Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 25-25 (más artículos en esta revista)

Un refinado modelo in vitro para estudiar respuestas inflamatorias en la membrana organotypic cultura de rodajas de hipocampo de rata postnatal

BioMed Central
Jari Huuskonen (Jari.Huuskonen @ uku.fi) [1], Tiina Suuronen (Tiina.Suuronen @ uku.fi) [1], Riitta Miettinen (Riitta.Miettinen @ uku.fi) [1], Thomas van Groen (vangroen @ Uab.edu) [2], Antero Salminen (Antero.Salminen @ uku.fi) [1]
[1] Departamento de Neurociencias y Neurología de la Universidad de Kuopio, PO Box 1627, FIN-70211 Kuopio, Finlandia
[2] Department of Cell Biology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL 35294-0006, USA
[3] Departamento de Neurología, Hospital Universitario de Kuopio, PO Box 1627, FIN-70211 Kuopio, Finlandia

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Resumen
Antecedentes

Propagadas degeneración de los tejidos, especialmente durante el envejecimiento, se ha demostrado que reforzar, mediante la potenciación de la respuesta inmune innata. Enfermedades neurodegenerativas y una amplia variedad de condiciones inflamatorias están vinculados entre sí y varios anti-inflamatorios considera de potencial terapéutico por ejemplo en la enfermedad de Alzheimer (EA). In vitro cerebro rebanada técnicas han sido ampliamente utilizadas para desentrañar la complejidad de neuroinflammation, pero rara vez , Tiene el poder de la modelo en sí se informó. Nuestro objetivo era obtener una perspectiva más detallada y completa del comportamiento de los tejidos rodajas de hipocampo en el suero libre, interfaz de la cultura per se y, después de la exposición a diferentes pro-y anti-inflamatorios.

Métodos

Las respuestas de las rebanadas de pro-y anti-inflamatorios estímulos fueron controlados a varios tiempos de la fuga de la medición de lactato deshidrogenasa (LDH) y la liberación de citoquinas interleuquina 6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α ) Y el óxido nítrico (NO) de los medios de cultivo. Histológico métodos se aplicaron a revelar el estado morfológico después de la exposición a estímulos y durante el curso del tiempo el período de cultivo. Estadística análisis de poder se hicieron con nQuery Advisor ®, la versión 5,0, (Soluciones de Estadística, Saugus, MA) para el programa de ordenador de Wilcoxon (Mann-Whitney), la suma de rangos de la prueba.

Resultados

Mediante el uso de la interfaz de membrana de las técnicas de cultivo, la gran rodajas de hipocampo recuperarse de los traumas causados por el corte después de 4-5 días in vitro. Por otra parte, las culturas se mantienen estables y conservar su capacidad de respuesta a estímulos inflamatorios durante al menos 3 semanas. Durante este período de tiempo, las culturas son susceptibles de modificación por estímulos inflamatorios según la evaluación cuantitativa de ensayos bioquímicos y morfológicos caracterizaciones.

Conclusión

En el presente informe se describen las técnicas para el estudio de la respuesta inmune utilizando un trozo de suero libre de la cultura modelo. Estadísticamente poderoso datos bajo condiciones de cultivo controlado y con éticamente justificado el uso de los animales puede obtenerse tan pronto como después de 4-5 DIV. El modelo es el más adecuado, probablemente, también para el estudio de la inflamación crónica.

