Immunity & ageing : I & A, 2005; 2: 15-15 (más artículos en esta revista)

Constitutiva de la degradación de I α κ B en los linfocitos T humanos está mediada por calpaina

BioMed Central
Subramaniam Ponnappan (sponnappan@uams.edu) [1], Sarah J Cullen (scullen@uams.edu) [2], Usha Ponnappan (uponnappan@uams.edu) [1]
[1] Departamento de Geriatría de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas, Little Rock, AR, EE.UU.
[2] Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas, Little Rock, AR, EE.UU.
[3] VA Investigación Médica, Centro de Veteranos de Guerra de Arkansas sistema de atención de la Salud, Little Rock, AR, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

La activación inducida por la inducción del factor de transcripción NF κ B en los linfocitos T está regulada por su inhibidor I κ B α. NF κ B activación se ha demostrado que se produzcan, ya sea por fosforilación en residuos de serina 32 y 36 del inhibidor, me α κ B, seguido por ubiquitination y la degradación del inhibidor de la proteasoma 26S, o por un mecanismo independiente-proteasoma de la fosforilación de tirosina, pero no la degradación. Sin embargo, el mecanismo subyacente constitutiva regulación de los niveles del inhibidor, κ B, en la primaria de los linfocitos T humanos, está aún por definirse.

Resultados

Demostramos aquí, la participación de una vía independiente-proteasoma constitutiva de regulación de la I α κ B en los niveles primarios de linfocitos T humanos. Pretratamiento con un inhibidor de la calpaina células permeables, E64D, pero no con un inhibidor del proteasoma específicos, lactacystin, bloquea el estímulo independiente I-κ B α degradación de las células T humanas primarias. Sin embargo, E64D pre-tratamiento no impacto en la I κ B α siguientes niveles de estimulación, ya sea con o pervanadate TNF α. Otras isoformas del inhibidor, κ B β, y γ κ B, parecen no estar sujetos a la misma normativa ligando-independiente. A diferencia de informes anteriores la disminución de la degradación inducida por ligando de I κ B α en las células T de las personas mayores, la degradación constitutiva no exhiben un declive relacionado con la edad, lo que demuestra-proteasoma independiente regulación de la actividad.

Conclusión

Nuestros estudios un papel de apoyo para una E64D sensibles en la regulación de la proteasa constitutivos de los niveles I α κ B en células T, independiente de la participación del proteosoma 26S, y sugiere una función biológica para constitutivos de la degradación del I κ B en células T α.

Antecedentes

Factor de transcripción NF κ B existe como homo-hetero-o-dímeras complejos, que consiste en la Rel familia de proteínas [1]. Estos dímeros funcionan como reguladores transcripcionales esenciales para una gran variedad de procesos celulares que van desde la progresión del ciclo celular a la inducción de respuesta inmune de genes [2]. En los linfocitos T humanos, al igual que la mayoría de las otras células, NF κ B existe en el citoplasma unido a su inhibidor I κ B I α o β κ B, predominante miembros de la I κ B familia de proteínas [3]. Un gran afinidad por RelA y c-Rel permite que estas moléculas inhibitorias de asociarse con las proteínas y, por tanto, restringir la localización nuclear de la NF κ B moléculas. La mayoría de los estímulos responsables de la inducción de NF κ B se ha demostrado que ni invocar la fosforilación de la serina inhibitoria ubiquitination seguidos de las proteínas y la degradación a través de la vía del proteasoma 26S, o que implican la activación de la fosforilación de la tirosina, como en el caso del estrés oxidativo mediado por los estímulos, que es independiente De la degradación proteasomal mecanismo [4, 5]. Mientras que la estimulación inducida por la modificación de I κ B ha sido ampliamente estudiado, se sabe poco acerca de la regulación de la I constitutiva κ B, la proteína en las células T bajo condiciones de reposo.

Estudios recientes en líneas de células B han demostrado que me κ B α, pero no me κ B β, es constitutivamente degradadas y es importante para la inducción de NF κ B constitutiva actividad [6, 7]. Estos estudios indican que la degradación de I constitutiva κ B está mediada por una vía independiente del proteasoma. Los estudios también sugieren que el calcio dependiente de la proteasa, la calpaina, puede ser importante en la regulación de los niveles de I κ B α [8 - 10]. Estos estudios nos llevó a investigar si la misma regulación de la "constituyente", es decir, independiente del estímulo de los niveles I κ B α ocurre en la enseñanza primaria linfocitos T. A diferencia de las células B, B, la inducción de NF κ κ B, y me informó de la regulación en las células T está claramente mediada por la activación de los estímulos externos, con poca o ninguna constitutiva nuclear NF κ B presente en virtud de la condición basal.

