Journal of Carcinogenesis, 2005; 4: 20-20 (más artículos en esta revista)

Papel de los receptores del ácido retinoico en el carcinoma de células escamosas de esófago en humanos

BioMed Central
I Bergheim (ina.bergheim @ freenet.de) [1], E Wolfgarten (eva.wolfgarten @ online.de) [2], E Bollschweiler (Elfriede.Bollschweiler @ medizin.uni-koeln.de) [2], AH Hölscher (Arnulf.Hoelscher @ medizin.uni-koeln.de) [2], Ch Bode (bodech@uni-hohenheim.de) [1], A Parlesak (parlesak@uni-hohenheim.de) [1]
[1] Departamento de Fisiología de la Nutrición, Universidad de Hohenheim (140e), Garbenstrasse 28, 70599 Stuttgart, Alemania
[2] Departamento de Cirugía Vascular y visceral, de la Universidad de Colonia, Joseph-Stelzmann-Strasse 9, 50931, Colonia, Alemania

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Resumen
Antecedentes

En todo el mundo, el cáncer en el esófago se encuentra entre los 10 cánceres más comunes. Alteraciones de los receptores del ácido retinoico (RAR α, β, γ, y RXR α, β, γ) expresión se considera que desempeñan un papel importante en el desarrollo de carcinoma de células escamosas (SCC), que es el más común de cáncer de esófago. El consumo de alcohol y el hábito de fumar, lo que puede alterar los niveles del receptor de ácido retinoico, han sido identificados como los principales factores de riesgo en el desarrollo de carcinoma en el aero-tubo digestivo. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar los niveles de proteína de los receptores del ácido retinoico (RAR α, β, γ, β y RXR) en el esófago y en torno a SCC tejido normal de los pacientes no tratados con RCS y los controles.

Métodos

Todos los participantes en el estudio completado un cuestionario sobre el hábito de fumar y beber alcohol, así como hábitos de los parámetros antropométricos. De los niveles de proteína RAR α, β, γ, y RXR β se determinaron por Western Blot en el tejido esofágico normal y tejidos obtenidos de la SCC, de 21 pacientes con diagnóstico reciente de esófago SCC tejido esofágico normal y de 10 controles.

Resultados

De los niveles de proteína RAR γ fueron significativamente inferiores de ~ 68% en comparación con el SCC los tejidos circundantes normales en pacientes con SCC que fumaban y / o consumen elevadas cantidades de alcohol. Además, los niveles de proteína RAR α fueron significativamente más bajos (~ - 45%) en comparación con el SCC en la mucosa esofágica normal en los pacientes con elevado consumo de alcohol. Al comparar los niveles de proteína de los receptores de ácido retinoico entre tejido normal de los pacientes con SCC y controles, RAR γ niveles de proteína resultaron ser significativamente más altos (~ 2,7 veces) en el tejido esofágico normal de SCC en pacientes con esófago de tejido obtenidos de los controles. No se encontraron diferencias para RAR α, β, β RXR y los niveles de proteína entre el tejido esofágico normal de los pacientes y la de los controles.

Conclusión

En conclusión, los resultados del presente estudio sugieren que las alteraciones de los receptores de ácido retinoico proteína puede contribuir en el desarrollo de la SCC en el esófago y que en algunos pacientes el estilo de vida (por ejemplo, el hábito de fumar y el consumo de alcohol) pueden ser un componente crítico en la alteración de ácido retinoico En los niveles del receptor de esófago.

Antecedentes

En todo el mundo el cáncer esofágico se encuentra entre los diez tipos de cáncer más común [1] y, en general, de 5 años la tasa de supervivencia para los pacientes diagnosticados con cáncer esofágico es pobre (por ejemplo, el 3% -10%) [2]. Aunque, hay un aumento de entidad de adenocarcinoma [3], la mayoría de los carcinomas de esófago son el carcinoma de células escamosas (SCC) [1]. Múltiples estudios epidemiológicos indican que el alcohol y el tabaco pueden ser importantes factores de riesgo para el desarrollo de un carcinoma en el esófago [1, 4]. En un estudio de casos y controles, Valsecchi et al. [5] mostró que las personas que fumaban 40 o más años había casi 6 veces el riesgo de desarrollo de cáncer de esófago en comparación con los no fumadores. Aquellos con una historia de consumo de alcohol de más de dos cervezas por día tuvieron de 3 veces el riesgo en comparación con los abstencionistas. Además, la combinación de ambos hábitos se encontró que tienen un efecto sinérgico, aumentando el riesgo relativo de desarrollar cáncer en el tracto digestivo aero-hasta 17,3 veces más que el de los no fumadores, no bebedores [6]. Sin embargo, a pesar de la intensa investigación [7], pathomechanisms moleculares implicados en el desarrollo de esófago de CCS no se comprenda totalmente la medida que contribuye a la falta de éxito de las terapias farmacológicas.