Antecedentes

El descubrimiento río arriba de los sensores, los receptores Toll-like (TLRs) [1, 2], multiplicado enormemente nuestra comprensión de la inmunidad innata y adaptativa interacciones y respuestas. Aguas abajo, una conocida familia de factores de transcripción, el factor nuclear kappa B (NF-κ B), es uno de los actores clave en la regulación de las respuestas inflamatorias [3, 4]. Estudios recientes han revelado que este singular interacción también existe en el cerebro macrófagos, es decir, las células microglial [5]. Estas células, que pueden presentar antígeno y se encargan de la producción y liberación de una variedad de citocinas y quimiocinas, interactúan con las células inmunes y están íntimamente involucrados en immunoregulation dentro de la CNS [6]. Considerando que el papel de la microglia en el cerebro ha sido estudiado ampliamente [7 - 11], la mayoría de los avances en el entendimiento de la función de la microglia en la inflamación proviene de cultivo de células y estudios de la cultura rebanada. El comportamiento de microglia en diferentes modelos de la cultura ha demostrado ser afectados por la cultura del tiempo y la composición de los medios de cultivo [12 - 14]. Se ha hecho hincapié en que la presencia de suero en la cultura de los medios de comunicación potencia el LPS-respuesta microglial inducida [15, 16]. Por otra parte, a pesar de que exhiben amoeboid, "activos" en virtud de la morfología de suero libre de condiciones de cultivo, microglia se sugieren para ser funcional en un "inactivas" o "descanso" estado [12].

En la rodaja sistemas de la cultura, ya sea complementado con suero o no, microglial células volver a un "descanso", ramificado fenotipo después de un prolongado tiempo de la cultura [17, 18]. Esta transformación morfológica comienza en alrededor de un 4 DIV y de aproximadamente 10 DIV, la población total de microglia aparecen en su mayor parte como un tipo ramificado. Se ha supuesto que este "descanso", ramificado fenotipo de microglia habría reducido el estado funcional, pero un reciente estudio in vivo por Nimmerjahn y compañeros de trabajo [19] demuestra convincentemente cómo las células microglia vigilar constantemente su entorno inmediato mediante la extensión y retractarse de sus Proyecciones en un minuto-a-minuto de tiempo limitado. Además, el tiempo transcurrido en vivo de imágenes de rodajas de hipocampo [20, 21] también han puesto de manifiesto la capacidad de microglia a someterse a un comportamiento muy dinámico.

Como demuestran estas observaciones, la microglia son capaces de comportamientos complejos y, por lo tanto, es de fundamental importancia prestar atención a los factores que contribuyen a la coherencia de los modelos utilizados in vitro e in vivo para imitar situaciones.

En el presente estudio, hemos utilizado tejidos rodajas de hipocampo en el suero cultura libre de las condiciones de examinar el comportamiento de microglia per se y para investigar la forma en que estos rodajas responder a favor y en contra de los estímulos inflamatorios. Este cultivo in vitro de cerebro postnatal proporcionar un modelo donde la cytoarchitecture y conectividad de las diferentes regiones anatómicas, así como las relaciones funcionales y de las interacciones con los países vecinos tipos de células (es decir, las neuronas y astrocitos) se conservan [22, 23]. Organotypic culturas ofrecen también la ventaja de manipulaciones controladas en tejidos vivos y, por tanto, podrían representar una analogía más simple posible intermedio entre líneas celulares y modelos in vivo.

Además, por la planificación cuidadosamente experimental set-up, debe ser posible llevar a cabo estudios de la cultura rebanada donde un número mínimo de animales tienen que ser sacrificados y, sin embargo, para obtener datos suficientes y fiables para eliminar el riesgo de que pierda el desempeño, más caros, Preclínicos in vivo de experimentación. Por lo tanto, también quería estudiar la posibilidad de perfeccionar el modelo en sí, teniendo en cuenta el diseño experimental con el adecuado tamaño de la muestra y el poder estadístico de análisis.

