Plant Methods, 2005; 1: 9-9 (más artículos en esta revista)

La combinación de metal óxido de cromatografía de afinidad (MOAC) y selectiva para la espectrometría de masas sólidas en la identificación de sitios de fosforilación de proteínas vivo

BioMed Central
Florian Wolschin (wolschin@mpimp-golm.mpg.de) [1], Wolfram Weckwerth (weckwerth@mpimp-golm.mpg.de) [1]
[1] Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 14424 Potsdam, Germany

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Resumen
Antecedentes

Fosforilación de proteínas es aceptada como una de las principales vía de reglamentación en las plantas. Más de 1000 proteínas quinasas se predijo en la Arabidopsis proteoma, sin embargo, sólo unos pocos estudios para buscar sistemáticamente en vivo sitios de fosforilación de proteínas. Debido a la baja y baja stoichiometry fosforilados abundancia de las proteínas, fosforilación sitio identificación con espectrometría de masas impone dificultades. Además, la frecuencia observada mala calidad de los espectros de masa derivados de phosphopeptides resultados inciertos frecuencia en la base de datos de visitas. Así, varias líneas de evidencia que se han combinado para una identificación precisa del sitio de fosforilación estrategia.

Resultados

Aquí, se presenta una estrategia que combina el enriquecimiento de phosphoproteins mediante una técnica denominada cromatografía de afinidad metaloxide (MOAC) y selectiva trampa de la espectrometría de masas de iones. El completo enfoque implica: (i) el enriquecimiento de las proteínas con baja fosforilación stoichiometry de mezclas complejas utilizando MOAC, (ii) de gel de separación y detección específica de la fosforilación mediante la tinción de fluorescencia (confirmación de enriquecimiento), (iii) la identificación de los candidatos phosphoprotein fuera de la SDS-PAGE mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa, y (iv) la identificación de sitios de fosforilación de estas proteínas enriquecido utilizando la detección automática de H 3 PO 4 neutral pérdida picos y dependen de los datos MS 3-fragmentación de la correspondiente MS 2-fragmento. La utilidad de este enfoque se demuestra en la identificación de sitios de fosforilación en proteínas de las semillas de Arabidopsis thaliana. Regulador importancia de los sitios identificados se indica mediante la conservación de los sitios detectados en el gen ribosomal familias, como las proteínas y esteroles deshidrogenasas. Para demostrar aún más la amplia aplicabilidad de MOAC, phosphoproteins fueron enriquecidos desde Chlamydomonas reinhardtii cultivos celulares.

Conclusión

Una novela phosphoprotein enriquecimiento MOAC procedimiento se aplicó a las proteínas de semillas de A. Thaliana y de las proteínas extraídas de C. Reinhardtii. Así, el método puede ser fácilmente adaptado a la muestra de interés, ya que es de bajo costo y los componentes necesarios están a disposición de todos. Reproducibilidad del enfoque fue probado mediante el control de los sitios de fosforilación de proteínas específicas de las semillas y C. Reinhardtii duplicado en los experimentos. Todo el proceso se propone como una estrategia adaptable a otros tejidos vegetales de alta confianza en la identificación de phosphoproteins y sus correspondientes sitios de fosforilación.

Antecedentes

El proteoma de las diferentes etapas de desarrollo de cualquier tipo de organismo que refleja más directamente el genoma o la transcriptome la especialización metabólica para el estado real de desarrollo. En plantas de varios estudios sobre el proteoma de las diferentes etapas de desarrollo se han llevado a cabo [1]. Semillas de latencia desempeña un papel crucial en el ciclo de vida de las plantas y su proteoma refleja los procesos metabólicos durante este importante periodo de desarrollo. Sin embargo, la investigación sobre modificaciones postraduccionales de las proteínas da una vista más detallada sobre la naturaleza compleja de la semilla metabolismo. Fosforilación de proteínas ha sido ampliamente descrito como una proteína reguladora de las principales modificaciones postraduccionales que influyen en muchos procesos importantes en las células vivas [2 - 4]. Así, la medición de la fosforilación de proteínas es fundamental para revelar señales de reglamentación y de las vías. Sin embargo, el estudio de la fosforilación de proteínas con el investigador se enfrenta a varios obstáculos.

