Plant Methods, 2005; 1: 11-11 (más artículos en esta revista)

Blue-PAGE en plantas nativas: una herramienta de análisis de las interacciones proteína-proteína

BioMed Central
Holger Eubel (heubel@cyllene.uwa.edu.au) [1], Hans-Peter Braun (braun@genetik.uni-hannover.de) [2], A Harvey Millar (hmillar@cyllene.uwa.edu.au) [1]
[1] ARC Centre of Excellence in Plant Energy Biology, University of Western Australia, 35 Stirling Hwy, Crawley 6009, Perth, Australia
[2] Abteilung Angewandte Genetik, Universität Hannover, Herrenhäuser Str. 2 30419 Hannover, Alemania

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Resumen

Complejos de proteínas intactas pueden ser separados por aparente masa molecular utilizando un estándar de la electroforesis en gel de poliacrilamida sistema que combina la suave y detergentes colorante Coomassie Blue. Refiriéndose a la gel de color azul y la suave método de solubilización rendimiento nativo y enzimáticamente activa de los complejos de proteínas, esta técnica ha sido nombrado Blue-Nativo Polyacrylamide Gel-Electroforesis (BN-PAGE). BN-PAGE se ha convertido en el método de elección para la investigación de los complejos de proteínas respiratorias de las cadenas de transferencia de electrones de una variedad de organismos, incluyendo bacterias, levaduras, animales y plantas. Permite la separación en dos dimensiones extremadamente hidrofóbica de juegos para el análisis de proteínas y también se proporciona información sobre sus interacciones. En este trabajo se discuten las capacidades de BN-PAGE en la proteómica y la más amplia investigación de las proteínas: proteína interacciones con especial atención a su uso potencial en las plantas y la ciencia.

Introducción

Con planta de la secuenciación del genoma de varios proyectos ya terminados y algunos otros a punto de concluir, el siguiente paso lógico es la evaluación de los productos de proteínas codificadas por estos genomas. La proteína composición de los distintos tejidos, tipos de células y orgánulos celulares aislados de una serie de especies de plantas han sido investigados hasta la fecha haciendo uso de la espectrometría de masas y péptido patrones de datos genómicos. Estos estudios han utilizado una variedad de enfoques para separar las proteínas, pero el enfoque isoeléctrico (IEF), seguido de SDS-PAGE (normalmente denominado un gel 2D) es la técnica más común. Este dominio es, a pesar de que esta técnica es muy limitada en su capacidad de mostrar el gran complemento de las proteínas de las plantas hidrofóbicas. Además, aun cuando las mejoras en esta norma 2D gel técnica podría aliviar aún más este problema hidrofobicidad, una completa comprensión de los procesos que tienen lugar en las células se requieren mucho más que la simple identificación de la persona polipéptidos que constituyen el proteoma. La mayoría de los procesos celulares requieren la acción de varias enzimas, a menudo cada uno de ellos de múltiples subunidades. Para incrementar la eficiencia, la especificidad y la velocidad de las vías metabólicas, estas enzimas se relacionan a menudo entre sí, formando temporal o estable más grandes complejos de proteínas. El conocimiento de la composición y / o estructura de estos complejos de proteínas dará lugar a una comprensión mucho más profunda de las vías metabólicas y de los procesos celulares que la proteína identidades solos son capaces de ofrecer.

Hay muchas maneras de investigar las interacciones de proteínas, cada una con distintas ventajas y desventajas. Muchos de los enfoques comúnmente utilizados hoy en día son los estudios de investigación de la interacción real o posible socio (s) de una proteína de interés. Ejemplos de ello son la levadura de dos sistemas híbridos, immunoprecipitation estudios con anticuerpos específicos y la más reciente utilización de TAP / FLAG desplegable ensayos, y FRET / BRET fluorescencia de los estudios in vivo. Sin embargo, estos enfoques no están diseñados para proporcionar un panorama general de la interacción proteína-proteína en un complejo proteoma de elección por un solo experimento.