Métodos
Preparación cortes de hipocampo culturas

Organotypic rebanada de culturas hipocampo se prepararon utilizando la interfaz de la cultura modificados método descrito por Stoppini et al. [24]. Postnatal días 7-8 (P7-P8) crías de ratas Wistar fueron decapitados, y el cerebro disecado y rápidamente se coloca en un plato petri en helado 1 × Dulbecco's Buffered Saline fosfato sin calcio y magnesio (Biowhittaker ™, Bélgica). El hippocampi de ambas partes fueron aislados y seccionaron en 400 - μ m transversal de las rodajas con una máquina de picar McIlwain tejido (Mickle Laboratorio de Ingeniería Co Ltd, Goose Green, Reino Unido). Los trozos fueron cuidadosamente separados y transferidos a la membrana porosa inserciones (un trozo por insertar), de 12 de la cultura-así placas (Transwell TR 3462; Costar, Corning, NY, EE.UU.). Para alcanzar el nivel de inserción de membrana, alrededor de 600 μ l medio de cultivo, que consiste en medio Neurobasal con 1 × B27-suplemento (ambos de Gibco, Rockville, MD, EE.UU.), 1 mM L-glutamina, 100 U / mL de penicilina y 100 μ g / ML estreptomicina, fue agregado a la parte inferior de cada compartimento de la cultura y así posteriormente se colocaron las placas en un 37 ° C humificados incubadora enriquecido con 5% de CO 2. El primer día de la cultura, el suero bovino fetal inactivado (FBSi, Gibco) se añadió al medio de cultivo a una concentración de 10%. Al día siguiente, el medio de cultivo fue reemplazado con un nuevo medio sin suero y de ahí en suero libre de los medios de comunicación se cambió dos veces por semana.

Los animales se obtuvieron del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (NLAC), de la Universidad de Kuopio, Finlandia. Los experimentos fueron realizados de acuerdo con el Consejo de Europa (Directiva 86/609) y el finlandés directrices, y aprobado por el Estado Provincial de Finlandia Oriental.

La exposición de los diferentes estímulos a rodajas

Una serie de experimentos se llevó a cabo para extender la cultura de tiempo de hasta 1 mes. En primer lugar, para inducir a la inflamación, estamos expuestos a las rodajas de 5 μ g / ml de lipopolisacárido (LPS de E.coli 055: B5, L6529, Sigma, St Louis, EE.UU.) por 24 horas a 4 DIV, el 7 de DIV, 14 y 21 DIV DIV. Luego se realiza un estudio de series de concentración a fin de determinar si la cantidad de LPS tuvo ningún efecto sobre la producción de citoquinas y la LDH fugas en el punto 4 DIV tiempo. A continuación, se exponen las rodajas o bien a proinflamatorias o anti-inflamatorios, junto con o sin LPS inducción a las 4 de DIV. Como estímulo proinflamatorias hemos utilizado trichostatin A (TSA, 20 nM), un inhibidor de histona deacetilasa caracteriza [25] y como antiinflamatorio estímulo se utilizó una conocida NF-κ B inhibidor helenalin [26] en una concentración de 0,5 μ M. TSA fue comprado a Sigma y helenalin de BIOMOL Laboratorios de Investigación (Reunión Plymouth, PA, EE.UU.). También pre-expuestos a rodajas de 5 μ g / ml de LPS durante 3 h, 6 h, 12 h, 24 hy 48 h para determinar los posibles efectos que dependen del tiempo, ya sea a las 4 o 7 DIV DIV. En todos los experimentos, los resultados se obtuvieron de las culturas paralelas con seis rebanadas por cada grupo de tratamiento. Cada estudio se repitió al menos tres veces.

Los métodos histológicos

Para revelar microglia, rodajas de hipocampo se tiñeron con Alexa Fluor 488 conjugado fluorescente Griffonia simplicifolia isolectin IB 4 (Molecular Probes, Eugene, OR). Antes de la tinción de las rodajas fueron fijadas con paraformaldehido 4% h por 1-2 y enjuagar tres veces con 0,05 M TBS-T, pH 7.6 (Tris-salina tamponada + 0,1% Tritón X-100). 4 IB se aplicó en una concentración de 0,5 μ g / ml en TBS-T rodajas y se incubaron durante la noche a 4 ° C en un agitador. Antes de la visualización, las muestras fueron lavadas con buffer fosfato 0,1 M y montados sobre diapositivas. También se realizó la tinción inmuno con un marcador microglia OX-42 (contra CD11b superficie Ag, MCA 275R, Serotec, Oxford, Reino Unido), un anticuerpo que reconoce los receptores tipo 3 de complemento CR3 de los fagocitos mononucleares. Primaria anticuerpo fue diluido 1:20 000 con 0,05 M TBS-T, pH 7,6, rebanadas fueron incubadas durante 1 semana a 4 ° C en un agitador, enjuagarse completamente, seguido de la noche a la mañana de incubación (4 ° C) con biotina secundaria Ab (ovejas Anti-ratón, 1:1000, Serotec) y 2 h de incubación (temperatura ambiente) con avidina-peroxidasa (1:1000 ExtrAvidin E-2886, Sigma). El producto se visualiza inmunorreactivas con 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride dihidrato (DAB, 0,5 mg / ml, Sigma) en una solución que contenga níquel hidrógeno peroxidasa (25 μ g / ml).