Un hecho que complica es que muchas proteínas son fosforilados no sólo en un sitio, sino en varios sitios y que cada modificación parece tener diferentes funciones de regulación [5, 6]. Por lo tanto, la detección de la fosforilación de proteínas y la identificación de sitios de fosforilación son necesarios para la comprensión de la regulación de proteínas.

Tradicionalmente, la fosforilación es detectado por anticuerpos específicos y / o mediante la incorporación de radiactivos [32 P] Ortofosfato en proteínas. Sin embargo, aunque a menudo se inmunomarcados inespecíficos, la incorporación experimentos con radiactividad artificial, podría resultar en la fosforilación eventos e imponer la eliminación de residuos problemas. Sólo recientemente se ha convertido en lo posible detectar con fiabilidad la fosforilación de proteínas por la solución de las proteínas de interés en la presentación de un gel y gel para el fosfato específicas tintes fluorescentes seguida de una tinción de la proteína total [7 - 11].

La baja abundancia de phosphoproteins y la identificación exacta de los sitios específicos de fosforilación, sin embargo, todavía imponer problemas.

Debido a su sensibilidad y la solución de poder, de enriquecimiento selectivo de péptidos fosforilados / proteínas y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) métodos basados en la actualidad son ampliamente utilizados para la identificación de sitios de fosforilación (para revisión ver [4, 12, 13]].

La baja abundancia de péptidos fosforilados puede ser soslayado en parte por el enriquecimiento de la phosphopeptides con IMAC (Immobilised metal cromatografía de afinidad) después de la digestión de tríptico phosphoproteins. Si bien existen numerosas publicaciones que describen el enriquecimiento de phosphopeptides de origen animal mucho menos se han publicado estudios de tejidos vegetales (para revisión ver [14]]. Estos estudios se centran amplia gama, por ejemplo en thylakoid proteínas y proteínas de membrana plasmática de A. Thaliana [15, 16] o sobre el musgo Physcomitrella patens [17].

Sin embargo, basándose en un solo péptido de la proteína de identificación (tal como se hizo después de phosphopeptide enriquecimiento) es propensa a la identificación de los falsos positivos. Lo que es más, péptidos fosforilados en serines o threonines tienden a perder su grupo fosfato durante el proceso de fragmentación en el espectrómetro de masa lo cual complica todavía más correcta asignación. Este inconveniente puede ser soslayado por completo el enriquecimiento de phosphoproteins desde este enfoque conduce a la identificación de varios péptidos por la proteína y, por tanto, aumenta la fiabilidad de la identificación de proteínas.

Recientemente, se informó de un novedoso método para el enriquecimiento de fosforilados de proteínas complejas mezclas denominado MOAC (cromatografía de afinidad de óxido de metal) [18]. Este método añade otra herramienta para el repertorio de métodos para la identificación de proteínas fosforilados y podría ayudar a superar algunos de los problemas asociados con la especificidad IMAC. En este primer estudio nos mostró que MOAC puede ser usado para enriquecer fosforilados proteínas de la planta de hoja de tejido [18].

En el presente estudio se MOAC uso para el enriquecimiento de fosforilados proteínas de A. Thaliana semillas y de las proteínas de C. Reinhardtii y cultivos de células muestran que el método es adecuado y reproducible en los distintos tipos de muestras.

Sin embargo, para la identificación de los sitios de fosforilación es preciso adoptar nuevas medidas. Como se ha mencionado anteriormente la ionización eficiencia y la calidad de un phosphopeptide espectros a veces no es lo suficientemente bueno para la identificación fiable y aún más difícil es la determinación exacta de la fosforilación sitio. Para evitar estos problemas de los grupos fosfato pueden ser sustituidos por beta-eliminación y Michael Además residuos más estable con lo que aumenta la eficiencia de ionización y la mejora de la fragmentación de comportamiento [5, 19 - 23]. Sin embargo, estos enfoques a veces dar lugar a reacciones secundarios no deseados y son difíciles de realizar en mezclas complejas. Otro método prometedor es el análisis de secuencias de péptidos por disociación de transferencia de electrones [24], pero esto requiere de la modificación sofisticado espectrómetro de masa no estaba aún plenamente disponible.

