Journal of Autoimmune Diseases, 2005; 2: 10-10 (más artículos en esta revista)

Perfiles de autoanticuerpos en el suero de pacientes con fiebre Q: caracterización de antígenos por inmunofluorescencia, inmunoblot y análisis de secuencias

BioMed Central
MT Camacho (mtcamacho@eresmas.com) [1], me Outschoorn (ioutscho@isciii.es) [2], A Tellez (atellez@isciii.es) [1], Sequí J (jsequi.hciii @ salud.madrid. Org) [3]
[1] Departamento de Orientación Diagnóstica. Centro Nacional de Microbiologia. Instituto de Salud Carlos III. Ctra. Majadahonda-Pozuelo 12,5 kilometros. 28080-Madrid. España
[2] Departamento de Respuesta Inmune. Centro Nacional de Microbiologia. Instituto de Salud Carlos III. Ctra. Majadahonda-Pozuelo 12,5 kilometros. 28080-Madrid. España
[3] Servicio de Inmunología. Hospital Carlos III. Imsalud. C / Sinesio Delgado, n ° 10. 28029-Madrid. España

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Resumen

Los informes recientes han demostrado que algunos de los aspectos inmunológicos de la fiebre Q, una rickettsiosis causada por Coxiella burnetii, podría estar relacionada a la libre antígeno respuestas. El objetivo de este estudio fue determinar la especificidad de la respuesta de autoanticuerpos de los pacientes agudos y crónicos con Coxiella infecciones. Músculo liso y músculo cardíaco de autoanticuerpos específicos se observaron en porcentajes significativos en forma aguda o crónica pacientes afectados de fiebre Q en comparación con los voluntarios sanos. Además, la incidencia del músculo cardíaco específica de autoanticuerpos fue significativamente mayor entre los pacientes con enfermedades crónicas en comparación con los pacientes gravemente enfermos. Además, una banda de 50 kD de un extracto HeLa se detectó en la mayoría de los sueros de las personas con infecciones crónicas y la secuencia anterior análisis sugiere que este antígeno presentan un alto grado de homología con el factor humano elongación actina alfa 1. Investigación adicional será necesario para confirmar si los anticuerpos humanos que podrían ser citoesqueleto proteínas de importancia clínica en la infección crónica fiebre Q pacientes.

Antecedentes

La fiebre Q es una rickettsiosis humanos distribuidos en todo el mundo que fue descrito por Derrick en 1937. Burnett Cox en Australia y en los Estados Unidos aisladas su agente causal casi simultáneamente, por lo que fue denominado Coxiella burnetii [1, 2]. La fiebre Q es la infección aguda suele ser asintomática o libre Coxiella limitado, pero es una bacteria intracelular que puede persistir dentro de los macrófagos de acogida conduce a complicaciones crónicas como la endocarditis, la hepatitis, la meningitis, las infecciones de hueso o síndrome de fatiga crónica [3 - 6]. El diagnóstico de la fiebre Q es por lo general sobre la base de procedimientos serológicos porque el aislamiento de la bacteria es difícil y peligroso y requiere de laboratorios de bioseguridad de nivel 3 [7]. Coxiella es exclusivo de su variación antigénica fase que parece implicar cambios en lipopolyssacharide [2, 4, 8]. I fase virulenta bacteria se aísla avirulent natural de la infección mientras que la fase II se produce después de los pasajes de serie. Aunque los factores que determinan la presentación clínica de la fiebre Q, aún no están esclarecidos, la variación de C. Burnetii cepas, la vía de infección, la inmunidad de acogida y el tamaño del inóculo han estado implicados en la evolución de la enfermedad [2, 4, 5].