Por epifluorescence immunodetection, primaria anticuerpos a la proteína ácida glial fibrilar de astrocitos (GFA: dilución 1:10 000; DAKO, Dinamarca) y de las neuronas doublecortin (DCX C-18: dilución 1:2500; Laboratorios Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE.UU.) fueron utilizados. Después de una noche a la mañana de incubación con el anticuerpo primario a 4 ° C y un aclarado completo, 1:1000 diluido cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 secundarias de anticuerpos (Molecular Probes) para GFAP y diluido 1:500 con biotina conejo anti-cabra secundaria (Vector BA-5000 ; Burlingame, CA, EE.UU.) seguido de anticuerpos terciario (de cabra anti-conejo Alexa Fluor 488; 1:1000 dilución) para DCX se aplicaron, respectivamente, también durante la noche a 4 ° C. Todos los anticuerpos fueron diluidos con 0,05 M TBS-T, pH 7,6.

Vigilancia morfológicas y bioquímicas y las respuestas de recuperación

En primer lugar, algunas fueron rápidamente hippocampi rodajas a 400 μ m e inmediatamente fijo y teñidas de microglia, astrocitos y neuronas con IB 4, GFAP y DCX, respectivamente, para revelar el estado morfológico en el comienzo de la cultura. Entonces, el medio de cultivo de tejidos se recogen y fija en intervalos de 24 horas durante los 7 días in vitro (7 DIV) período de cultivo. Citocinas IL-6 y TNF-α, NO se analizaron LDH y de los medios de comunicación y muestras de tejidos fueron teñidas como se describe anteriormente. Posteriormente, las muestras de rodajas de medio de cultivo y se recogieron en su momento los puntos a seguir supervisando la morfológicos y bioquímicos situación de las culturas en el 1 meses. Para visualizar la integridad morfológica y ambas células muertas o moribundas y las células vivas, hemos utilizado estándar y la tinción de Nissl Live / kit de citotoxicidad muertos-L-3224 (Molecular Probes), respectivamente, de acuerdo con el protocolo del fabricante.

LDH fugas a los medios de cultivo se midió con un CytoTox 96 nonradioactive kit de ensayo de citotoxicidad obtenidos de Promega (Madison, WI, EE.UU.). La concentración de nitrito en el medio se mide por la reacción de Griess. En pocas palabras, a un 100 - μ l de muestra en una cantidad igual de los reactivos de Griess (1:1 0,1% naphthylethylene diamide en H 2 O y 1% sulfanilamide concentrado en el 5% H 2 PO 4) y se añadió la densidad óptica (DO) Se midió a 550 nm utilizando un lector de microplacas de ELISA después de una incubación de 10 min. Las concentraciones de citocinas IL-6 y factor de necrosis tumoral (TNF)-a liberados en el medio se mide por una enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) utilizando OptEIA ™ kits o conjuntos obtenidos de Pharmingen (BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU. ).

Fotos de manchado rebanadas fueron recogidos con un microscopio Olympus DP50 sistema de cámara digital conectada a un microscopio Olympus BX40 (Olympus Optical Co, Ltd, Japón) con los filtros adecuados. Con excepción de ajuste a los niveles de brillo y contraste, otras manipulaciones no se hizo en ninguna de las imágenes.

Potencia estadística y análisis de la estimación óptima de tamaño de la muestra

Para determinar el número mínimo de animales, pero el tamaño de las muestras adecuadas para nuestros experimentos, se realizó el análisis del poder de los cálculos. En primer lugar, sobre la base de nuestros resultados anteriores, se estima que el tamaño del efecto entre las diferentes unidades experimentales. Posteriormente, el tamaño de la muestra se estableció a seis por grupo y el nivel de significación de 5% para ver el efecto sobre la potencia estadística. Con el fin de reducir la variación dentro del grupo que utiliza distribución logarítmica normal y llevado a cabo el análisis del poder de los cálculos estadísticos utilizando nQuery Advisor ®, la versión 5,0, (Soluciones de Estadística, Saugus, MA) para el programa de ordenador de Wilcoxon (Mann-Whitney), la suma de rangos de prueba .