Además, como la regulación NF κ B es significativamente alterada en el curso de envejecimiento en las células T humanas, que examinó si constitutiva regulación anormal puede ser la base de disminuir la activación mediada por la inducción. El empleo de células T primarios obtenidos a partir de donantes humanos, que evalúa si el envejecimiento afecta a la regulación de los niveles constitutivos de I κ B α. La hipótesis de que, como constitutivos de los niveles I κ B α fueron relativamente al margen en la edad primaria de las células T, lo que puede reflejar un mínimo efecto de la edad sobre la actividad de la calpaina en células T. Ahora informe que E64D sensibles proteasa, la calpaina, es responsable de regular los niveles constitutivos de I α κ B, pero no me κ B I β o γ κ B, células T en humanos. Además, el calcio-ionóforo mediada aumento de la actividad de la calpaina en células T inducida de jóvenes donantes mostraron sistemáticamente mayor actividad en las primeras tiempo después de la activación de puntos, en comparación con las personas de edad. Sin embargo, el total de actividad de la calpaina medida al término de 60 minutos no demostró significativa modulación en función de la edad del donante. Así, mientras que la cinética de activación de la calpaina parece estar alterado en las células T de las personas de edad, la actividad acumulada durante un período de tiempo no se ve afectado. Además, nos demuestran que el envejecimiento no afecta significativamente estímulo independiente de la degradación de I α κ B mediada por calpaina, lo que demuestra-proteasoma regulación independiente. Así, el sistema de la calpaina participa en la regulación de la I constitutiva κ B α, y, por tanto, la NF κ B vía de señalización, en condiciones de reposo, en la primaria de los linfocitos T humanos.

Resultados
El tratamiento con una célula permeable cisteína inhibidor de la proteasa, E64D, inhibe constitutivos de la degradación del I α κ B, pero no me κ B I β o γ κ B en los linfocitos T de jóvenes y de personas mayores donantes

Se examinó el efecto de una célula permeable cisteína inhibidor de la proteasa, E64D, sobre los niveles basales de I κ B α, β κ B, y yo γ κ B, inhibidores del factor de transcripción NF ubicuo κ B. Emplear primaria de las células T y el Western Blot, utilizando anticuerpos específicos para el inhibidor de isoformas, ya demostrar que los niveles de I constitutiva κ B α, pero no me κ B β o yo κ B γ son moduladas por el pretratamiento con E64D. Los resultados presentados en la fig. 1, demostrar que el pretratamiento con E64D inhibe significativamente constitutivos de la degradación del I α κ B, con poco o ningún efecto sobre ninguna de I κ B β (fig. 2] o yo κ B γ (fig. 3]. Los niveles de I κ B α antes del tratamiento con E64D son significativamente inferiores, que la observada después del tratamiento, lo que indica la inhibición de la degradación.

Como he κ B α degradación inducida por las señales exógenas ha informado de que se diferencialmente regulados durante el envejecimiento [8, 9], el próximo evaluó el efecto del tratamiento con E64D κ B en la I-α T en células obtenidas de donantes jóvenes y ancianos. Los resultados presentados en la fig. 1, demostrar que, independientemente de la edad de los donantes de células T, E64D pretratamiento significativamente protegidas I κ B α niveles constitutivos de la degradación, y tuvo poco impacto en isoformas, β κ B (fig. 2] y γ κ B (fig. 3] . Por lo tanto, no influye en el envejecimiento cisteína proteasa-sensible constitutivos de la degradación del I κ B en células T α.