Enfermedades autoinmunes se definen como las secuelas patológicas de las respuestas autoinmunes. Los mecanismos precisos por los que se indujo aún están en discusión, pero genéticos, hormonales y de los factores ambientales han sido implicados [9, 10]. La idea de que los agentes infecciosos pueden representar uno de los principales factores ambientales iniciación de las respuestas autoinmunes es ahora generalmente aceptada y de los mecanismos de inducción están siendo reexaminada [11 - 13]. Microorganismos intracelulares, en particular los asociados a la infección persistente o latente, se han desarrollado estrategias para modular la respuesta inmune y, por tanto, sobrevivir dentro de la célula huésped [14]. En estas circunstancias, estos microorganismos no sólo iniciar, sino también mantener una reacción anómala de que daría lugar a la aparición de características autoinmune en pacientes predispuestos. Molecular homología con secuencias de acogida, la estimulación policlonal de B y T clones, la estimulación de citoquinas, más de expresión de las moléculas de complejo principal de histocompatibilidad (MHC II), antígeno de la modificación y el anfitrión daño celular con la liberación de los auto-antígenos, son los más comúnmente describen los mecanismos que Podría dar lugar a respuestas autoinmunes debido a los agentes infecciosos [11, 13, 15 - 17]. Vínculos entre la autoinmunidad y la infección han sido descritas en varias situaciones, como en el caso de miocarditis tras coxsackievirus y trypanosomal infecciones [18 - 20], la fiebre reumática en relación con los estreptococos [21], la espondilitis anquilosante y klebsiella [22], reactiva y artropatías Epstein Barr virus [23, 24] y, recientemente, las enfermedades del corazón y la clamidia [25]. Prueba directa de que se confirma el diagnóstico de enfermedades autoinmunes requiere prueba de que todavía están más allá de la capacidad de la mayoría de los laboratorios clínicos de modo enfermedad autoinmune diagnóstico suele basarse en pruebas circunstanciales [26], tales como la demostración y cuantificación de los diversos autoanticuerpos.

En pacientes con la fiebre Q, la respuesta inmune observada con la C. Burnetii están asociados con respuestas inflamatorias, factor reumatoide, cryoglobulins o complejos inmunes-[8, 27]. A cardiolipin anticuerpos, antígenos nucleares, leucocitos, plaquetas, la mitocondria y el músculo liso de los antígenos se encuentra comúnmente en pacientes con infección crónica [1, 8, 27]. El estudio de las distribuciones de la subclase IgG ha puesto de manifiesto un aumento significativo de IgG1 e IgG3 niveles en el suero de los pacientes de manera similar a las descritas en algunas enfermedades autoinmunes [28]. En base a todas estas conclusiones que se podrían proponer que algunos de los aspectos patológicos de largo plazo fiebre Q enfermedad crónica, como las enfermedades del corazón, puede ser inducida o mantenida por mecanismos autoinmunes. El objetivo de este estudio fue caracterizar la especificidad de la autoantigens reconocidos por anticuerpos circulantes en el suero de pacientes con Coxiella aguda y crónica y las infecciones de determinar las diferencias entre las enfermedades crónicas con y sin participación cardíaca. Esto puede traer nuevas ideas a los mecanismos de inducción de la posible auto-reactiva complicaciones cardíacas.

Métodos
Sujetos de estudio

El trabajo se realizó de conformidad con el reglamento interno de la junta de examen del Instituto de Salud Carlos III. España. Los pacientes y los voluntarios dio un consentimiento informado por escrito sobre el uso de sus sueros para participar en el estudio, que fue aprobado por el Comité de Investigación Humanos.

Las muestras de suero de los pacientes con fiebre Q. Sueros de convalecencia de 58 confirmados serológicamente aguda (n = 24) y crónica (n = 34) casos de fiebre Q se estudiaron. Todos los pacientes fueron adultos, dividido por igual entre hombres y mujeres, de 26 años de edad - 60 años (media 45 años). El diagnóstico fue hecho por inmunofluorescencia utilizando la fase Iy la fase II Coxiella antígenos. Una muestra de suero de fase II con título de IgG ≥ 200 y la fase II de IgM ≥ 50 se consideró grave y una muestra de suero con un título IgG fase I ≥ 800 se clasifica como crónica [1, 2]. Todos los casos crónicos tienen anticuerpos IgA fase I titre ≥ 50 [29]. Los pacientes con infección aguda tenía fiebre y / o neumonía atípica, pero los que demostrar pruebas serológicas de fiebre Q crónica de la enfermedad pueden dividirse en dos grupos: los que tienen participación cardíaca (n = 26) o con otras patologías (enfermedades hepáticas, fiebre o enfermedad de los huesos ) (N = 8).