Resultados
Rodajas recuperarse de explantation por 4 DIV

En primer lugar, queríamos saber de qué tan bien se rodajas de hipocampo recuperarse de los traumas causados por el procedimiento de aislamiento. Por lo tanto, el medio recogidos después de cada 24 h durante 7 DIV y protocolos utilizados para medir la secreción de IL-6, TNF-α y de la fuga de LDH. El secretada nivel de IL-6 fue más alta a las 48 h después de explantation y regresó al nivel basal para el 4 de DIV (Figura 1A]. El pico de los niveles de LDH y TNF-α se registraron en DIV 1 y volvió a los niveles de control para el 3 de DIV (Fig. 1B y 1C]. A partir de ese momento, los niveles de citoquinas y LDH exhibió cierta variabilidad, pero se mantuvo en niveles bastante bajos. El Live / muertos de ensayo demostró que hubo numerosos muertos / células mueren durante los primeros días de la cultura (no se muestra), pero poco a poco el número de muertos o moribundos y disminución de las células a las 4 semanas in vitro de la mayoría de células vivas fueron visibles (Fig. 2A - C]

Efecto de la LPS no es dependiente de la concentración

Se ha demostrado que la microglia expresar Toll-like receptor 4 (TLR4) [27, 28], que media la LPS inducido intracelular NF-κ B vía de señalización y evoca la liberación de citoquinas. Para investigar si la concentración de LPS tenía ningún efecto sobre las rodajas en el plazo de 24 h de exposición, la validez de las culturas expuestas a 0,1, 0,5, 1, 5 y 10 μ g / ml de LPS en el día 4. La LDH fugas no difirió significativamente en ninguna de estas LPS-los niveles de concentración y de control de las rebanadas mostró sólo mínimamente menor nivel de la secreción de LPS tratados rebanadas (Fig. 3A]. El NO y los niveles de IL-6 fueron claramente superiores en comparación con el control rodajas LPS, pero no indujo ningún prominente dependiente de la concentración en cualquier efecto grupos de tratamiento (Fig. 3B y 3C].

Efecto de la exposición es LPS, pero no dependen de la cultura del tiempo

Para abordar la cuestión de si la rodaja culturas responder a LPS cultura diferente durante el tiempo, añadió LPS (5 μ g / ml) a la media de 24 horas en días 7, 14 y 21 in vitro. LPS evocados amplio de la secreción de IL-6 en todos los puntos del tiempo (Fig. 4], lo que refleja la capacidad de rodajas para responder a los estímulos inflamatorios con similares condiciones que a las 4 de DIV.

También se determinó el perfil temporal de LPS respuesta de la medición de los niveles de IL-6, TNF-α, NO LDH y después de 3 h, 6 h, 12 h, 24 hy 48 h de exposición a 5 μ g / ml de LPS en DIV 4 y 7. El secretada nivel de IL-6 fue aumentado claramente después de 6 horas y los más altos niveles se encontraron después de 48 horas tanto a los 4 y 7 DIV DIV (Fig. 5A]. TNF-α secreción ya era prominente superior a las 3 horas, seguido aumentando a 6 horas y es más alto después de 12 horas de exposición a las 4 de DIV. El patrón de la secreción de TNF-α a las 7 DIV fue similar a la observada en el 4 DIV, pero en general los niveles fueron significativamente más bajos y el valor después de 48 horas fue mayor que el valor de 24 horas de exposición (Fig. 5B]. El NO a los 7 niveles DIV aumentó en grados a las 3 h, 12 hy 48 h tiempo, pero a los 4 puntos DIV subió más uniforme (Fig. 5D]. A los 7 DIV similar elevación, como se ha visto en los niveles de NO, se observa a las 12 h LDH cuando se midió a partir de las mismas muestras. Los 4 DIV niveles de LDH en comparación con aquellos a los 7 DIV fueron aproximadamente de tres a cuatro veces más alta a las 3 y 6 horas de tiempo de puntos y dos veces más altos que después de 12 horas de exposición a LPS (Fig. 5C].