Para una investigación en profundidad de los complejos de proteínas que forman la cadena respiratoria de los distintos organismos, Schägger et al. [1] desarrollado una novedosa estrategia experimental para investigar los distintos componentes de esta vía bioquímica. A través de la combinación de los detergentes y la leve tinte azul de Coomassie, para la sustitución de la muy denaturating detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), fue posible por primera vez para separar los complejos de proteínas intactas respiratorias por electroforesis. Refiriéndose a la gel de color azul y la suave método de solubilización rendimiento nativo y enzimáticamente activa de los complejos de proteínas, esta técnica ha sido nombrado Blue-Nativo Polyacrylamide Gel-Electroforesis (BN-PAGE). En los últimos 10 años, BN-PAGE en combinación con la segunda dimensión SDS-PAGE ha sido el método de elección para la investigación de los complejos de proteínas respiratorias de las cadenas de transferencia de electrones de una variedad de organismos, incluyendo bacterias, levaduras, animales y plantas . Esta técnica permite la separación en dos dimensiones extremadamente hidrofóbica de juegos para el análisis de proteínas y también se proporciona información sobre sus interacciones. Existe en la actualidad un número creciente de publicaciones que emplean este método para la investigación de otros hidrofóbicas hidrófilo y proteínas de alto peso molecular en los complejos de organismos diferentes. Recientemente, con la introducción incluso de los más sofisticados métodos de solubilización, BN-PAGE se ha utilizado para detectar interacciones específicas entre los grandes complejos de proteínas que ha dado lugar al descubrimiento de los llamados' supercomplexes'.

En este trabajo se discuten las capacidades de BN-PAGE en la proteómica y la más amplia investigación de las proteínas: proteína interacciones con especial atención a su uso potencial en las plantas y la ciencia. Las principales ventajas y desventajas de esta técnica en comparación con otras estrategias experimentales se menciona y una breve reseña sobre el pasado y las posibles aplicaciones futuras de BN-PAGE en la planta de ciencias se proporciona.

El principio de funcionamiento de BN-PAGINA
Separación electroforética

En el popular desnaturalización técnica de SDS-PAGE, el detergente iónico SDS funciones tanto en solubilizing y desnaturalización de las proteínas así como la prestación de carga negativa y, por tanto, unidireccional a la movilidad durante la electroforesis de proteínas. En BN-PAGE estas múltiples funciones se realizan por diferentes reactivos. Si bien no es deseado desnaturalización, la solubilización de los complejos de proteínas de membrana es necesaria y está a cargo de leve detergentes no iónicos como dodecylmaltoside, Triton X-100 o digitonin. Cargas negativas se adhieren a las proteínas solubilizados complejos, pero no por los detergentes y por la adición obligatoria de la negativa cargado tinte azul Coomassie G250. Disociarse tinte, separados de las proteínas en el gel se sustituye por correr por una alta concentración de Coomassie Blue en el cátodo de amortiguación (Figura 1A].

Preparación de la muestra
Maximizar la resolución de separación BN

Para maximizar la resolución de la BN-gel, que por lo general consiste en un gradiente de concentración de acrilamida 3-5% (w / v) en la parte superior (catódica final) a 13-16% (w / v) en la parte inferior (anódico final ) (Figura 1A]. En función de los gradientes de la acrilamida y su tamaño, la proteína parecen quedar atrapados en diferentes posiciones en el gel durante la carrera, lo que resulta en una aparente separación de los complejos de acuerdo con la masa molecular. BN-PAGE inicialmente se inventó para la investigación de componentes de la cadena respiratoria, por lo que se ha optimizado para la separación de 0,1 a 1 MDa proteína. Con una reducción de la concentración de acrilamida en la separación de gel es posible resolver los complejos de hasta 3-4 MDa en BN-PAGE. El uso de agarosa para sustituir la separación de poliacrilamida en el gel puede ser aún mayor si se considera los complejos o supercomplexes (hasta ~ 10 MDa) se espera [10].

