maastricht, Países Bajos) se han utilizado. Generado trombina se cuantificarán mediante un calibrador de la trombina ofrecido amablemente por Synapse bv Plasmas de pinchos con trombina calibrador se ejecute en paralelo con cada ciclo de muestras de ensayo. Los siguientes parámetros fueron analizados utilizando el software adecuado proporcionado por Synapse bv: a) el tiempo de la generación de trombina, b) el tiempo hasta alcanzar la concentración máxima (Tmax) de la trombina, c) la concentración máxima (Cmax) de la trombina y d ) La cantidad total de la actividad evaluaron la trombina como el área bajo la curva (es decir, el potencial endógeno de la trombina - PTE).

Precision análisis de Thrombogram-Thrombinoscope ensayo

La variabilidad intra-ensayo de cada parámetro estudiado de Thrombogram-Thrombinoscope fue evaluada por repetir el ensayo 6 veces en la misma placa de ensayo para cada dilución de recombiplastin estudiadas y la variabilidad inter-ensayo fue evaluada por la repetición de la prueba 3 veces, una después de la Otros en diferentes placas de ensayo. Interamericano de variación individual se evaluó mediante la comparación de los resultados obtenidos en 22 sujetos sanos.

Análisis estadístico

Unpaired pareadas y la prueba t de Student se utiliza para comparar los valores medios de los parámetros de TG en congelados y no congelados PRP. Paquete de software estadístico SPSS fue utilizado para el análisis estadístico. Los valores son presentados como medias ± sd.

Resultados
La variabilidad intra-ensayo de thrombogram

Cuando TF se añadió en PRP, la thrombogram parámetros aceptables mostraron variabilidad intra-ensayo está igual o inferior al 9%. La realización del ensayo fue independiente de la concentración TF (Tabla 1].

Interamericano de ensayo de la variabilidad de thrombogram

Todos los parámetros mostraron thrombogram baja variabilidad inter-ensayo, cuando se evaluó la generación de trombina en presencia de FT en PRP. TF disminución de la concentración no influyó significativamente en la variabilidad inter-ensayo de los parámetros thrombogram. En cambio, cuando no se añadió TF experimental en el sistema interamericano de ensayo de la variabilidad período de tiempo y el Tmax fue considerablemente alta (14% y 12% respectivamente). En cambio la variabilidad inter-ensayo de la Cmax y el PTE no fue influenciada significativamente por la ausencia de TF (Tabla 1].

El ensayo intra-e inter-ensayo de los coeficientes de variación de los parámetros estudiados fueron inferiores al 5% cuando se estudió la generación de trombina en PRP de pinchos con HNF (0,1 UI / ml a 1 UI / ml), o enoxaparina (0,1 UI anti-Xa / Ml a 1 anti-Xa UI / ml) o fondaparinux (0,1 μ g / ml a 1 μ g / ml) en presencia de baja concentración TF (dilución final de recombiplastin 1 / 2000).

Variabilidad interindividual de thrombogram

Thrombogram parámetros mostraron una importante variabilidad interindividual y los coeficientes de variación osciló entre el 18% y el 45% está aún más importante cuando no se añadió TF. Entre los parámetros estudiados, el PTE y la Cmax mostró la mayor variabilidad interindividual principalmente cuando no se añadió TF (Tabla 2].

Influencia de la concentración en la TF thrombogram en fresco PPP y PRP

La generación de trombina se desencadenó en fresco PRP de individuos sanos sin ninguna TF Además, así como en la presencia cada vez mayor de las concentraciones de TF (Figura 1]. Cuando se estudió la generación de trombina en PRP sin TF Además de una cantidad significativa de la trombina, se ha generado (Cmax = 108 ± 9 nM, PTE = 1094 × nM ± 40 min) con un desfase de tiempo de 14 ± 3,3 min y un Tmax de 19,5 ± 4,8 min. En recombiplastin dilución 1 / 2000, que corresponde a una concentración final de la aproximación de TF, de 3 de pM, un umbral efecto de la duración del período de tiempo y el Tmax se observó. El aumento de la concentración de la TF dado lugar a un aumento de la Cmax de la trombina. En cambio, el PTE no fue influenciado por la presencia de la TF, ya que la diferencia entre los valores de ETP en ausencia de TF y en la presencia de recombiplastin dilución 1 / 2000 (lo que corresponde a aproximadamente 3 pM concentración final de la carretera TF) no fue Estadísticamente significativa (1094 ± 340 nMxmin versus 1316 ± 255 nMxmin respectivamente, p> 0,05) (Figura 1]. Tabla 3 describe los valores normales de Thrombogram parámetros de coagulación cuando se dispara en la presencia de 1 / 1000 de recombiplastin dilución final (lo que corresponde a aproximadamente 6 pM concentración final de la TF).