Rodajas responden bien a los pro y los anti-inflamatorios durante estímulos a la cultura

A continuación, queríamos ver si ya sea proinflamatorias TSA inhibidor de la histona deacetilasa o anti-inflamatorio NF-κ B inhibidor helenalin podrían influir en la respuesta inducida por LPS. Curiosamente, TSA potenció significativamente la IL-6 y la respuesta de LPS helenalin parecía downregulate la respuesta a los LPS y LPS / TSA exposición después de 24 horas de exposición a DIV 4. Helenalin también downregulated los niveles de óxido nítrico cuando se combina con LPS solo y junto con LPS y TSA (Fig. 6A y 6B].

Cambios morfológicos de microglia, neuronas y astrocitos durante el período de cultivo

A principios de la cultura, inmediatamente después de la sección, microglia idiotypical mostraron un "descanso", ramificado morfología de células pequeñas con numerosos órganos y procesos de ramificación (Fig. 7A]. Después del 1 de DIV, la microglia comenzado a volver paulatinamente en un intermedio, "reactiva" con forma de células más grandes y de varios órganos de las ramas más gruesas (Fig. 7B], y por 4-5 DIV una serie de la Oficina Internacional de 4 células positivas apareció como la Característica redondeado ", amoeboid" fenotipo, aunque también pleomórfico células que exhiben las proyecciones fueron visibles (Fig. 7C y 7D]. El endotelio vascular y las células con amoeboid protuberantes filopodios también fueron etiquetados por IB 4. A medida que la cultura del tiempo extendido, el polimorfismo morfológico de células microglial población siguió, por ejemplo, todas las formas de microglia de "amoeboid" como a "descansar", ramificadas se encontraron en todos los etiquetados IB 4 rebanadas. El mismo fenómeno se observó cuando las rodajas se tiñeron con OX-42. Morfológicamente activo "fagocitosis" las células se encontraron en grupos principalmente en el cornu ammonis del hipocampo, y ramificado células fueron esparcidos por todo el trozo sin localización específica. A pesar de las diferencias en la secreción de citoquinas, microglia mostraron una morfología heterogénea también en todos los grupos experimentales (Fig. 8A-B.]

GFAP tinción reveló la característica forma de estrella morfología de astrocitos inmediatamente después de la explantation. Además, la expansión de astrocytic procesos, el "fin de los pies", que envuelven el microvasos eran claramente visibles (Fig. 9A], simulando de este modo la situación in vivo. Después del 2 de DIV, células GFAP-positivas comenzó a transformarse en células fibrosas con procesos de largo (Fig. 9B], eventualmente extender a lo largo de todo el tramo por 7 DIV (Fig. 9C]. A medida que la cultura del tiempo alargado, astrocitos se mantuvo en todo el trozo que muestra el fibroso y morfología en forma de estrella (Fig. 10A-C]. El dentado zona sigue siendo prominente cubierto de células que expresan doublecortin, mostrando la típica morfología de las neuronas (Fig. 11A y 11B; inserciones). DCX-se encontraron células positivas, aunque en menor número, también en la CA-zonas. Independientemente de LPS o LPS / TSA exposición ya sea a los 7 o 14 DIV, tanto astrocitos y neuronas mostraron un patrón de tinción similar como rebanadas de control, de acuerdo con el punto de vista morfológico (Fig. 11-D]. También el general de la integridad morfológica de la mayoría de las rebanadas se mantuvo bien conservado (Fig. 12A-C], es decir, las capas neuronales podría ser reconocido a pesar de los distintos tratamientos.