Segunda y tercera dimensiones para geles BN

En combinación con un gel SDS sistema como segunda dimensión, BN-PAGE se utiliza a menudo como la primera dimensión múltiple dimensión de geles (Figura 1B]. Para una segunda dimensión, un carril de la BN-gel se pueden recortar y colocar en posición horizontal sobre la segunda dimensión de gel (que se encuentra en 90 ° a la dirección de la primera separación electroforética). Ayuda a la transferencia de la proteína / proteínas en la segunda dimensión de gel, la primera dimensión carril se puede colocar entre las placas de vidrio de la segunda dimensión de gel en su primera reunión. El gel es entonces emitidos con el carril que ya están en posición, y es más tarde completamente embebidos en el gel de apilamiento, de manera que se logre una transición sin tropiezos de las proteínas a partir de la primera en la segunda dimensión. En este caso es útil para hacer la segunda dimensión de gel delgado (por ejemplo, 1 mm) que la primera dimensión (por ejemplo, 1,5 mm) para garantizar que la franja BN gel permanece en el lugar durante este procedimiento. Un gel de apilamiento es necesaria para que el enfoque de la actualidad bandas verticales de la BN gel carril. En función del tipo de segunda dimensión utilizado, el BN-gel carril puede ser tratada antes de la segunda reunión de diferentes dimensiones con reactivos (véase más adelante). BN-PAGE, puede combinarse con IEF / SDS-PAGE, resultando en un sistema que permita 3D gel de muy alta resolución de muestras de proteínas (véase más adelante).

BN tinción de geles

Después de la eliminación exhaustiva de Coomassie tinte en una solución de 40-50% metanol y 10% ácido acético, la primera dimensión BN-geles se puede teñir con todos los procedimientos comúnmente aplicados como manchas de plata, clásica y Coomassie coloidal manchas y tintes fluorescentes. Tinción diferencial utilizando procedimientos covalentemente tintes fluorescentes de diferentes colores (diferencial de la electroforesis en gel, DIGE) también han sido empleados con éxito en geles BN [16] (Figura 3A]. Sin embargo, es importante la utilización de tintes fluorescentes que se unen covalentemente a la lisina residuos de cisteína en lugar de los residuos, ésta podrá tienden a desestabilizar disulfuro vínculos entre y dentro de los complejos de proteínas BN antes de la separación que hace la muestra inadecuado para el análisis de la compleja estructura nativa (H. Eubel, resultados no publicados).

Western Blot de la BN geles

Primera dimensión BN geles se pueden electroblotted éxito en la membrana de nitrocelulosa o PVDF si algunos se cumplen los requisitos (Figura 3B]. En primer lugar, el gel tiene que correr abortado en una etapa temprana (es decir, después de la mitad a dos tercios de los normales de tiempo de ejecución) para evitar que se conviertan en los complejos atrapados en los poros del gel. En segundo lugar, debido a la alta movilidad de Coomassie y su alta concentración en el gel, el cátodo de amortiguación debe ser intercambiado por uno que no contiene Coomassie después de aproximadamente dos horas de la campaña para prevenir excesivo tinte deposiciones de la membrana durante la transferencia [11]. Alternativamente, la membrana se puede reemplazar un par de veces durante las primeras etapas del proceso de secante para eliminar la mayor parte del colorante Coomassie. PVDF membranas en general, tienen una menor afinidad por Coomassie de nitrocelulosa [11].

Identificación de complejos de proteínas

Si un gel de referencia de la misma muestra de un tipo diferente de especies existe, complejos de proteínas a menudo pueden ser identificados por una simple comparación de los grupos en la subunidad BN / geles SDS. Dentro de un reino, ortólogos complejos suelen tener similar cantidad de subunidades con una distribución similar de masas moleculares. Esto le da un primer indicio de su identidad. Debido a la distancia evolutiva, una comparación entre especies de diferentes reinos, es a menudo difícil. La forma más eficaz de identificar los complejos de la proteína desconocida es la espectrometría de masas. Las muestras directamente por encima de una primera dimensión BN gel o una BN / BN gel puede ser sometido a la mezcla compleja de espectrometría de masas en tándem para identificar una serie de proteínas en el complejo. Alternativamente, subunidades individuales derivados de una BN / SDS PAGE gel puede ser utilizado para su identificación por espectrometría de masas en tándem o péptido masiva de huellas dactilares. A menudo, la identificación de algunas subunidades es suficiente para una identificación razonable de los complejos. En una estrategia complementaria para examinar la función y complejo también ayuda a la identificación, colorimétricas enzima ensayos se pueden realizar como en la actividad de las manchas de gel de primera dimensión BN [17, 18] (Figura 3C] o segunda dimensión BN / BN geles [14] ( Figura 3D].

Conocidas las limitaciones de BN-PAGINA
Detergentes

Para los complejos de proteínas de membrana, la utilización de BN-PAGE sólo está limitada por la disponibilidad de un detergente adecuado para el nativo de solubilización de la proteína. Sin embargo, hasta la fecha, sólo una colección muy limitada de los detergentes se ha ensayado para esta aplicación y, lamentablemente, hasta ahora no parece haber ningún detergente, que es adecuado para la disolución antes de BN-PAGE para todos los complejos de proteínas de interés (Cuadro 1 ). Realización de pruebas más detalladas de los detergentes se requiere para determinar la verdadera BN limitaciones de la técnica para el análisis de la membrana de proteína.