Efecto de la concentración de plaquetas en Thrombogram

El efecto de plaquetas en la generación de trombina se estudió en la presencia de los más bajos de concentración estudiado TF (1 / 2000 de recombiplastin dilución en el plasma), que mostró una aceptable precisión del ensayo.

El período de tiempo que la generación de trombina fue similar (8 ± 3 min) en presencia de plaquetas 10 × 10 9 / l y 50 × 10 9 / l. En presencia de plaquetas 100 x 10 9 / l el período de tiempo que fue significativamente menor (5,8 ± 0,7 min), en comparación con la observada en la presencia de 50 × 10 9 / l (8 ± 3 min; P <0,05). No hay diferencia con el de período de tiempo que se observó en las plaquetas van de 100 × 10 9 / l a 400 × 10 9 / l (5,5 ± 0,5 min) (Tabla 4].

El Tmax en presencia de plaquetas de 10 × 10 9 / l fue de 19 ± 2 min siendo significativamente más largo en comparación con la observada en la presencia de plaquetas de 50 × 10 9 / l (12 ± 0,2 min, p <0.05) . En presencia de plaquetas de 50 × 10 9 / l a 400 × 10 9 / l la Tmax de la generación de trombina no cambió de forma significativa (Tabla 4].

La Cmax de la trombina se disminuyó significativamente en presencia de plaquetas de 10 × 10 9 / l, en comparación con la observada en la presencia de plaquetas de 50 × 10 9 / l (43 ± 16 nM y 63 ± 14 nM, respectivamente, p <0,05). En presencia de concentraciones de plaquetas de 50 × 10 9 / l a 400 × 10 9 / la leve pero no estadísticamente significativo aumento de la Cmax se observó (Cuadro 4].

En presencia de plaquetas de 10 × 10 9 / l la ETP fue significativamente menor en comparación a la observada en la presencia de plaquetas de 50 × 10 9 / l (894 ± 100 y 1095 ± 301, respectivamente, p <0,05 ). En presencia de plaquetas que van desde 150 x 10 9 / l a 400 × 10 9 / l que no existen diferencias significativas de la ETP se observaron (Tabla 4].

Comparación de los frescos y congelados-descongelados plasma rico en plaquetas para la evaluación thrombogram

En thrombogram evaluarse en congelados PRP y PRP en fresco sin exógenos además de la TF-que transcurre el tiempo y el Tmax fueron más cortos en un 45% y el 51% y el Cmax de la trombina aumentó un 200% en congelados PPR, en comparación con el No congelados uno (p <0,05). El PTE es menos afectado por la congelación, ya que en congelados PRP que sólo aumentó en un 6% en comparación con el que se mide en fresco PRP (p> 0,05) (Figura 2].

En thrombogram apreciarse en la presencia de TF, el PTE es el único parámetro, que no se vio afectada significativamente por el bloqueo (Figura 2]. En congelados PRP, en la presencia de cada uno estudió la concentración de la TF período de tiempo que se redujo en un 33% a un 38% en comparación con los no congelados uno (p <0,05). El Tmax era más marcadamente influenciada por el procedimiento de congelación, principalmente cuando cantidades mínimas de TF estaban empleados. Se redujo en 47% en 1 / 1000 de recombiplastin dilución final en el plasma, 38% en 1 / 500 de la dilución final recombiplastin y el 30% en 1 / 200 de recombiplastin dilución final, en comparación con los valores respectivos en fresco PRP (p < ; 0,05). El bloqueo también afectó a la Cmax de la trombina, siendo significativamente mayor en los congelados que en fresco PRP. El aumento de la Cmax PRP fue congelado en 119% en 1 / 1000 de recombiplastin dilución final, el 81% de 1 / 500 de la dilución final recombiplastin and39% en la presencia de 1 / 200 de recombiplastin dilución final, en cada caso, la diferencia fue Significativa (p <0,001) en comparación con los valores respectivos en fresco PRP.