Estadística y análisis de poder óptimo tamaño de la muestra

Nuestros resultados de las culturas paralelas indican que con rebanadas escogido de forma aleatoria (una por así) y el 5% de nivel de significación de prueba es posible obtener estadísticas más del 80% de energía con un tamaño de muestra de seis, el control y la LPS cuando se comparan grupos (Cuadro 1 ). Asimismo, el análisis arrojó una biológicamente satisfactorio 77-80% de potencia con el mismo tamaño de la muestra para los grupos de la TSA. El efecto de helenalin sin TSA (53% de potencia de IL-6 y el 57% para el óxido nítrico) no fue estadísticamente destacado y claramente TSA no tuvo ningún efecto sobre la secreción de óxido nítrico cuando se combina con LPS (4% de potencia).

Discusión

Medios de cultivo de células han sido habitualmente complementado con suero de los animales como fuente de nutrientes. En los últimos años la tendencia hacia la cultura libre de suero condiciones ha recibido mucha atención, ya que hay tanto preocupaciones éticas y técnicas relacionadas con el uso de suero [29, 30]. La obtención del suero de fetos removidos de las vacas preñadas en masacre ha planteado preguntas sobre el sufrimiento de los animales. Además, la posibilidad de que los lotes variabilidad en la composición indefinido suero puede agregar interferencia a la reproducibilidad de los resultados entre los estudios. Al mismo tiempo, hay una evolución de preocupación y el compromiso entre las autoridades reguladoras, en la Unión Europea y los EE.UU., para encontrar la manera de reducir el número de animales utilizados en laboratorios para experimentación y otros fines científicos al nivel mínimo [31] .

Hemos observado anteriormente que, en presencia de suero, el LPS de respuesta es mayor que sin suero (Fig. 13]. Además, nuestros estudios anteriores han demostrado que las concentraciones de LPS eficiente dependen del tipo de producto LPS. En este estudio, especialmente para garantizar la penetración de LPS a lo largo de todo el tramo, usamos un nivel de saturación de Sigma L6529 producto desde que nos han puesto a prueba la concentración de la dependencia que LPS producto en nuestros diferentes modelos (ver por ejemplo [32]]. Como demuestran nuestros resultados, la concentración utilizada no mostró ninguna respuesta tóxicos (Fig. 3A], y no impidió que los pro-y anti-inflamatorios respuestas (Fig. 6A y 6B]. El vehículo efecto (es decir, agua) también fue cuidadosamente excluida.

Nuestros hallazgos demuestran que el actual rodajas cultivadas en medio libre de suero aún responder significativamente y de forma similar a un estímulo inflamatorio entre la cultura período comprendido entre el 4 al 21 DIV DIV. Se demuestra que en nuestro modelo el fenotipo de las células microglial población sigue siendo heterogénea a lo largo del tiempo la cultura después de un período de recuperación de aproximadamente 4-5 DIV. Nonuniform microglial Pese a la apariencia, el control no tratados parecen rebanadas de mantener la estabilidad en lo que viene a la lisis de las células (LDH fugas), y a su capacidad de liberación de citoquinas IL-6 y NO.

Además, la rodaja culturas parecen ser capaces de cambiar del estado de reposo inmunológicamente a los modos activado y viceversa cuando se exponen a favor y en contra de los estímulos inflamatorios en diferentes puntos temporales. Como microglia poseen el receptor Toll-like 4, y, por tanto, reconocido como el principal LPS-responda tipo de células [32], se concluye que estas respuestas son mediadas principalmente por microglia. Una serie de estudios apoyan la opinión de que, efectivamente, la microglia y sus receptores de la superficie celular, los TLRs, forman un sistema de defensa de los encuentros que el ataque microbiano y forman el sistema inmunológico de la CNS [27, 28, 33, 34].

Por otra parte, sobre la base de nuestra conclusión de que la CST junto con LPS fue capaz de mejorar la respuesta inflamatoria, que postula que la microglia población, aunque sometido a estrés grave por 5 μ g / ml de LPS solos, aún posee algunas de reserva para contrarrestar aún más Profundo estímulo. Como nuestro DCX inmunoticción reveló, la CST / LPS inducción no era tóxico para las neuronas, lo que sugiere que las rebanadas, al menos en cierta medida, tienen la capacidad de hacer frente a la severa inflamación.