El enfoque que se emplee para identificar los sitios de fosforilación hace uso de la neutral pérdida de H 3 PO 4 en MS 2 fragmentación. El dominante neutral pérdida pico observado en muchos MS 2 espectros derivados de la serina / threonine péptidos fosforilados [25] suele desglosarse en un nuevo paso y MS 3 putativo phosphopeptides se detectan automáticamente en un solo LC / MS plazo [26]. El resultado MS 3 espectros son a menudo informativo suficiente para identificar la correcta péptido y la fosforilación del sitio de búsqueda en una base de datos. Sin embargo, considerando la información de ambos EM 2 y EM 3 de datos a veces es necesario obtener una identificación inequívoca [27, 28].

En el presente trabajo se combinan el enriquecimiento de MOAC phosphoproteins selectiva y espectrometría de masas para un estudio detallado de la fosforilación de proteínas. Fosforilación sitio identificación se demuestra enriquecido para las semillas y las proteínas se logra utilizando los datos que dependen de MS 2, así como la pérdida provocada neutral-MS 3 fragmentación lineal en un espectrómetro de masas de trampa de iones. La estrategia propuesta es adecuada para identificar putativo phosphoprotein candidatos con una alta cobertura de secuencia y, al mismo tiempo que permite la identificación de los sitios de fosforilación de proteínas correspondientes. Para evitar falsos positivos identificación de los sitios de fosforilación sólo hits congruentes con EM 2 y EM 3 espectros fueron considerados en este estudio. Una cuidadosa de validación de los datos condujo a la identificación de 16 sitios de fosforilación en nueve semillas de las proteínas, algunas de ellas conocidas por ser fosforilados también en el sistema de mamíferos como ribosomal proteínas. Una comparación con microarraydata mostró que estas proteínas son principalmente semillas específicas.

Resultados
Estrategia general para la identificación de serina / threonine fosforilación de las plantas

Una visión general sobre la estrategia general para la identificación de serina / threonine fosforilación de las plantas se muestra en la Figura 1. La estrategia incluye el enriquecimiento de phosphoproteins utilizando MOAC, fosforilación de detección utilizando la tecnología de tinte fluorescente, y la determinación de la fosforilación sitio neutral con pérdida impulsada MS 3. Lo que es más importante, cada uno de los pasos del procedimiento da más confianza para una sólida identificación de los sitios de fosforilación y phosphoproteins. Para una descripción detallada consulte las secciones siguientes.

MOAC enriquecimiento de phosphoproteins

Las proteínas se extrajeron con fenol y enriquecido para phosphoproteins mediante cromatografía de afinidad metaloxide (MOAC) [18]. Las proteínas fueron separadas mediante SDS-PAGE y visualizarse con un fosfato específicos mancha seguida de tinción con coomassie R-250 (Figura 1]. Similares cantidades de proteína total de las muestras tomadas antes y después de MOAC (Figura 2B] van acompañados de fuertes diferencias en la phosphostain señal clara de enriquecimiento de phosphoproteins fuera del complejo de la muestra (Figura 2A]. Las bandas correspondientes a las proteínas de semillas enriquecidas con una señal fuerte en el phosphostain fueron extirpados, digeridos con tripsina, y analizados por espectrometría de masa (véase más adelante).

Identificación de los sitios de fosforilación in vivo en A. Thaliana proteínas de la semilla

A raíz de la estrategia propuesta (ver Figura 1] que después de una cuidadosa validación identificado 16 sitios en 9 de fosforilación de proteínas mediante la combinación de información de la EM 2 y EM de datos 3. La ventaja de usar la combinación de los datos se ejemplifica por la EM 2 y EM 3 espectros en la Figura 3. En el primer MS 2 fragmentación paso muy intenso fragmento de iones derivados de dominante neutral pérdida de ácido fosfórico se considera. Este espectro es a menudo por sí solo no es adecuado para la base de datos de búsqueda. Por otro lado, es una clara indicación de un phosphopeptide. La pérdida fragmento dominante neutral desencadena una segunda exploración en caso de que una fragmentación MS paso 3. La combinación de la EM 2 y EM 3 conduce a la fosforilación sitio clara identificación con el aumento de la confianza sobre la base de la neutralidad observada pérdida de ácido fosfórico [27, 28]. Otro nivel de confianza es proporcionado por la combinación de identificación de proteínas (véase la figura 1 y la cobertura de secuencia de proteínas en el cuadro 1] y el correspondiente sitio de fosforilación de proteínas en uno LC / MS análisis. Esta información está disponible en las estrategias de los que sólo se enriquecen phosphopeptides y la identificación de proteínas se basa únicamente en la detección de un phosphopeptide. La fosforilación sitios se muestran en la Tabla 1. Los sitios de las dos proteínas ribosomales se sabe son fosforilados en el ratón [29]. Para algunas de las proteínas identificadas después de MOAC, MS 2 datos, pero sugirió fosforilación MS se carece de datos 3. Todos estos ambiguos resultados no se incluyeron en la tabla. El análisis de la expresión génica de datos reveló que cinco de las proteínas identificadas son aparentemente semillas específicas (cuadro 1]. En particular, la fosforilación es muy probable que no confunded con o-sulfonation en estos experimentos desde péptidos sulfatados presentan la característica pérdida de 80 en lugar de 98 Da Da durante la colisión inducida disociación [30], que no conduce a la activación de un MS 3 espectro.