Normal grupo control

Veinte muestras de suero de voluntarios sanos fueron estudiados, (10 varones, 10 mujeres) con edad entre 18 - 36 años (media 29 años).

La detección de autoanticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFI)

Secciones de criostato mono músculo cardíaco (La encuadernación del sitio, el Reino Unido) fueron utilizados como sustrato para determinar anticuerpos músculo cardíaco (CMA). Secciones de rata hígado, riñón o estómago (BioSystems, Sp) fueron utilizados como sustrato para la detección de anticuerpos específicos (anti-células parietales, ACC, y anti-músculo liso, ASMA). Línea celular de carcinoma humano (Hep-2) (MarDx Carlsbad, EE.UU.) se utilizó como sustrato para el estudio de anticuerpos anti-nucleares (ANA). Anticuerpos anti-neutrófilos (ANCA) fueron seleccionados utilizando diapositivas de neutrófilos (La encuadernación del sitio, UK) y anti-DNA de doble varados anticuerpos (dsADN) se analizaron utilizando Crithidia luciliae diapositivas (MarDx Carlsbad, EE.UU.).

IIF se hizo a lo descrito previamente [30]. En pocas palabras, los sueros de los pacientes se diluyeron en buffer fosfato salino (PBS), pH 7,4 (1:40 en el ANCA y Hep-2 diapositivas, 1:20 en el CMA, dsADN rata y el hígado, el riñón y el estómago diapositivas) e incubadas durante 30 min a Temperatura ambiente con cada una de las secciones. Bound se detectaron anticuerpos fluorescentes con un conejo anti-inmunoglobulina humana IgG (Dako, Dinamarca). Después de cada incubación, las diapositivas se lavaron tres veces durante cinco minutos con PBS. Después del último lavado, las diapositivas se montaron en el 70% de glicerol en PBS y examinadas en un microscopio de fluorescencia Leitz Diaplan. Las láminas fueron codificados y anotó ciego de forma independiente por dos examinadores.

Detección de antígenos específicos HeLa autoanticuerpos por Western blot

Ensayo se llevó a cabo utilizando los métodos anteriormente descritos [31, 32]. En pocas palabras, las células HeLa se cultivaron a 37 ° C en el 5% de CO2 a la fase logarítmica en RPMI 1640 complementado con un 10% inactivado por calor suero de ternera fetal, 1% glutamin, 10 U / ml de penicilina y 60 μ g / ml estreptomicina. Luego, las células fueron incubadas durante 30 min a 4 ° C en buffer de lisis (1% Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro, 1 μ / ml aprotinina, 1 μ / Ml pepstatin, 1 μ / ml leupeptina y 2 mM EDTA). Después de la centrifugación a 20000 × g durante 30 minutos, los sobrenadantes fueron almacenados a -80 ° C. Concentración de proteínas fue determinada por el ensayo BCA (Pierce, Pensilvania, EE.UU.). Alrededor de 400 μ g de extractos de células HeLa todo se separaron el 12% SDS-PAGE. Las proteínas fueron electrotransferred a difluoride de polivinilo (PVDF) o membranas de nitrocelulosa en un sistema semi-seco durante 1 h en 5,5 mA/cm2 en carbonato de amortiguamiento, sin embargo etanol 20% (v / v) fue añadido en lugar de metanol. Membranas se sumergen durante 1 hora en PBS-5% albúmina sérica bovina (BSA) y de la noche a la mañana incubadas con los sueros diluidos 1:100 en PBS-BSA. Tras el lavado, las membranas fueron incubadas durante 1 hora con una fosfatasa alcalina-anti-humano conjugado de anticuerpos IgG (La encuadernación del sitio. Reino Unido) en la dilución 1:8000. Después de tres lavados, antígeno-anticuerpo se visualiza vinculado con nitroblue tetrazolium y 5-bromo-4chloro-3-fosfato indolyl (Bio-Rad, Richmond, CA) según las instrucciones del fabricante.