La inhibición de la actividad de la proteasa cisteína E64D no afecta el TNF-α induce la degradación de I α κ B en células T

El tratamiento de las células T mediante la activación de los estímulos como, anti-CD3 o TNF α, han demostrado inducir factor de transcripción NF κ B por una señal de activación inducida, proteasoma mediada por la degradación del inhibidor I κ B α. Para determinar si dichas señales inducidas por la degradación de I κ B α fue sometida a la regulación de la cisteína proteasas, que examinó el papel de E64D en la activación inducida por los niveles de I κ B α. Los resultados se muestra en la Fig. 4 y 5A, demuestran claramente que la activación de las células T con TNF α induce la degradación de I κ B-α, independientemente del tratamiento con E64D. Esto indica que E64D sensibles proteasa no modulan o impacto en la activación inducida, proteosoma dependiente de la degradación de I κ B α. Cabe señalar que una lenta movilidad I κ B α banda aparece en otro momento de los puntos (20 y 30 min.) TNF activado en las células de las personas de edad. Creemos que esto representa modificados I κ B α. Futuros experimentos determinar la naturaleza precisa de esta modificación. Como la degradación del proteasoma dependiente de la I κ B α es claramente regulados diferencialmente en las células T de jóvenes y de personas mayores donantes, el próximo examen, si E64D mediada por la inhibición de la constitutivos diferencialmente los niveles de impacto sobre la degradación de I κ B α en las células T de las personas de edad. Los resultados presentados en la fig. 5A, demuestran que el tratamiento previo con E64D no influir en la activación inducida por la degradación de I κ B α. Por lo tanto, independientemente de la edad de los donantes, el tratamiento con E64D no modulan la activación inducida por la degradación de I κ B α.

El pretratamiento con E64D no interfiere con la activación inducida por la modificación pervanadate mediada por células T en el tratamiento

Como siguiente paso en el análisis, hemos examinado el efecto del tratamiento previo con E64D sobre los modos de activación que no se trate de señales inducidas por la degradación de I α κ B, como los que la mediación de pervanadate. Similar a la observación con TNF α, el tratamiento previo con E64D no impacto en la activación inducida I κ B α modificación en las células pre-tratados con pervanadate, independientemente de la edad del donante (fig. 4 y 5B]. Es importante señalar que κ B α en las células tratadas con pervanadate demuestran claramente más lento que representa la movilidad de banda de tirosina fosforilados I-κ B α. Por lo tanto, independientemente de la activación de los estímulos (o Pervanadate TNFa), E64D parecía no impacto en la activación inducida por la modulación de I κ B α. NF κ B dependientes luciferase actividad también se ensayaron siguientes pervanadate tratamiento, en la presencia o ausencia de E64D. De acuerdo con los datos obtenidos con I α κ B, E64D pretratamiento, no impacto en la NF κ B dependientes luciferase actividad, (datos no presentados).

El tratamiento de células T con inhibidor del proteasoma, Lactacystin, no influye constitutiva I κ B-α niveles, que a diferencia de la mediación de E64D

Como he κ B-α es constitutivamente degradada por la proteasa cisteína E64D sensibles, el próximo evaluó si el tratamiento con un inhibidor del proteasoma también interfiere con la degradación de este basal. Los resultados presentados en la fig. 6A, demuestran claramente que el pretratamiento con lactacystin, un inhibidor específico del proteasoma, no para influir en los niveles basales de I κ B α. Así, lo que sugiere que la regulación basal o constitutiva de la I κ B-α no depende de la proteosoma. Para garantizar que hizo inhibir lactacystin proteasoma en la dosis empleada, es decir, control positivo, las células T de jóvenes y de personas mayores donantes fueron pretratadas con lactacystin o no se trata. Estas células fueron sometidas a tratamiento con TNFa. Como se observa en el gráfico. 6B, TNFa en el tratamiento de jóvenes inducidos por la degradación de I α κ B, en comparación con los controles no tratados. El pretratamiento con lactacystin y luego TNF α (T + L), inhibe la degradación mediada por TNFa. Como se informó anteriormente, lactacystin es sólo mínimamente eficaz de las células T en las personas de edad.

El tratamiento de células T con lisados purificada calpaina, imita constitutivos de la degradación del I κ B α

Como E64D pretratamiento específicamente inhibe la degradación de I basal κ B α, que implican a un papel de las proteasas cisteína como en la regulación de la calpaina constitutivos de los niveles I α κ B, la prueba de un papel directo para el tratamiento de la calpaina por citosólicas lisados obtenidos de las células T con una preparación purificada de la calpaina en In vitro de ensayo. Lisados de células T igualado para la proteína de donantes jóvenes se agruparon y sometidos a la lisis en presencia de la calpaina purificado, como se indica. La degradación de I α κ B fue determinada por la medición de los niveles detectables de I κ B α por SDS-PAGE y Western Blot, utilizando anticuerpos a I κ B α. Los resultados presentados en la fig. 7, muestran que la exposición a 0,01 U de la calpaina, lisados de las células T demostrar bajar los niveles de I α κ B, con indicación de la calpaina la degradación mediada, que es inhibida por el pretratamiento con E64D.