Las alteraciones del metabolismo de los retinoides y los receptores de ácido retinoico (RAR por ejemplo, α, β, γ, y RXR α, β, γ) - mediada la transcripción de genes que se han propuesto para desempeñar un papel importante en la patogénesis de la CCS [8 - 10]. Es bien sabido que RARs y RXRs están ligando que dependen de factores de transcripción con distintos patrones de expresión a principios de los adultos y las etapas de desarrollo. Por lo tanto, baja regulación (por ejemplo, la pérdida o baja de la expresión de receptores nucleares específicos) o "funcional" baja regulación (por ejemplo, la falta de ligandos), de las dos familias de los receptores de ácido retinoico podría interferir con la señal de transducción y retinoides, con el tiempo, podría Resultado en el aumento de la proliferación celular y la transformación maligna. Una asociación entre la expresión alterada de los receptores nucleares de ácido retinoico y de la transformación maligna de las células humanas se ha demostrado en varios estudios [11 - 14]. Por otra parte, una expresión reducida de RAR γ encuentran en cabeza y cuello SCC líneas celulares [15] parece depender de una administración de suplementos de vitamina A suficientes [16].

Dado que se sabe poco acerca de la abundancia de RARs y RXRs proteína en esofágico SCC en el ser humano, el principal objetivo del presente estudio fue determinar los niveles de proteína de RAR α, β, γ, y en β RXR normal, macroscópicamente no afectado el tejido esofágico y RCS de los pacientes Con RCS y los controles no tratados. Además, el consumo de alcohol y los hábitos de fumar de los pacientes y controles fueron evaluados y en relación con los niveles del receptor de ácido retinoico.

Materiales y métodos
Sujetos y muestras de tejido

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Clínica Médica de la Universidad de Colonia, Alemania. El consentimiento informado se obtuvo de todos los temas incluidos en el estudio. Un total de 31 sujetos, todos los cuales fueron sometidos a endoscopias por razones médicas, se incluyeron en el estudio. Veintiún pacientes no tratados tenían SCC del esófago, y diez SCC libre de los sujetos actuó como control. El análisis histopatológico de SCC fue realizado por un médico experimentado. Estadiaje del tumor fue clasificado sobre la base de un sistema de calificación y variado de G1 (bien diferenciado) a G3 (pobremente diferenciado). En los controles, la presencia o ausencia de RCS se confirmó macroscópicamente. Todos los participantes en el estudio completado un cuestionario sobre el hábito de fumar y beber alcohol, así como hábitos de los parámetros antropométricos. El uso de fórceps pizca estándar, dos biopsias se obtuvieron de tejido esofágico normal macroscópicamente y RCS de los sujetos con carcinoma de la mucosa y de los controles sanos. Las biopsias fueron colocadas inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta el análisis.

Análisis por inmunotransferencia

Total de la proteína se aisló utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El uso de SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida, 20-30 μ g de proteínas totales fueron separados en un 9% en gel de poliacrilamida (PAGE). Proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Amersham / Pharmacia, Freiburg, Alemania). Membranas fueron bloqueadas en Tris-buffer salina (TBS) con 5% de leche en polvo descremada con Tween 20 (TBST, 0,01% v / v Tween 20), lavarse con TBST, y determinada con anticuerpos primarios disuelto en TBS seguido de una incubación Con el anticuerpo secundario. Primaria anticuerpos contra RAR α, β, γ, y RXR β se obtuvieron de Alexis (Dianova, Hamburgo, Alemania), la secundaria-peroxidasa conjugada anticuerpos fueron adquiridos de Boehringer (Mannheim, Alemania). Bandas se visualizaron por mejorar la quimioluminiscencia utilizando ® SuperSignal West Dura (Pierce, KTM, Bad Godesberg, Alemania). Blots fueron fotografiados (Cámara LAS 1000, Fuji, EE.UU.) y fue realizada por immunoquantitation densitométricas utilizando el software de análisis de AIDA (Raytest, Isotopenmessgeraete, Straubenhardt, Alemania). Para lograr la normalización y la comparabilidad de los blots, el total de proteínas procedentes de hígado humano fue cargado en cada gel en tres concentraciones (50 μ g, 25 μ g, y 12,5 μ g) y blottet con las muestras. Para garantizar la igualdad de la carga, todos los blots fueron manchadas con rojo Ponceau; haptene señales se normalizaron a β-actina utilizando un anticuerpo disponible en el comercio (Sigma Chemical Co, Munich, Alemania).