El aislamiento y la proteína N-terminal de análisis de secuencias

HeLa proteínas fueron separadas por 8% SDS-PAGE y electrotransferred a membranas PVDF como se ha descrito anteriormente. Las membranas fueron teñidas con azul brillante Coomassie R-250 y destained en el 50% de metanol. Las proteínas de interés se redujeron a partir de la membrana de secado al aire y se incubaron durante 30 minutos con 0,5% polivinilpirrolidone-40 en 100 mM de ácido acético, digeridos en una enzima-sustrato proporción 1:20 en el peso con la tripsina en 100 mM en bicarbonato de sodio PH 8,2, y luego incubadas en acetonitrilo 95:5 (v / v) durante 16 horas a 37 ° C. Después de la centrifugación a 12,000 × g durante 10 minutos la mezcla de digestión fue acidificado con un 2% de ácido trifluoroacético y el sobrenadante se inyecta en una C18 Vydac 2,1 × 250 mm microbore columna (HPLC Beckman "Sistema de Oro") con un caudal de 0,15 ml / Min cromatográfico en un gradiente de acetonitrilo 7% y 0,09% de ácido trifluoroacético en agua. Por péptido micro secuenciación un pulso fase líquida se utilizó secuenciador automático (Applied Biosystems modelo 473). Homología de secuencia obtenida con las otras proteínas se analizaron con FASTA TFASTA y programas mediante la actualización de la base de datos Swissprotein y GenEMBL.

El análisis de los datos

Los resultados del IIF se analizaron utilizando la prueba exacta de Fisher cuando proceda. La diferencia en general se consideró significativa cuando p <0,05.

Resultados
La detección de autoanticuerpos por IIF

El sustrato respuestas específicas detectados en el suero de pacientes con crisis de la fiebre Q crónica y las infecciones se muestran en la Tabla 1.

Un total de 54,2% de los pacientes con infección aguda han demostrado respuestas a por lo menos uno de los antígenos de la prueba. Un paciente presentó anticuerpos a dsADN y tres habían ANCA o ANA, pero sólo ASMA y CMA se detecta en un número significativo de pacientes (29,2% y 12,1% respectivamente).

Por otra parte, el 67,2% de los pacientes con infecciones de la fiebre Q crónica mostraron resultados positivos por IFI, la mayoría de ellos a diversos antígenos de la prueba y no se encontraron diferencias significativas entre los pacientes con o sin intervención cardíaca. Tres pacientes (8,8%) suscitó a dsADN anticuerpos o células parietales, cuatro habían ANCA (11,8%) y cinco ANA (14,7%), y, al igual que en los pacientes agudos, la presencia de ASMA se detectó en un porcentaje significativamente mayor de sueros ( 26,5%). CMA se encontraron en 13 pacientes (38,3%) y ambas fibrilar y sarcolema se encontraron manchas de fluorescencia (figura 1]. La alta frecuencia de CMA-respuesta de anticuerpos específicos detectados en pacientes con infección crónica fue estadísticamente significativa (p <0,05) en comparación con pacientes con infección aguda. Muestras de suero de controles sanos no mostraron reactividad en la prueba diluciones.

La detección de anticuerpos a través de Western blot y análisis de secuencias

Catorce HeLa diferentes bandas, con masas moleculares que van de 20 a 100 kD, se detectó por Western blot. Normal sueros mostró mínimo si alguna reactividad con proteínas HeLa. Doce pacientes con infecciones agudas Coxiella (57%) mostraron anticuerpos que reaccionan con uno a tres bandas por muestra. Por el contrario, el veinticinco de suero de los pacientes con infecciones crónicas Coxiella (75%) mostraron anticuerpos reactividades a un amplio espectro de hasta siete diferentes proteínas. Un predominante y coherente banda de 50 kD se observó en 14 de los pacientes con infecciones crónicas (42%) y en 3 de los casos agudos (14%) (Figura 2]. No reactividad a esta banda se encontró en controles sanos. Secuencia de análisis de un fragmento de la proteína de 50 kD mostró un 98% de homología con el factor humano elongación 1 alfa (Figura 3].