Cinética de inducción de la actividad de la calpaina ionóforo de calcio tras el tratamiento, es modulada por la edad, pero no tiene impacto en la actividad general de la calpaina eficaz en las células T

Para evaluar el efecto de la edad sobre la actividad de la calpaina, se obtuvieron las células T de jóvenes y ancianos voluntarios sanos y los examinó la actividad de la calpaina endógeno. Como se demuestra en la fig. 8, la calpaina la proteasa específica hidrolizado actividad parece ser ligeramente superior en el tiempo 0 en las células T de los donantes jóvenes, sin embargo, ionóforo de calcio inducida por aumento de la actividad de la calpaina no fue significativamente diferente entre las células T de jóvenes y de personas mayores donantes. De hecho, el total de la actividad hidrolizado medida al término de 60 minutos no fue estadísticamente diferente entre células obtenidas de los dos grupos de edad. Por lo tanto, la actividad sigue siendo eficaz la calpaina no afectado por la edad de los donantes de células T.

Discusión

Calpaina sistema ha demostrado ser el principal constituyente de proteasas implicadas en la degradación de I κ B α [7 - 9]. Delimitación exacta de la región de I κ B α necesario para la degradación de la calpaina como resultado la identificación de la C-terminal de 39 aminoácidos que contiene la secuencia PLAGAS ser crítico para la degradación in vitro por Shumway y Miyamoto [6]. Sin embargo, sus estudios, la calpaina demostrado que no era responsable de la degradación de I α κ B en la primaria células B [6]. A diferencia de las células B, que expresan constitutiva nuclear NF κ B, importante expresión de NF nuclear κ B en células T se produce predominantemente siguientes estímulos inducidos por la activación. Pocos estudios, hasta la fecha, han incursionó en el reglamento constitutiva de NF κ B en células T en reposo. En nuestros estudios actuales, que emplean a E64D, demostrar especificidad constitutivos de la degradación de I α κ B mediada por calpaina en primaria de los linfocitos T humanos. La inhibición de esta degradación en presencia de E64D, una celda permeable, cisteína inhibidor de la proteasa, apoya la posibilidad de que participen de la actividad de la calpaina en este proceso. Dado el papel central de NF κ B en la supervivencia celular y señalización [11], constitutiva de la degradación del inhibidor de la I α κ B es vital para comprender el estado de equilibrio cinética de la regulación de células T en el contexto de la activación inmune.

Nuestros estudios también demuestran que la degradación de I κ B α bajo condición de descanso es refractaria a los inhibidores del proteasoma, Lactacystin, pero no a inhibidores de la calpaina, E64D. Por lo tanto, a diferencia de que informó de la activación inducida por la degradación [12], constitutiva de los niveles I κ B α parecen no estar sujetos a la reglamentación proteosomal. Esto es particularmente importante dado que nuestros resultados anteriores muestran claramente que la degradación de inducible I κ B α está sujeta a un "efecto de la edad", debido a la acción inhibidora del envejecimiento sobre proteosoma asociada a la actividad proteolítica [13, 14].

Calpaina dependientes de la degradación de I α κ B ha demostrado que se producen en otros tipos de células, que son refractarios a la actividad del proteasoma [11]. Así pues, parece, que la degradación de I κ B α puede producirse a través de dos vías mutuamente excluyentes, depende de el estado de las células, es decir, de descanso frente a activarse. Calpaina sistema desempeña un papel en la constituyente, pero no me induce la degradación de α κ B, mientras que la degradación del proteasoma dictados niveles inducidos en las células T [6, 12]. Actividad de la calpaina ha demostrado ser involucrados en la degradación de I α κ B, en determinadas condiciones, de la infección viral [8]. Por lo tanto, es probable que esta capacidad constitutiva de la degradación puede ser aprovechado por ciertos agentes patógenos.