Resolución

El número de puntos a partir de una muestra resuelto en un 2D BN / SDS PAGE gel es normalmente más pequeña que de la misma muestra resuelto por 2D IEF / SDS PAGE. Esto se debe principalmente al hecho de que las proteínas no están distribuidos sobre toda el área en 2D BN / SDS PAGE, pero dispuestos en filas verticales. Aún más que en otros de gel de los enfoques basados en proteómica, este dicta una reducción de la complejidad de la muestra BN separaciones. Única o complejos de proteínas de un peso molecular <100 kDa no están bien resueltas en BN-PAGE debido a la alta abundancia de las proteínas en ese rango de tamaño limitado y la distancia de separación resultante de la acrilamida gradiente. Otro inconveniente de resolución parece ser un rango dinámico más bien limitada, dando lugar a una atención especial en los más destacados complejos de proteínas y una escasa representación de la menor abundancia de los complejos de BN en geles.

Artefactos

Co-migración de las proteínas en geles BN-no es una prueba definitiva de la asociación nativa como físicamente distintos complejos pueden tener masas moleculares similares y, por tanto, puede aparecer en las mismas bandas de proteína. Sin embargo, la resolución de esta técnica es mucho más elevado que los tradicionales enfoques de la cromatografía de filtración en gel, y si la muestra ha sido bien fraccionada para limitar la complejidad consideramos que es una excelente línea de las pruebas para la asociación. La confirmación se pueden obtener con immunoprecipitations o compañeros de la migración en condiciones diferentes (por ejemplo, no basado en la cromatografía de tamaño). Débiles o transitoria de las interacciones entre proteínas o complejos proteicos constituyen otro desafío para el sistema. Incluso si un detergente es encontrado, debilitará inevitablemente a la asociación de las proteínas. La adición de Coomassie podría conducir a la disociación de los complejos de proteínas frágil, porque los cargos negativos sobre subunidades de proteínas de una proteína compleja puede conducir a la repulsión eléctrica. La capacidad de unión de Coomassie y, por tanto, la movilidad electroforética depende de las propiedades físicas y químicas de las proteínas, por ejemplo, tamaño, forma, hidrofobicidad, post-transcripcional modificaciones y punto isoeléctrico. Esto puede hacer que sea difícil de juzgar con precisión la masa molecular de una banda en un BN-gel [19].

Actualidad aplicaciones biológicas de BN-PAGINA
Estudios de la mitocondria y el cloroplasto cadenas de transporte de electrones

BN-PAGE se han utilizado para investigar la estructura de la cadena respiratoria en las plantas. En mamíferos mitocondrial muestras de todos los componentes de la OXPHOS proteína podría resolverse en las primeras investigaciones utilizando BN-PAGE [1]. Sin embargo, en las mitocondrias de plantas sólo los complejos I, III y V se presente en la primera BN-PAGE geles y disociación de los complejos particular se señaló como la liberación de la F1 componente del complejo V [20]. La asamblea del complejo I de mitocondrias de maíz [21], así como Chlamydomonas ha sido estudiado por BN-PAGE [22]. Asimismo, la composición de los complejos Iy función específica de subunidades en la planta Arabidopsis se han investigado [23 - 25]. Resolución del complejo III ha permitido que el centro de investigación de las proteínas del citocromo reductasa de la patata [20] y de la evolución conjunta de estas proteínas de organismos diferentes [26]. Las proteínas responsables de la elaboración de la esterilidad masculina citoplasmática (CMS) han sido identificados por BN-PAGE como subunidades del complejo V [27, 28]. BN-PAGE también se ha empleado para vigilar la pureza de las mitocondrias aislamientos de Brassica [29] y Arabidopsis [30, 31]. Desde la finalización de la Arabidopsis y el arroz, la secuenciación del genoma del proyecto y el inicio de la base de gel de la proteómica, la BN-PAGE también se ha empleado más para concluir las investigaciones de la cadena respiratoria [15, 32], con el objetivo de proporcionar una visión más amplia de la planta de proteína mitocondrial Complejos y su composición subunidad. Sin embargo, los complejos II y IV que siguen desaparecidos en la mayoría de estos geles. Esto cambió con la introducción de digitonin para la solubilización de los complejos de proteínas de membrana mitocondrial. Digitonin no sólo condujo a la estabilización de estos otros complejos de los geles y el descubrimiento de la planta de subunidades específicas dentro de ellos [6, 33], sino que también impidió la disociación de supercomplexes respiratorio, formado por componentes de la cadena de transferencia de electrones [6, 14, 34, 35].