Discusión

Cabe señalar que la presencia de autoanticuerpos naturales es una característica normal en el suero de individuos sanos y su presencia sólo puede ser circunstancial o transitorio. Tales autoanticuerpos naturales son por lo general bajas presentes en titre, pobres tienen afinidad por su antígeno correspondiente y por lo general pertenecen a la clase IgM. En las enfermedades autoinmunes, auto-antígenos reconocidos por autoanticuerpos patológica con características específicas que difieren de las que pueden ocurrir naturalmente en los seres humanos sanos [26].

Al igual que en otras enfermedades infecciosas, algunos aspectos inmunológicos de la respuesta a Coxiella de acogida en los pacientes con fiebre Q puede estar relacionado a la libre antígeno respuestas. En nuestras manos, la presencia de la ACC, ANA, ANCA dsADN y no parece que se correlacionan claramente con cualquiera de nuestro grupo de pacientes y podría ser sólo circunstanciales. Sólo ASMA CMA y se encontraron anticuerpos en un porcentaje importante de infección crónica aguda y fiebre Q pacientes, en comparación con la población normal. En la literatura, la Asociación rara vez se han encontrado en condiciones normales de las personas y su presencia se ha asociado con miocarditis autoinmune, la miocardiopatía dilatada idiopática o carditis reumática [33 - 37]. Muchos diferentes especificidades, se han descrito pero mitocondrial y de proteínas citoplasmáticas contráctil como la miosina o actina parece estar ampliamente implicados [33, 38]. CMA después de la detección de infecciones microbianas se ha relacionado con la liberación de antígenos después de daño tisular, pero en algunos casos, como en las infecciones de clamidia, enfermedad de Chagas, después de los streptoccocal fiebre reumática o coxsackie miopericarditis, molecular homologías entre los antígenos de acogida y el agente causal se han Descritos [11, 18, 21, 25]. CMA presencia en el suero de pacientes sin fiebre Q cardíaca participación fue inesperada y sugirió que no eran provocados por el daño a los tejidos. La posible existencia de homologías entre coxiella molecular y antígenos anfitrión fue estudiada por immunoblotting con extractos humanos HeLa. Los resultados revelaron que la mayoría de los sueros de los pacientes con infección crónica y aguda algunos de los pacientes reaccionó enérgicamente con un antígeno de 50 kD. Los resultados preliminares del análisis de la secuencia de un fragmento interno de esta proteína molecular mostró homología con el factor humano elongación 1 alfa. Este doquier la proteína expresada es filogenéticamente conservada y una abundante miembro de la familia de proteínas que unen actina, responsable de obligar a la aminoacil-tRNA al ribosoma durante polipéptido elongación [39 - 41]. Es co-localiza intracelularmente con la F-actina y se relaciona con cambios en el citoesqueleto de actina. Los altos niveles de expresión se correlacionan con la proliferación de las células, la transformación oncogénica, metástasis y se ha considerado un mercado de los heridos molecular muscular [42, 43] y que ha sido descrito como un auto-anticuerpos IgG meta en la dermatitis atópica y el síndrome de Felty [ 44, 45].

Este estudio preliminar muestra que, al igual que en otras enfermedades infecciosas, los pacientes con infecciones Coxiella tienen un perfil de autoanticuerpos con especificidades que se asemejan a las que se encuentran en las enfermedades autoinmunes. Nuevos estudios serían necesarios para evaluar si estos resultados sólo puede ser considerado como un indicio de la respuesta natural o tener consecuencias patológicas.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias a AI Marina, J. González, JM Vázquez del Departamento de Química de Proteínas del Centro de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid para la realización de la secuencia de aminoácidos y MJ Ramos para la asistencia técnica.

Este trabajo fue apoyado por una beca del Fondo de Investigaciones Sanitarias (Expt n ° 97/0191).