A diferencia de la mayoría predominante inhibidor I κ B α, β I κ B, y yo κ γ isoformas B, que parecen no ser susceptibles a la degradación mediada por calpaina. Los recientes experimentos elegante por Miyamoto et al implicar la cinética de degradación similar para I isoforma α κ B en líneas de células B [6]. Sobre la base de la importancia de esa degradación de los acontecimientos en la inducción constitutiva de NF κ B en células B, la función constitutiva de la regulación de NF κ B por la vía de la calpaina en primaria de las células T se examinan aquí. Los resultados de estos experimentos claramente proporcionar una base biológica para el estímulo de la degradación independiente, y su importancia en el mantenimiento de la NF κ B en la supervivencia celular, que no es evidente, a no ser impugnada por los estímulos capaces de inducir la apoptosis (datos no presentados).

Nuestros estudios sobre el efecto de la edad sobre constitutivos de la degradación del I α κ B, claramente implica ausencia de cualquier efecto de la edad del donante en el mantenimiento de la proteasa sensible E64D / actividad de la calpaina responsable de esta degradación. Los experimentos realizados para determinar el impacto del envejecimiento sobre la actividad de la calpaina indican claramente que la actividad es eficaz sin cambios durante el envejecimiento. Esto también se refleja en los niveles de I α κ B en células T en reposo de los donantes jóvenes y ancianos, que no se ven afectadas por la edad. Así, a pesar de la pérdida en la actividad del proteasoma que acompaña el envejecimiento, la degradación mediada por calpaina de I κ B α sigue siendo la misma, lo que demuestra poco o ningún papel de la regulación en la calpaina proteasomal mediada vía que regula I κ B α niveles. Esta observación está de acuerdo con informes anteriores de nuestro laboratorio demostraron que un mínimo efecto de la edad sobre la actividad proteolítica celular global, en especial, chymotryptic actividad de las células T [15]. También es interesante señalar que los informes sobre la actividad de la calpaina como una función de la edad avanzada, han sido conflictivos, con alguna que demuestra el aumento de la actividad, [16, 17] y otros, disminución de la actividad [18, 19], sin embargo, estos estudios, ya sea utilizado otros Tipos de células, los sustratos empleados exógenos o lisados de células para la evaluación de la actividad. Utilizando un modelo fluorogenic sustrato permeable que es la célula, ya demostrar que, ionomycin-inducible actividad de la calpaina específicos, inhibirse por E64D, no se ve afectada, sin embargo, observado en la actividad proteolítica de células T lisados parecía seguir diferentes en la cinética de las células de los jóvenes que los Observados en las personas de edad. Es importante destacar que, mientras que el 90% de la actividad en las células de los jóvenes está claramente inhibirse por el tratamiento con E64D, sólo el 50% de la actividad podía inhibirse en las células de las personas de edad (datos no presentados).

Aunque constitutivos de la degradación del I κ B α es claramente regulados por E64D sensibles calpaina en células T, la activación inducida por la degradación, parece no afectado por el tratamiento previo con E64D. Del mismo modo, mientras que la activación inducida por la degradación de I κ B α es sensible a la inhibición del proteosoma, constitutiva no se ve afectado por la degradación del pretratamiento con lactacystin, un inhibidor del proteasoma. Evidentemente, la susceptibilidad de I κ B α a la degradación no sólo es dependiente sobre el estado de activación, pero también en la especificidad de la proteasa. La importancia fisiológica de la degradación de los dictados claramente inhibidor de la inducción de NF κ B, y por lo tanto anti-apoptóticos o capacidad de supervivencia, en virtud de uninduced condiciones. Por lo tanto, la regulación de la I κ B α niveles en estado basal de una célula es fundamental y se está en condiciones de activación inducida por las señales de supervivencia. Estos resultados también indican que la calpaina trabaja independientemente de la vía de la fosforilación, ya que ni TNF ni pervanadate que inducen fosforilación serina y tirosina, respectivamente, fueron afectados por el inhibidor. Además, si bien la activación del proteasoma dependiente inducida por vía de la degradación, así como la vía del proteasoma se ha demostrado que se comprometa en las células T durante el envejecimiento, la actividad de la calpaina claramente parece ser aún funcional, y es afectada por la edad avanzada.