El procedimiento de congelación no influyó significativamente en la variabilidad interindividual de thrombogram TF ensayo cuando se añadió. En contraste congelación resultado en una importante disminución de la intra-ensayo coeficiente de variación de la ETP y Cmax thrombogram cuando se realizó sin adición de TF (Tabla 5].

Los valores normales y de la inter-individuales coeficiente de las variaciones de los parámetros estudiados de la generación de trombina después de la adición de 1 / 1000 de recombiplastin dilución final (aproximadamente 6 pM TF) en alimentos frescos y congelados en PRP se resumen en la Tabla 3.

La influencia de la síntesis de fosfolípidos concentración en la generación de trombina en PPP

La adición de fosfolípidos sintéticos procoagulante en PPP fuertemente influenciado todos los parámetros de thrombogram (Figura 3]. Tanto el período de tiempo que la Tmax y de la generación de trombina se depende en gran medida de la presencia de fosfolípidos procoagulante TF cuando no se añadió. En presencia de 3 TF pM de ambos parámetros fueron influenciados a un menor grado por la concentración de fosfolípidos. Por el contrario el impacto de la procoagulante fosfolípidos es importante tanto en el PTE y la Cmax de la trombina, ya sea en ausencia de TF o en la presencia de baja (3 pM) o en concentraciones más altas (30 pM). Para todos los parámetros de un umbral thrombogram efecto se observa en la presencia de concentraciones phsopholipid igual o superior a 4 μ M. Sin embargo, desde la Cmax apareció un ligero, aunque no significativo aumento de la presencia de fosfolípidos sintéticos concentración, de 8 μ M, la concentración óptima de fosfolípidos está situado a 8 μ M.

Discusión

En el presente estudio se evaluó la generación de trombina con la automatizado Thrombogram-Thrombinoscope ensayo. La precisión de thrombogram, fue evaluada en el contexto de aumento de las concentraciones de TF, de fosfolípidos sintéticos procoagulante, y la congelación de plaquetas - descongelación de plasma rico en plaquetas de los voluntarios sanos. Valores normales en la generación de trombina se define experimental, las condiciones que se pueden aplicar en la rutina de la hemostasia laboratorio también se han establecido.

En la presencia de una normalización de la concentración de plaquetas (150 × 10 9 / l) sin adición de TF todos los parámetros estudiados de la generación de trombina se puede medir. Por lo tanto, confirmar que la presencia de procoagulante fosfolípidos derivados de las plaquetas, como en nuestro estudio, es de gran importancia para la constante generación de trombina [22]. La presencia de las plaquetas, como es el caso de nuestro estudio, in vitro o la adición de fosfolípidos con carga negativa en el PPP [20] crea un fisiológicamente más relevantes sistema experimental.

La amplificación de la generación de trombina también depende de la concentración del estímulo inicial. De acuerdo con el antiguo sistema de la coagulación de la sangre (el sistema en cascada) [23, 24] se puede activar, ya sea la vía TF o el sistema de contacto (vía intrínseca), con el fin de estudiar la generación de trombina. Sin embargo, el esquema clásico de cascada tiene una limitada relevancia fisiológica. Actualmente se acepta en general que pequeñas cantidades de FT, ya sea nacidos de sangre (de micropartículas o monocitos activados) o expuestos en el lugar de la lesión vascular, se unen a FVII y FVIIa y el complejo TF / FVIIa provoca la coagulación de la sangre [25]. Por lo tanto, validó la Thrombogram-Thrombinoscope ensayo en la carretera TF-inducida de la coagulación normal de plasma. Tal como se esperaba, en el PRP período de tiempo que de comienzo la generación de trombina, la Cmax de la trombina y el Tmax fueron fuertemente influenciados por la TF concentración. Los valores del período de tiempo que, Cmax, Tmax y ETP en el PRP no varían significativamente cuando fisiológicamente relevantes concentraciones de TF, que van desde 1 / 2000 a 1 / 1000 de dilución de recombiplastin, se utilizaron (que corresponden a unos 3 a 6 pM PM de TF).