Reproducibilidad del método

El proceso de enriquecimiento se repitió usando A. Thaliana hoja y C. Reinhardtii proteínas. Patrones similares se observaron en SDS PAGE análisis combinado con fosfato y coomassiestaining (datos no presentados). Dos prominentes bandas, una de las muestras de semillas enriquecidas en alrededor de 65 kDa (mw correspondiente a la de la proteína con el mayor número de sitios identificados de fosforilación en el primer experimento), y uno de los enriquecido C. Reinhardtii muestra (por duplicado) en alrededor de 56 kDa, fueron seleccionadas para probar la reproducibilidad de la fosforilación sitio identificación. Con proteína de la semilla que después de la prueba de análisis de reproducibilidad de almacenamiento de la muestra durante 1 mes (véase el cuadro 2]. Reproducibilidad de todo el procedimiento incluyendo el enriquecimiento MOAC se demuestra por la reiterada identificación de los sitios de fosforilación en los 56 kDa C. Reinhardtii phosphoprotein (cuadro 2].

Fosforilación de esterol deshidrogenasa

Un sitio de fosforilación se identificó como serina 95 en una isoforma de la A. Thaliana esterol deshidrogenasas de cadena corta familia de genes. Estamos alineados secuencias de proteínas pertenecientes a la misma familia de A. Thaliana (A) y Sesamum indicum (Si) (Figura 4]. Que se muestra es la región que rodea el sitio de fosforilación. La región de interés es parte de un proyecto de NADP + vinculante de dominio [31] y muestra una alta homología. La fosforilación serina sitio se conserva en 6 de 8 secuencias. Los dos restantes secuencias (At4 y Si1) no muestran serina en el sitio de interés y podría pertenecer a un grupo separado.

Discusión

El enfoque descrito en este trabajo es adecuada la identificación fiable de la pantalla y de rutina para serina / threonine fosforilación de las proteínas vegetales. Varias líneas de evidencia se integren en la estrategia de modo que la identificación inequívoca de la fosforilación de proteínas posible: (i) Enriquecimiento de phosphoproteins basada en la afinidad de fosfato a MOAC, (ii) un phosphostain revela fosforilación de las proteínas y confirma enriquecimiento, (iii ) Gel de separación de las proteínas contribuye a garantizar un nivel elevado de confianza en la identificación de proteínas, y (iv) un método altamente selectivo basado en la espectrometría de masas específico para la fosforilación se utiliza para la identificación del emplazamiento.

Fosforilados se enriquecen con proteínas MOAC, un método que puede ser fácilmente adaptado a la muestra de interés, ya que es de bajo costo y los componentes necesarios están a disposición de todos. Para demostración MOAC phosphoprotein enriquecimiento se aplicó a A. Thaliana hoja de proteínas [18], A. Thaliana semillas y material Chlamydomonas reinhardtii cultivos de células (este estudio, la figura 2].

Los siguientes tinción con un colorante fluorescente phosphospecific es un uso fácil y rápido método para detectar las proteínas de fosforilación y sus cambios en geles. Sin embargo, la espectrometría de masas basado en la identificación del emplazamiento conduce a la información más detallada acerca de la regulación de determinados lugares. Esto es válido especialmente cierto en el caso de las proteínas en varios sitios fosforilados [5, 6]. Si bien no es posible con la tinción fluorescente para definir si es una proteína aislada o multiplicar fosforilados y en la que el aminoácido fosfato fracción se encuentra, esto puede hacerse mediante espectrometría de masas [32]. En consecuencia, enriquecido proteínas son digeridos y los péptidos se analizan en los experimentos en los que un nuevo caso de la fragmentación (MS 3), se activa cuando se pierde un péptido ácido fosfórico en el primer paso de fragmentación (MS 2). La información combinada de la EM 2 y EM 3 datos que se utiliza para obtener datos de alta calidad acerca de la secuencia de péptidos y su fosforilación sitio (véase también la figura 3A y 3B].