Como aparecen nuevos métodos, tenemos la posibilidad de perfeccionar el diseño de los experimentos con animales. Con la ayuda de sofisticados programas de ordenador hoy en día es relativamente fácil de estudiar la forma de manipulación de los diferentes parámetros puede afectar el tamaño de la muestra o el poder estadístico [35]. Mantener este y los inevitables inherentes a la variabilidad biológica en mente, hemos estimado que el poder de las pruebas estadísticas relacionadas con el tamaño de las muestras se definen a fin de ofrecer resultados biológicamente significativos (ver Tabla 1.] Si se quiere reducir al mínimo el número de animales a ser sacrificados y , Y sin embargo, para obtener suficiente poder estadístico para el análisis, a continuación, se propone un "bien por una rebanada / seis rebanadas por grupo" modelo. Por lo tanto el tamaño de la muestra adecuado se puede llegar con una ética y estadísticamente justificado número de animales. Nuestras observaciones indican que la distribución de los datos es a menudo más desigual en el "grupos de tratamiento", siendo ésta probablemente debido a la variación biológica dentro de estos grupos. Por lo tanto sugerimos que antes de aplicar una prueba adecuada (en nuestro caso con técnicas de Mann-Whitney U-test) los datos deben ser cuidadosamente analizados.

También argumentan que mediante la aplicación de este modelo es posible evitar el sesgo potencial emergente de la interacción entre las rebanadas, cuando un número de rebanadas se colocan en la proximidad de las membranas de la misma cultura. La posibilidad de error relacionados con el uso de littermates es una cuestión que debe estudiarse la hora de decidir el número de repeticiones de estudio son obligatorios. Nuestro repetirse los estudios con el uso de diferentes camadas paralelas culturas indican que la variación entre las distintas camadas es mínima y no tiene importancia cuando isogénicas crías de ratas se utilizan.

Sugerimos que este modelo es muy adecuado para revelar la respuesta inmune bioquímicas diferentes y estos estudios pueden llevarse a cabo tan pronto como después de 4-5 días en la cultura desde la rodajas parecen haber recuperado gran parte del trauma causado por la disección procedimiento y parecen Responder a la lucha contra el proinflamatorias y los estímulos de una manera similar como lo hacen más tarde. Asimismo, sobre la base de los datos del perfil temporal de LPS respuesta, llegamos a la conclusión de que NF-κ B mediada por marcadores de inflamación se puede medir en cualquier momento entre 6 a 48 horas el tiempo de exposición. Por otra parte, desde el rebanadas permanecen estables durante al menos 4 semanas, también a largo plazo, más exposiciones crónicas a los estímulos puede ser estudiado con este modelo.

Conclusión

En este informe, hemos utilizado la inflamación como modelo para ilustrar la eficacia in vitro de hipocampo rebanada cultura como un modelo intermedio entre las líneas de células individuales y modelos in vivo. Además, hemos querido examinar la posibilidad de perfeccionar el modelo, teniendo en cuenta el diseño experimental de la participación de las condiciones de cultivo y tamaño de la muestra adecuado. Nuestro estudio pone de manifiesto el potencial del uso difundido organotypic hipocampo rebanada cultura (OHSC) como fiables, que se define el modelo que se utilizará en los estudios preclínicos de drogas de la inflamación y las reacciones inmunes.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

JH concebido el diseño del estudio, llevado a cabo todos los experimentos, realiza análisis de datos y redactó el manuscrito. TS ayuda en el tramo experimentos de la cultura, participó en el diseño del estudio y el análisis crítico de dio el manuscrito. RM manuscrito con ayuda en la preparación, diseño experimental y supervisó el estudio histológico. TvG ayudado especialmente en la histología y proporcionó las instalaciones, participó en el diseño del estudio y la preparación de manuscritos. AS ayudado en el diseño del estudio, sobre todo en lo que respecta a los experimentos inflamatoria, supervisó todos los experimentos y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias al Dr Ewen MacDonald para el control de la lengua del manuscrito y el Sr y la Sra Pasi Miettinen Airi Boman para la asistencia técnica. Este estudio fue apoyado económicamente por la Academia de Finlandia y la Universidad de Kuopio.