Análisis Estadístico

Los resultados se presentan como media ± error estándar de la media (SEM), salvo indicación en contrario. T test de Wilcoxon se utilizó para la prueba de significación de las diferencias en los niveles de expresión mide en tanto normales como malignas de los tejidos de los pacientes con SCC. La prueba exacta de Fisher se utilizó para la comparación de los datos de estilo de vida. Comparación estadística de los valores procedentes de grupos separados se realizó con la de Mann-Whitney U-test. P <0,05 fue considerado para representar una diferencia significativa.

Resultados

Asunto edad osciló entre 38-71 años y la mayoría eran de peso normal (Tabla 1]. Hábitos de fumar no fue diferente entre los pacientes y los controles. Sin embargo, un número significativamente mayor de pacientes con SCC informó a consumir "elevadas" cantidades de alcohol (más de 30 g de alcohol / día o más de 4 veces a la semana a más de 1 bebida), en comparación con los controles (Tabla 1]. Tumor de clasificación varió forma G1 a G3 con la mayoría que se G2 (Cuadro 2].

El ácido retinoico receptor de los niveles de proteína cruda en pacientes con esófago de RCS

Las figuras 1 y 2 se resumen los resultados de las mediciones realizadas de proteínas en las muestras de biopsia obtenidas de SCC y vecinos del tejido esofágico normal de los pacientes no tratados con esófago SCC. Western Blot análisis demostró que RAR α, β, γ, y RXR β se presente como una de las principales inmunorreactivas en representación de la banda de 55 kDa monómero en todas las muestras analizadas de tejido (véase la figura 1]. De los niveles de proteína RAR γ resultaron ser significativamente más bajos en las muestras obtenidas de SCC en comparación con el tejido normal circundante. En concreto, los niveles de proteína RAR γ se ~ 47% más bajos que en SCC en comparación con los de los normales, no afectados tejido esofágico (p = 0,040). En cambio, no se encontraron diferencias significativas al comparar los niveles de proteína de RAR α, β RAR, y RXR β entre macroscópicamente normales, el tejido esofágico no afectado y SCC.

Para investigar si el tabaquismo y el consumo de alcohol influye en los niveles de proteína de los receptores del ácido retinoico esofágica de los pacientes con SCC se agruparon por los hábitos de fumar (por ejemplo, no fumador o fumador), independientemente de su consumo de alcohol. En los fumadores, los niveles de proteína RAR γ resultaron ser significativamente más baja (~ 68%, p = 0,010) en comparación con SCC en los tejidos no afectados de esófago en pacientes fumadores (n = 10). Curiosamente, el mismo no se encontró diferencia en los pacientes que no eran fumadores (n = 11, datos no presentados). Similares, los pacientes que fueron agrupados por sub-consumo de alcohol, independientemente de su hábito de fumar en los pacientes que (a) no informó a consumir alcohol (= "ninguno"), (b), que informó de que se "moderado" de alcohol que no exceda de los consumidores El consumo de alcohol más de una vez a la semana, o (c), que declaró consumir alcohol más de 4 veces a la semana o más de 30 g de etanol en bruto / d (véase también el Cuadro 2]. Dado que sólo 4 pacientes que se informó de los abstencionistas y desde dos pacientes en este grupo afirmó haber abandonado el consumo de alcohol pesada hace varios años, este grupo fue excluido de los análisis estadísticos. Los resultados se resumen en la figura 3. Al comparar los niveles de proteína de los receptores de ácido retinoico entre SCC y no afectado tejido obtenido de los pacientes que tuvieron a consumir "elevadas" cantidades de alcohol (n = 9), RAR γ se volvieron a los niveles de proteína que se encuentra en SCC significativamente menor en comparación con los países vecinos como normal Tejidos (~ 40%, p = 0,038). Además, en este subgrupo de pacientes, en las biopsias obtenidas de los niveles de proteína de SCC RAR α se ~ 55% más bajos que en los tejidos normales (p = 0,049). Una vez más, similar a los no fumadores, en los pacientes que se encontraban los consumidores moderados de alcohol (n = 8), ni los niveles de proteína de RAR α ni RAR γ se encontró que difieren entre los tejidos obtenidos a partir de SCC y el tejido esofágico normal (datos no presentados). A continuación, los receptores se compararon los niveles de proteína entre SCC y el tejido normal de los pacientes que consumen elevadas cantidades de alcohol y fumado (n = 6). Curiosamente, sólo los niveles de la RAR γ resultaron ser significativamente más bajos de ~ 68% en RCS esófago en comparación con el tejido esofágico normal (p = 0.046). Como era de esperarse, en los pacientes, que había un "moderado" de alcohol y el consumo fueron los no fumadores, no se encontraron diferencias en los niveles de proteína o de RARs RXR β.