Dado que se trata de una prueba de concepto de estudio que no se han centrado en la identificación de todos los sitios de fosforilación presente en la fracción enriquecida, pero en la creación de un flujo de trabajo robusto y conveniente para el análisis in vivo de la fosforilación de proteínas en plantas. El principal inconveniente del método, en su estado actual es que la fosforilación de preferencia lugares de gran abundancia de phosphoproteins se detectan y que, a menudo, las proteínas se pueden asignar con fiabilidad, pero los datos sobre la phosphopeptides faltan. Sin embargo, este podría ser eludido por la separación de mezclas complejas utilizando cromatografía establecido antes de MOAC y / o por un acoplamiento phosphopeptide enriquecimiento paso a la proteína de enriquecimiento. Otro problema podría ser dephosphorylation se produzca durante o antes de gel de separación o de la muestra durante el almacenamiento. Esto podría también explicar las diferencias en la prueba de reproducibilidad. Sin embargo, la mayoría de los sitios de prueba podría ser encontrado y reproducen en un segundo experimento por lo tanto, confirmando la robustez del método. Sin embargo, si la muestra no es limitar la cantidad y la digestión después de la separación de enriquecimiento también puede ser realizada en solución sin SDS-PAGE. Esto, por supuesto llevaría a la desaparición de una confirmación paso en la estrategia.

Aunque la fosforilación de A. Thaliana semillas proteínas probablemente desempeña un papel crucial en el desarrollo y la latencia de semillas [33, 34], a nuestro conocimiento que esta es la primera vez que un amplio enfoque ha sido utilizado para identificar los sitios de fosforilación de proteínas en las semillas. En más de la mitad de los derivados de semillas identificadas phosphopeptides (9 de 16) la fosforilación sitios son identificados directamente por un vecino de prolina. Además, en tres sitios de los péptidos se encuentran adyacentes a los residuos de ácido aspártico. Esto puede ser debido a una mayor división en prolina y ácido aspártico residuos durante el proceso de fragmentación en el espectrómetro de masa que se ha descrito antes [35]. Curiosamente, lo hicimos encontrar dominante neutral pérdida en el respectivo MS 2 espectros, a pesar de que se informó recientemente de que la prolina y ácido aspártico que contiene phosphopeptides exhiben una pronunciada menos neutral pérdida de H 3 PO 4 en la fragmentación en un Q-Tof espectrómetro de masas [36 ]. Esta aparente diferencia se podría explicar por los diferentes tipos de instrumentos utilizados en los estudios o por la especial naturaleza de los investigados phosphopeptides. Ambos serina-prolina (SP) y serina-aspartato (SD, E), que contiene los sitios de fosforilación se postula como putativo quinasa sustratos [15]; SP es un MAP-kinasa motivo que coincide con la importancia de las MAP-cinasas en procesos celulares [37 ] (Véase también http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/protein_tools/protein_kinase_substrate_recognition.asp]. La mayoría de los identificados phosphoproteins parecen ser específicos de las semillas, ya que su expresión se informó a ser muy dominante, si no exclusivamente, expresadas durante esta etapa de desarrollo (véase el cuadro 1 y [38]].

Para varios de fosforilación parece ser bastante común como lo indica el hecho de que más de un sitio de fosforilación se encontró en 3 de los 9 proteínas. Los sitios identificados en las dos ribosomal son las mismas proteínas c-terminal de los sitios identificados en el ratón [29] por lo tanto, la adición de otra prueba, para la conservación de los sitios de fosforilación en todo distintas especies [39]. Fosforilación de las proteínas ribosomales P-c-en su terminal final también ha sido propuesto para Saccharomyces cerevisiaea, Rattus norvegicus, Trypanosoma cruzei, y Zea mays [40]. Se ha demostrado que la fosforilación de estas proteínas conduce a la degradación acelerada de la levadura [41], y esto podría también mantener cierto en el caso de A. Thaliana. Curiosamente, otros dos de los identificados phosphopeptides, pertenecientes a las proteínas de otra forma no relacionada con la proteína ribosomal P-También se comprobó que las fosforilados en su extremo c-terminal indicando la accesibilidad de la terminal de c-phosphopeptides de enriquecimiento, la digestión y la detección o un general Patrón, supuestamente para la degradación de la proteína.