Varios estudios también han utilizado BN-PAGE para el análisis de la fotosíntesis y de los complejos de proteínas plastidic F 0 F 1 - ATPasa [36 - 50]. Una vez más, la utilización de digitonin ha facilitado la solubilización de la proteína supercomplexes [41], que confirma los resultados obtenidos por cristalografía y microscopía electrónica única seguida por el análisis de partículas (para una revisión ver [51]]. Otras investigaciones en la utilización de esta técnica de investigación incluye la planta de orgánulos de la investigación de la NAD (P) H deshidrogenasa de thylakoid y etioplast membranas [52 - 56].

Otras aplicaciones de las plantas

En una serie de publicaciones BN-PAGE también se ha utilizado para el estudio de la proteína mitocondrial y plastidic importación aparato [15, 57 - 62] y de la inserción de proteínas thylakoid sistemas [63 - 66]. Se ha empleado para la caracterización de los sectores del tabaco plastidio codificada plastidio ARN-polimerasa complejo [67, 68] y plastidic omega-3 saturases [69], así como a 350 kDa plastidio ClpP proteasa complejo [67]. BN-PAGE también se ha utilizado para el análisis de la maduración complejo citocromo c [70], un acetil-coenzima A carboxylase [71], un isovaleryl coenzima A deshidrogenasa [72], el formato deshidrogenasa [73] y varios otros soluble Proteína mitocondrial complejos [74]. Complejos de proteínas de la membrana plasmática de las espinacas se han resuelto con éxito por BN-PAGE [75] al igual que en los complejos de la membrana de peribacteroid Lotus japanicus raíz nódulos [76] y en los microsomas de Arabidopsis [77]. A ~ 200 kDa proteína compleja de maní que representa un putativo de alimentos alergénicos también se ha caracterizado por BN-PAGE [78].

Diversas aplicaciones en bacterias, levaduras y mamíferos

El uso de detergentes y varios anticuerpos, Camancho-Carvajal et al. [3] identificado varios complejos de proteínas en lisados de células enteras de las líneas celulares humanas sin previo subfractionation y enriquecimiento. Aplicando BN-PAGE y otras técnicas, también se determinó que la proteína nucleosome asamblea PAN-2 forma parte de los complejos de multiprotein en cultivos de células HeLa humanos [79]. Shibatani et al. [80] descubrió que un mamífero oligasaccharyltransferase complejo forma parte integral de la translocación ER maquinaria. Más de diez complejos de proteínas fueron descubiertas en la membrana peroxisomal de la levadura H. Polymorpha [81]. En varias publicaciones, BN-PAGE se ha utilizado para investigar presenelin / γ-secretase complejos, asociados con la enfermedad de Alzheimer [82 - 87]. Krall et al. Resolver diferentes complejos de proteínas VirB de A. Tumefaciens [88]. La E. Twin coli Arginina Translocase [89] ha sido analizado por BN-PAGE, así como los humanos de los receptores de glicina, un miembro de la ligando-gated canal de iones (LGIC) superfamilia I, expresada en Xenopus ovocitos [90]. Recientemente, un análisis sistemático de la E. Coli sobres reveló la presencia de 43 complejos de proteínas [91], por lo que resulta el más amplio enfoque de análisis de la membrana de proteínas complejas que emplean BN-PAGE hasta la fecha. Como resultado de su amplio análisis, este estudio también fue capaz de asignar varias proteínas con funciones desconocidas a los complejos de proteínas específicas.