El ácido retinoico receptor de los niveles de proteína en el tejido normal de los pacientes con esófago de RCS y controles

Dado que se ha sugerido por los resultados de los demás (19) que los niveles basales de mRNA del receptor de ácido retinoico en la expresión normal de los tejidos no afectados puede diferir entre los pacientes con SCC y de control, los niveles de proteína de RAR α, β, γ, y RXR β se determinará de esófago Tejido obtenido el formulario y los controles en comparación con los niveles de proteína medido en el tejido esofágico normal obtenidas de los pacientes con esófago de RCS. Representante Western blots se representan en la figura 1 y un análisis cuantitativo de blots se resume en la figura 4. El análisis puso de manifiesto una mayor concentración de la proteína RAR γ normal en el tejido no afectado de los pacientes con esófago de RCS en comparación con los controles. En concreto, los niveles de proteína se encontraron ~ 2,7 veces más altos que en el tejido normal de los pacientes en comparación con los controles (p = 0,048). No se encontraron diferencias significativas al comparar los niveles de proteína de RAR α, γ, y RXR β medidos en condiciones normales, no afectados macroscópicamente muestras de tejido de pacientes y controles.

Discusión
Reforma de RAR RAR α γ y los niveles de proteína en los pacientes con esófago de CCS son en función de estilo de vida

En el presente estudio, se puso a prueba la hipótesis de que las alteraciones en los niveles de proteína de los receptores de ácido retinoico podría participar en el desarrollo de esófago de RCS en los seres humanos. De hecho, los niveles de la proteína RAR γ resultaron ser significativamente más bajos en relación con SCC tejido normal en los pacientes que fumaban y consumían alcohol. Una diferencia similar se encontró para RAR α SCC en pacientes que informaron a consumir "elevadas" cantidades de alcohol. Sin embargo, la disminución de los niveles de la RAR γ y RAR α Sólo se encuentran en estas subpoblaciones de pacientes con SCC en el esófago, lo que sugiere que el mecanismo subyacente que lleve al desarrollo de la SCC pueden variar en función de estilo de vida de los pacientes. Varios grupos han determinado anteriormente expresión de mRNA RARs y RXRs en el tejido esofágico normal y SCC. Zhang et al. [17] y Qiu et al. [18], que mide los niveles de mRNA RARs y RXRs encontrado una sorprendente reducción de la expresión de RAR β, pero no de RAR γ en el tejido maligno de esófago en comparación con el tejido normal. Además, en estudios in situ una menor expresión de ARNm RAR α se encontró en el esófago en comparación con SCC tejido normal [11]. Sin embargo, en estos estudios, no se ha dado información sobre los parámetros de estilo de vida tales como el tabaco y el consumo de alcohol y los pacientes no fueron sub-agrupados en consecuencia y sólo los niveles de expresión de mRNA RARs y RXRs fueron evaluados.