La identificación de una proteína fosforilada con homología a un esterol deshidrogenasa de cadena corta (Sop2) parece ser especialmente interesante para el desarrollo de semillas. Estas proteínas se cree que desempeñan un papel vital en la planta de transducción de señales suscitado por esteroles [31, 42] y, por tanto, su fosforilación / dephosphorylation podría tener grandes implicaciones en el desarrollo de semillas. Serina 95 en la ELGpSPNVVTVHADVSKPDDCRR péptido derivado de Sop2 (que mostró ser fosforilados en A. thaliana) es altamente conservadas en cinco de las seis homólogos en A. Thaliana, así como en uno de cada dos homólogos en Sesamum indicum (ver figura 4]. Se encuentra en el NADP + vinculante dominio de la proteína [31] y podría ser importante para la enzima de especificidad y selectividad.

Métodos
Productos Químicos

Todos los productos químicos eran de Sigma (München, Alemania). El hidróxido de aluminio fue adquirida como hidróxido de aluminio hidratado (n º de pedido. A-1577, Sigma).

Semillas

A. thaliana (ecotipo Columbia) las semillas se tomaron de un lote de semillas, de la casa.

Chlamydomonas reinhardtii cultura

C. reinhardtii (wildtype CC-125) fue cultivada durante 7 días en 16 / 8 horas luz / oscuridad en régimen de cultivo líquido que contiene PAT Medio [43]. Las células fueron cosechadas en el período de luz y centrifugada durante 10 min a 4000 rpm. El sobrenadante fue descartado y el Pellet se utilizó para la extracción de proteínas.

Desnaturalizado extracción de la proteína A. Thaliana semillas y C. Reinhardtii

A. thaliana proteínas de las semillas y C. Reinhardtii proteínas se extrajeron mediante la adición de una mezcla de tres volúmenes de amortiguación-fenol saturado (15 ml) y un volumen de 50 mM Hepes KOH, pH 7,2 con 1% β-mercaptoetanol, 40% de sacarosa, y 40 mM NaF (5 ml) a 2 g de semillas terreno en nitrógeno líquido a una bolita o derivados de 100 ml de C. Reinhardtii cultura, respectivamente. Después de la mezcla durante 20 minutos a 4 ° C, las proteínas se precipitaron fuera de la fase de fenol con cinco volúmenes de hielo acetona fría durante la noche a -20 ° C. El pellet se lavó dos veces con el 100% de metanol helado y secado de aire durante 15 min.

Enriquecimiento de phosphoproteins Metal Oxide mediante cromatografía de afinidad (MOAC)

El pellet obtenido por la extracción de la proteína desnaturalizada fue disuelto en 1,5 ml de buffer de incubación con 30 mM MES, 0,2 M de potasio glutamato, aspartato de sodio 0,2 M, 0,25% Chaps, 8 M urea y con un pH de 6,1. 1,5 ml de un 0,5 mg / ml de solución de proteína se utiliza para la incubación de 30 minutos con 80 mg de AlOH 3 a 4 ° C (AlOH 3 fue una vez antes de lavar con la incubación de amortiguación se ha descrito anteriormente). La incubación fue seguido por cinco pasos de lavado de 1,6 ml y un paso de 0,8 ml. Por último, las proteínas se eluida de la matriz por incubación con 800 μ l de 100 mM de potasio pirofosfato buffer de pH 9,0 con 8 M urea durante 30 min a TA. Las proteínas se precipitó con metanol / cloroformo antes de gel de carga descrita por Wessel y Fluegge [44] y cerca de la mitad de la fracción proteica se eluyen cargaron en el gel.

Determinación del contenido de proteínas

Se determinaron las concentraciones de proteína a través del tinte vinculante método de Bradford, tal como se describe anteriormente [45], utilizando como norma ovoalbúmina. Cada medición se realizó por triplicado y los valores medios se utilizaron.