Conclusión

En resumen, hemos demostrado que los niveles basales de I α κ B, pero no me κ B I β o γ κ B están sujetos a la reglamentación por E64D proteasa sensible, y puede ser imitaron por el pretratamiento con la calpaina. La regulación de la I κ B α niveles de cisteína proteasa parece tener ningún efecto sobre la activación inducida I κ B α o en otras isoformas de I κ B, independientemente de los estímulos empleados. Además, parece que la interferencia con esta disminución de la degradación de I basal κ B α no impacto en la supervivencia celular bajo condiciones de reposo.

Métodos
Materiales

Fluorocromo etiquetados anti-CD3, y FITC y PE-etiquetados isotipo controles se obtuvieron de Sigma Chemical Co (St. Louis, MO). Anti IgG acoplado a peroxidasa de rábano se obtuvo de BD-Transduction Laboratories (Lexington, KY). Todos los demás eran de anticuerpos Santa Cruz Biotech (Carlsbad, CA). Aumento de Chemi-luminiscencia reactivos fueron de Amersham (Arlington Heights, IL). Todos los productos de química fina a menos que se menciona se obtuvieron de Sigma Chemical Company, (St. Louis, MO.), Electroforesis suministros y peso molecular normas de BioRad (Richmond, CA.). E64D y lactacystin eran de Calbiochem (CA). Sustrato para Calpain fue de sondas moleculares, (Eugene, OR).

Sujetos humanos

La sangre fue obtenida de individuos sanos que viven en la comunidad. Jóvenes donantes tenían entre 21 y 30 años de edad y de los donantes tenía entre 65 y 85 años de edad. Un mínimo de al menos cuatro pares de donantes han sido utilizados en cada experimento. Ambos jóvenes y personas mayores donantes fueron de buena salud física y mental, no tenía aparente enfermedad como se sugiere en una elaborada historia de selección y no fueron en ningún medicamento que afectan directamente el sistema inmune durante el curso de este estudio.

Aislamiento de linfocitos T

Se obtuvo sangre periférica y las células T fueron purificados y mantenido en medio de cultivo RPMI 1640 que se describió anteriormente (20). Magnética clasificación de la selección negativa se utilizó para aislar las células T CD3 +. Pureza de las células T aisladas se determinó por citometría de flujo utilizando el anticuerpo anti-CD3 conjugado con FITC. Las poblaciones fueron 90-95% puro. El tratamiento de las células T (20 × 10 6 células / ml) con pervanadate (100 μ M, recién preparada antes de su uso) se llevó a cabo para indicó veces a 37 ° C, antes de lisados de células se prepararon. Para experimentos con el uso de un inhibidor, las células fueron tratadas con E64D a 50 μ M durante 45 minutos.

Western Blot

Citosólico extractos de Western Blot fueron preparadas por homogeneización de las células de buffer de lisis (1 mM Hepes, 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2 y 1 mM orthovanadate sodio, y el 0,5% NP-40) (20). Los siguientes reactivos se añadirá a todos los buffers antes de su uso: 0,5 mM dithiothreitol (DTT), 0,5 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), y 10 μ g / ml cada una de la aprotinina, leupeptina, y el inhibidor de tripsina de soja. El contenido de proteína citosólica de los extractos fue determinada por medio del ensayo de la proteína BioRad. Cell lisados igualado de la proteína (40 μ g) fueron resueltas por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), transferidas a nitrocelulosa, inmuno-borró con anticuerpos específicos / s, y detectado usando anti-IgG acoplado a peroxidasa de rábano seguido de Mejora de Chemi-luminiscencia (ECL). Cuando sea posible las muestras de jóvenes y de personas mayores donantes fueron resueltas en el mismo gel, pero en experimentos donde se analizaron diferentes tratamientos, las muestras de los jóvenes y las personas de edad se resolvieron en geles diferentes, pero son administrados de manera simultánea, a fin de evitar entre y dentro de la variabilidad experimental. Resolución de muestras en diferentes geles no influir en el resultado de los resultados.

Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones proporcionadas por NIH RO1 AG13081, MO1RR1288 y, en parte, por el uso de las instalaciones de la VA Medical Center, Little Rock, Arkansas. Agradecemos la asistencia técnica de la señora Virginia Fitzhugh y la asistencia prestada por el Centro de Investigación Clínica General, en la recogida de muestras.