Thrombogram ensayo realizado en la presencia de concentraciones TF (3 pM to6 pM) que se consideran fisiológicamente relevantes, tuvo una baja entre ensayo y dentro de los coeficientes de variación de ensayo en PRP revelando que la precisión de que el ensayo es un poco influenciado por el Concentración de la TF. Sin embargo, todos los parámetros estudiados de thrombogram realizado en PRP mostró una importante variabilidad interindividual, que no fue mejorada por la adición de TF. Chantarangkul et al [20] mostraron que la presencia residual de las plaquetas en el PPP influye en la imprecisión de la medición PTE. Nuestro estudio muestra que la variabilidad interindividual es importante en fresco PRP, así como en congelados y PRP no influye cuando el recuento de plaquetas oscila entre los 10 × 10 9 / l a 400 × 10 9 / l (datos no presentados ). Un individuo que dependen de la variación en thrombogram También se ha informado por Vanschoonbeek et al [26]. Por lo tanto, parece que cada características funcionales de las plaquetas, que no se conocen hoy en día, así como las variaciones de la concentración de factores de coagulación y la natural de los inhibidores de la coagulación de la sangre [27] influir en la generación de trombina perfil y pueden ser detectados por el ensayo thrombogram . Plaquetas desechos o micropartículas presentes en productos fitosanitarios puede tener una importante contribución a la variabilidad interindividual observado importantes de la generación de trombina de ensayo, ya sea en ausencia o en presencia de TF, puesto que ejercen una "no normalizados" actividad procoagulante. Con el fin de eliminar este factor impredecible se ha propuesto que el agotamiento completo de plaquetas (es decir, por la filtración de PPP) o la adición de un exceso de concentración de fosfolípidos en el PPP puede mejorar la variabilidad interindividual de thrombogram [20]. Tenemos que destacar que en la presencia de muy baja concentración TF (3 pM) o, en su ausencia, el CV valores de la variabilidad interindividual de la trombina Cmax son considerablemente altas. Este resultado permite postular que, en condiciones en que el inicial proceso de activación de la coagulación es débil el sistema experimental es muy inestable. En tales condiciones el impacto de los artefactos tales como los desechos de plaquetas o probablemente la presencia de material procoagulante como micropartículas es más importante. Se ha reconocido ampliamente que la principal contribución de la Thrombogram-Thrombinoscope metodología es que permite el estudio de la generación de trombina en un fisiológicamente más relevantes sistema en el que las plaquetas y fibrinógeno / fibrina están presentes. Si es mejor omitir las plaquetas del sistema experimental tiene que ser controlada en estudios más detallados en grupos más grandes de individuos normales y de pacientes con hiper o hipo-coagulantes estados. En cualquier caso, la gran variación entre individuos podrían hacer más difícil la interpretación de los resultados.

Otro aspecto importante de Thrombogram-Thrombinoscope ensayo es que los parámetros estudiados no son significativamente influenciadas por variaciones cuantitativas de plaquetas dentro de una muy amplia gama de concentración de plaquetas (de 50 × 10 9 / l a 400 × 10 9 / l). Como hemos descrito en detalle en otro lugar [28] y de conformidad con las conclusiones de Chantarangkul et al [20] la generación de trombina se reduce significativamente cuando de plaquetas es inferior a 50 × 10 9 / l. En consecuencia, las desviaciones de la normal de las concentraciones de plaquetas no afectar significativamente ni la precisión del ensayo ni de referencia los valores normales.

Procedimiento de congelación de la PRP redujo significativamente el período de tiempo y la Tmax y también el aumento de la Cmax de la trombina generada, pero no afectan de manera significativa a la ETP. Así, en congelados PRP se acelera la generación de trombina y el importe máximo de generado el aumento de la trombina es al parecer debido al frío plaquetaria inducida por la activación y / o procoagulante fosfolípidos liberación. Sin embargo, la suma integral de la trombina generada en el tiempo, expresadas por el PTE no sea modificado. Además, la congelación no modifica los coeficientes de variación de todos los parámetros estudiados de thrombogram cuando se desencadenó la generación de trombina en presencia de TF mostrando una vez más que la alta variabilidad interindividual del ensayo es poco en relación con las condiciones técnicas. En consecuencia ETP es el único parámetro de Thrombogram la que se puede evaluar en congelados, pero el clima PRP su sensibilidad para la detección de síndrome de hipercoagulabilidad patológica o hypocoagulable condiciones hay que examinar. Desde un punto de vista práctico, cuando se activa en la coagulación de pinchos con los productos fitosanitarios sintéticos procoagulante fosfolípidos en concentraciones superiores a los 4 (1 2000) da lugar a un patrón similar de thrombogram como la observada PRP cuando se utilizó. Además, el conjunto de los datos presentados muestran que el PTE es más influenciado por la concentración de fosfolípidos procoagulante, más que por la concentración de la TF.