SDS-PAGE, Phosphostaining, y la tinción de Coomassie

Pellets derivados del metanol / cloroformo precipitaciones fueron disueltos en 2 × SDS muestra buffer (90 mM Tris, pH 6,9, el 20% de glicerina, 2% SDS, 0,02% de azul de bromofenol, y 100 mM TDT) y aproximadamente 30 μ g fueron sometidos a SDS-PAGE (800 μ l MOAC eluido fracción se precipitó y se disuelven en 40 μ l de 1 × SDS muestra de amortiguación). Después de la separación de proteínas se tiñeron con Pro-Q diamante mancha (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), fundamentalmente a raíz de la instrucciones en el manual. Por especificidad, encontramos el intercambio de fijación solución una vez (después de 30 min) y dejando a los geles de fijación en la solución de la noche a la mañana a ser crucial pasos. Fosforilación fue visualizado utilizando un chemdoc estación y un filtro de 550 nm. Después de la visualización phosphostain geles fueron lavados tres veces con ddH 2 O y manchadas de coomassie.

En el tríptico-gel Digest

De las proteínas spots que muestran una fuerte señal después de phosphostaining fueron extirpados y digerido con tripsina durante la noche, tal como se describe antes [46]. Los péptidos se extrajeron de los gel en tres pasos consecutivos crecientes porcentajes de acetonitrilo (5%, 50%, 90% cada uno con 1% de ácido fórmico).

Fosforilación de proteínas y de la identificación del emplazamiento mediante nano-lineal LC-MS-iontrap

Péptidos fueron cargados directamente en un ProteoSpher ® Micro columna (0,5 mm × 15 mm) con un caudal de 3 μ l / min y separados 85 min en un gradiente de 80% A (0,1% ácido fórmico, y el 2,5% de acetonitrilo en agua) El 100% B (0,1% ácido fórmico en el metanol). Separación y mediciones se realizaron con un nano-LC-bomba (Agilent 1100), junto a una trampa de iones LTQ (Thermoelectron) con un nano-ESI-fuente. El voltaje se aplica directamente a la solución analizada usando un T-pieza. Para identificar tríptico péptidos, phosphopeptides y sitios de fosforilación, automática de los datos que dependen de la adquisición se realizó consiste en una exploración completa (m / z 400-2000), una posterior MS 2, y un neutral pérdida de exploración de 98, 49, o 32.7 (H 3 PO 4 para el +1, +2, y +3 iones con carga, respectivamente) en los cinco más abundantes fragmentos MS 2. Un MS 3 escanear automáticamente fue recogido en la correspondiente pérdida neutral fragmentos de la MS 2 eventos de exploración. Los péptidos se identificaron mediante búsquedas en los espectros contra un A. Thaliana http://www.arabidopsis.org/ base de datos o en contra de la C. Chlamydomonas base de datos que contiene la versión 2,0 http://genome.jgi-psf.org/chlre2/chlre2.download.html tripsina y queratina secuencias utilizando el algoritmo de Sequest (ThermoElectron, Dreieich, Alemania) y de filtrado de los resultados con un Xcorr de 2,0, el 2,5 , Y el 3,5 por individual, doble, triple y de iones con carga, respectivamente. Proteína hits fueron aceptadas cuando al menos tres péptidos con las correspondientes Xcorr criterios descritos anteriormente se identificaron. Los espectros derivados de phosphopeptides fueron verificadas manualmente (cargo del Estado y la identificación de la EM 2 y EM 3 espectros se verificaron por su concordancia).

Secuencia alineación

Secuencias se derivan de NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein alineación y se realizó con ClustalW http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ con la Ajustes por defecto.

Contribuciones de los autores

FW llevado a cabo la optimización de MOAC semillas con material, la fosforilación de identificación sitio usando MS y MS 2 y 3 participaron en la escritura y redacción del manuscrito. WW redactó la concepción de este estudio, aconsejó a lo largo del proyecto y participó en la escritura y redacción del manuscrito.

Agradecimientos

Damos las gracias a Megan McKenzie para la revisión del manuscrito. Damos las gracias a la Sociedad Max Planck para el apoyo financiero y Mirko Glinski, Stefanie Wienkoop, y Mark Stitt valioso para el debate. Por último, damos las gracias a Daniel Karcher, Dietrich Köster, y Christian Bölling de proporcionar C. Reinhardtii, Regina Stark y Karsten Oelkers de asistencia técnica.