Debido al carácter retrospectivo de este estudio sólo se puede especular si la asociación de tabaquismo y la reducción de los niveles de la proteína RAR γ en el SCC es una de las causas - y efecto o no. Sin embargo, la acción de los carcinógenos del tabaco se cree que están mediadas a través de unión covalente al ADN, ARN, o proteínas, la formación de ADN, ARN y proteínas aductos [19]. Además, los resultados de los estudios in vitro e in vivo en los estudios [20] sugieren que los agentes carcinógenos del tabaco (por ejemplo, el benzo (a) pireno diol epóxido) podría dar lugar a la metilación del ADN de genes RAR posteriormente por resultado una inhibición de la expresión de RARs en lugar de mediar sus acciones Directa a través de mutaciones.

Varios mecanismos se han propuesto para explicar cómo la ingesta de alcohol puede interferir con el metabolismo de retinoides. En primer lugar, se ha demostrado que el alcohol puede actuar como un inhibidor competitivo de la oxidación de la retina al ácido retinoico en varios órganos (por ejemplo, colon y esófago) [21 - 23]. En segundo lugar, Liu et al. [24] informó de un aumento de catabolismo de los retinoides en metabolitos polares en el hígado de ratas alimentadas con etanol en comparación con el par de animales alimentados. Este resultó ser inhibida in vitro e in vivo por chlormethiazol, un inhibidor del citocromo P4502E1 (CYP2E1). Una parte importante de la inducción CYP2E1 se encontró después de una semana de la ingestión crónica de alcohol en seres humanos [25]. Por lo tanto, la inducción de la CYP2E1 (y / o de otras isoformas del citocromo P450), actividad durante la ingesta crónica de alcohol puede añadir a una reducción de la biodisponibilidad del ácido retinoico posteriormente provocando cambios en la expresión de RARs y RXRs. En tercer lugar, se ha demostrado que los niveles celulares de la proteína de unión del ácido retinoico (CRABP) puede reducirse en el carcinoma de esófago (por ejemplo, el adenocarcinoma y SCC) [26]. Esto, a su vez, puede conducir a alteraciones de la expresión del receptor y la cifra de negocios. Sin embargo, si estos mecanismos desempeñan un papel en el presente estudio aún no se han decidido.

RAR γ son los niveles elevados de proteínas en condiciones normales de la mucosa esofágica de los pacientes con SCC

Hasta ahora, la información sobre los niveles de proteína de los receptores del ácido retinoico en el tejido esofágico normal no afectados ha sido limitada. Recientemente, en un estudio de la determinación de la función de RXR mRNA en Barett esófago de los niveles de mRNA RXR β se encontraron a ser mayor en el tejido no maligno en pacientes con adenoma que en los controles sanos [27]. En el presente estudio, los niveles de la proteína RAR γ resultaron ser significativamente más altos en el tejido esofágico normal de los pacientes con esófago de RCS en comparación con los controles. Puede ser que las diferencias entre los resultados de otros [27] y el presente estudio se deben a diferencias de los pacientes (por ejemplo, pacientes con SCC frente a los pacientes con esófago de Barrett) o las diferencias de sensibilidad de detección (mRNA expresión frente a la proteína).

Conclusión

Los resultados de este estudio proporcionan una prueba más de que la disminución de la abundancia de los receptores de retinoides ácido en el esófago se asocia con el desarrollo de la SCC de esófago en los seres humanos. Además, en algunos pacientes el estilo de vida (por ejemplo, el hábito de fumar y el consumo de alcohol) pueden contribuir a la alteración de los niveles del receptor de ácido retinoico en el esófago. Más estudios serán necesarios para esclarecer esta interacción del consumo de alcohol, el tabaquismo, y la señalización del receptor de ácido retinoico en el desarrollo de la SCC en el esófago.

Conflicto de intereses

El autor (s) declaran que no tienen interés en competencia.

Contribuciones de los autores

IB ha realizado importantes contribuciones a la bioquímica y análisis de la redacción del artículo. EW ha contribuido de manera importante a la adquisición de datos, y la concepción, así como el diseño del estudio. EB, AHH, y CB han hecho contribuciones sustanciales a la concepción y el diseño, así como la interpretación de los datos. AP ha participado en el diseño, la redacción del artículo, y lo revisó críticamente importante de contenido intelectual. Todos los autores han dado la aprobación final de la versión que se publicará.