En conclusión, el presente estudio muestra que Thrombogram-Thrombinoscope ensayo realizado en fresco plasma rico en plaquetas tiene una precisión aceptable, con una baja entre ensayo y ensayo intra-coeficiente de variación. La concentración de la TF es determinante para los valores normales de todos los parámetros estudiados, excepto el potencial endógeno de la trombina. La adición de concentraciones fisiológicamente relevantes de la TF en plasma rico en plaquetas (1 / 1000 a 1 / 2000 dilución final de recombiplastin) simula un sistema experimental más natural de la que sin embargo, los blancos y glóbulos rojos, así como las condiciones reológicas están ausentes. La evaluación de la generación de trombina en congelados PRP induce un importante sesgo en los valores normales de todos los parámetros, excepto el de thrombogram PTE. En contraste, los parámetros obtenidos en thrombogram congelados PPP complementado con fosfolípidos sintéticos procoagulante en concentraciones iguales o superiores a 4 μ M y fisiológicamente relevantes concentraciones de TF es bastante similar a la obtenida en el PRP, en presencia de la misma TF concentración. En cuanto a todos los parámetros de la generación de trombina, la concentración óptima de los fosfolípidos sintéticos empleados en el presente estudio se sitúa en el 8 μ M. El uso de un calibrador de normalización de la trombina, que corre en paralelo con las muestras estudiadas, permite la expresión cuantitativa de la trombina en nM y ETP en nM × min. Además, el software puede thrombogram fiable describir las diferentes fases del proceso de la generación de trombina (es decir, la fase de iniciación, la Tmax y la concentración máxima de la trombina generada). Entre los parámetros estudiados de la generación de trombina dado por el Thrombogram-Thrombinoscope ensayo, el PTE es menos influenciado por la concentración de la TF, así como por las condiciones pre-analítica (PRP frescos o congelados PRP), pero es fuertemente influenciada por la Concentración de fosfolípidos en que se lleva a cabo en el PPP. La influencia de los disponibles comercialmente en thrombogram citrato de los preparativos tiene que ser evaluada en futuros estudios. Thrombogram-Thrombinoscope ensayo es sensible a la presencia de HNF, con fondaparinux y enoxaparina baja intra-e inter-ensayo de la variabilidad del ensayo. Sin embargo, hemos demostrado que el período de tiempo y la velocidad de propagación de la fase son más pertinentes que el PTE cuando un inhibidor indirecto FXa (fondaparinux) o rFVIIa están presentes en concentraciones terapéuticas [3, 28]. El método puede ser útil para el estudio de los diferentes agentes antitrombóticos sea cual sea su mecanismo de acción y su objetivo (LMWHs, directos e indirectos, los inhibidores de FXa y directa de los inhibidores de la trombina [3, 17, 29, 30]. Así, el conjunto de los parámetros De la generación de trombina puede utilizarse para el diagnóstico de laboratorio y biológicas de un gran espectro de la hiper-hipo-coagulantes y de los estados. La alta variabilidad interindividual de thrombogram es un tema que tiene que ser estudiado en detalle en un gran estudio de colaboración.

Lista de abreviaturas

Cmax: concentración máxima de trombina

CV: coeficiente de variación

PTE: potencial endógeno de la trombina

HBPM: heparina de bajo peso molecular

PPP: el plasma de plaquetas pobres

PRP: plasma rico en plaquetas

TF: factor tisular

Tmax: tiempo necesario para alcanzar la concentración máxima de trombina generada

Contribuciones de los autores

GTG concebido del estudio, organizó su diseño y coordinación, interpreta los datos y redactó el manuscrito. FD contribuido al diseño del estudio y la interpretación de los datos. JB participado en el diseño del estudio, la adquisición de los datos y la Análisis estadístico. LL participaron en los experimentos con los fosfolípidos sintéticos. IE participó en la lectura crítica del manuscrito. MMS participó en el diseño y la coordinación del estudio, la interpretación de los datos y colaboró en la redacción del manuscrito.

Agradecimientos

Los autores reconocen Jonathan Mnich y Daphné Pierreeugene su habilidad para la asistencia técnica.