BN oportunidades de futuro en la investigación con plantas

Es cada vez más evidente que los complejos de proteínas no son una excepción, sino que es un principio básico de trabajo de la célula. BN-PAGE pueden proporcionar datos no sólo sobre la composición de proteínas complejas, también puede ser utilizado para aumentar nuestros conocimientos sobre el contenido de proteína de un proteoma de elección. La utilización de BN-PAGE en la investigación de los complejos de la planta de membrana ya ha revelado numerosas diferencias en el metabolismo de la planta en comparación con la de las bacterias, los hongos y los mamíferos. Tomando el estilo de vida de las plantas en consideración, un gran número de diferentes vías metabólicas o único que se podría esperar que se presente. Estas vías casi con toda seguridad la existencia de la demanda de plantas específicas de los complejos de proteínas. Hasta el momento, la mayoría de los complejos de proteínas caracterizado hasta la fecha en las plantas están involucrados en el metabolismo de la energía y el sistema de replicación genética. El gran número de poros, los transportistas y los transportistas presentes en las membranas de las células vegetales aún no se caracteriza en un nivel bioquímico, el mismo es cierto para los numerosos complejos de las proteínas implicadas en la percepción y la señal de transducción de señales. Debido a su relativamente baja resolución, en comparación con otras técnicas basadas en gel, el futuro de la BN-PAGE será probablemente vinculado a la investigación de subproteomes definidos de la célula.

BN-PAGE para estudiar aún más la planta proteomes

Enfoques para separar y analizar proteomes se seguirá desarrollando para complementar IEF-SDS/PAGE. La combinación de técnicas de muy probablemente como resultado una mayor cobertura de cualquier proteoma. Por un lado no gel enfoques se están convirtiendo en un criterio dominante para separar y analizar mezclas complejas de péptidos por espectrometría de masas [92, 93]. Estos tienen la ventaja de que representa mejor el proteoma hidrofóbicas, pero sufren de pérdidas en la cuantificación de los miembros del proteoma en comparación con IEF-SDS/PAGE. Por otro lado, un enfoque como el BN-PAGE cuantificación puede mantener y mejorar en gran medida la identificación de proteínas hidrófobas. Una comparación directa de la proteína conjuntos de la Arabidopsis mitocondrias proteoma derivados ya sea por IEF / SDS-PAGE [30, 94] o BN / SDS-PAGE [6, 23, 33] revela sólo una ligera diferencia en el promedio de los Grand Promedio De Hydropathicity (GRAVY) resultados de las series (-0,23 y -0,13). La raíz cuadrada media, sin embargo, es dos veces más alto para el conjunto de derivados BN (0,40) que para el IEF derivados-set (0.20). Esto indica claramente una gama mucho más amplia en la GRAVY resultados para el conjunto derivado de BN / SDS-PAGE. En la BN conjunto, el 22% de las proteínas poseen GRAVY puntuaciones por encima de cero, mientras que esto sólo es el caso el 7% de las proteínas identificadas por la FEI.

Se podría argumentar que los aspectos técnicos de BN-PAGE hacen poco probable que sea adoptado ampliamente fuera de laboratorios especializados. Hasta la fecha, los usuarios de BN-PAGE aún tienen que preparar sus propios primera dimensión geles. Ser un gradiente de acrilamida, puede ser la preparación de la FEI en comparación con el tubo de geles en términos de mano de obra y el tiempo necesarios. Sin embargo, en contraste a la FEI, no se necesita equipo especial para realizar BN-PAGE. Cualquier sistema común vertical gel puede ser modificado fácilmente para satisfacer los requisitos de BN-PAGE. El protocolo original de IEF / SDS-PAGE [95, 96] utiliza la libre emitidos, intensiva en mano de obra para geles de tubo de la primera dimensión. Desde la introducción de los sistemas de venta en el comercio IEF empleando gradiente de pH inmovilizado (IPG) tiras, el uso de geles de tubo ha reducido en gran medida. Manipulación de las tiras IPG es fácil y, a causa de la masa de la producción, que garanticen un mayor reproducibilidad. Varios tipos de tiras IPG están disponibles en el comercio, dando el investigador la oportunidad de elegir el rango de pH adecuado y degradado por su aplicación. Más productos comerciales para la BN podría producirse si el mercado ampliado.

BN-PAGE para el análisis de proteínas: proteína de las interacciones en las plantas

La mayoría de los análisis del proteoma de las plantas hasta la fecha, bien considera que la ubicación de las proteínas en las células o son un análisis diferencial de expresión en respuesta al desarrollo, el medio ambiente o las enfermedades. Esto carece de la información sobre el patrón de la interacción de estas proteínas, que es un aspecto muy importante de la comprensión de los procesos llevados a cabo por los miembros del proteoma. Popular técnicas para determinar la interacción de las proteínas son socios de la levadura de la técnica de dos híbridos (Y2H), la cromatografía de afinidad (por ejemplo tándem afinidad de depuración [TAP]), la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET), la transferencia de energía de resonancia bioluminiscencia (BRET), bimolecular Fluorescentes de complementación, de alto rendimiento espectrometría de masas de proteínas complejas de identificación (HMS-PCI), el tamaño de cromatografía de exclusión (SEC) y enlaces experimentos. La mayoría de estas técnicas requieren que el organismo de elección para ser accesibles a la ingeniería genética. Con la excepción de la SEC y algunos enlaces cruzados técnicas, todos estos enfoques tienen en común que se centran en una sola proteína y determinar su carácter vinculante.

La levadura de dos sistema híbrido que se ha utilizado mucho para el estudio de proteínas: proteína en la interacción S. Cerevisiae [97, 98], pero se sabe que un número relativamente alto de falsos positivos [98]. En uno de los mayores usos de HMS-PCI, 493 cebo proteínas en S. Cerevisiae se encontraron involucrados en interacciones 3617 después de la corrección de los falsos positivos, el 74% de estas interacciones pueden ser confirmada por inmuno-precipitación experimentos [99]. Estos números dan una idea de la complejidad de las redes de proteínas dentro de una célula y hacer hincapié en la necesidad de formas complementarias para el análisis de las interacciones proteína in vivo. Por tratarse de una técnica preparativa, la SEC tiene una resolución más baja en comparación con el BN-PAGE. Asimismo, el tamaño de la micela detergente y agregaciones inespecíficos posible tener una influencia en el tamaño aparente de una proteína compleja en la SEC. En BN-PAGE, estos efectos se han reducido por la presencia de Coomassie azul y aminocaproic ácido [2]. Químicas crosslinkers normalmente sólo adecuado para el análisis de los pequeños complejos de proteínas y enlaces experimentos a menudo sufren de pobres rendimientos de la interacción de proteínas [100]. Esto a menudo requiere tiempos de incubación largo que, a su vez, aumentan la probabilidad de la generación de artefactos o conduzca a una desestabilización del complejo. Con la introducción de foto-inducible enlaces cruzados de las proteínas, el riesgo de formación de artefacto se ha reducido considerablemente [101]. La introducción de enlaces cleavable transversal permite la identificación directa de los sitios de interacción de proteínas por espectrometría de masas [102]. Sin embargo, a nuestro conocimiento, esta técnica es aún limitada a relativamente pequeña proteína. También permite ninguna calificación de la fuerza vinculante entre las proteínas dentro de la compleja debido a la covalentes modificaciones introducidas por la técnica. Y por supuesto, mucho cuidado que se ha tenido en la elección de la cruz-reactivo de la vinculación de evitar falsos positivos. BN ofrece un enfoque más amplio, como la composición de muchos de los pequeños y los grandes complejos de proteínas y, por tanto, la interacción de todos sus patrones de subunidades de proteínas en una muestra relativamente complejo puede determinarse en un solo experimento. Además, la sobreexpresión de proteínas y / o modificación química no está involucrado, que a menudo permite altos rendimientos de los nativos complejos para el análisis.

Conclusión

Desde su invención, BN-PAGE ha tenido un enorme impacto en la investigación de la cadena respiratoria y fotosintética complejos en una variedad de organismos. Cuando se utiliza en un sistema de 2D, BN-PAGE permite la cesión de las proteínas a sus complejos de proteínas y de visualización de proteínas altamente hidrofóbicas en dos dimensiones. Recientemente, BN-PAGE está empezando a ser aplicado a diferentes tipos de muestras y con diferentes objetivos. Estos van desde la evaluación de la oligomeric estado de los complejos de proteínas para el análisis de mezclas complejas de la proteína. BN-PAGE, junto con otras técnicas, podría ser la herramienta ideal para comenzar el estudio de las nuevas plantas en los complejos de proteínas y de tener una mejor comprensión de los aspectos singulares de las interacciones proteína-proteína en la planta de procesos celulares.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

AHM se financia como un Consejo de Investigación Australiano (ARC) QEII Becario y gracias ARC para financiación en el marco del ARC Centro de Excelencia del Programa. HPB cuenta con el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención Br1829-7 / 1).