Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 26-26 (más artículos en esta revista)

Las respuestas de citocinas durante denervación crónica

BioMed Central
Saku Ruohonen (saku.ruohonen @ utu.fi) [1], Mohsen Khademi (mohsen.khademi @ cmm.ki.se) [2], Maja Jagodic (maja.jagodic @ cmm.ki.se) [2], Hanna - Stiina Taskinen (hantas@utu.fi) [3], Tomas Olsson (tomas.olsson @ cmm.ki.se) [2], Matías Röyttä (matroy@utu.fi) [1]
[1] Department of Pathology, University of Turku, Kiinanmyllynkatu 10, 20520 Turku, Finland
[2] Department of Neuroscience, Karolinska Institute, 17176 Stockholm, Sweden
[3] Department of Handsurgery, Turku University hospital, Kiinanmyllynkatu 10, 20520, Turku, Finland

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Resumen
Antecedentes

El objetivo del presente estudio fue evaluar respuestas inflamatorias durante Wallerian degeneración de los nervios periféricos, en la rata, cuando el rebrote de los axones fue impedida por la sutura.

Métodos

Transected rata nervio ciático se suturadas y ligated para prevenir reinervación. Las muestras se obtuvieron de la izquierda nervio ciático proximal y distal desde el punto de transection. El endoneurium fue separado de su entorno y epi-perineuro para examinar la expresión de citocinas en ambos compartimentos. Macrófagos invasión en endoneurium se investigó y la proliferación de las células Schwann fue seguida, así como la expresión de las citocinas IL-1 β, IL-10, IFN-γ y TNF-α mRNA. Las muestras se obtuvieron a partir del 1 día hasta 5 semanas después de la primera operación.

Resultados

En días 1 a 3 después de la lesión en la epi-/perineurium del muñón proximal y distal, una marcada expresión de la citoquina pro-inflamatoria TNF-α e IL-1 β y de las citoquinas antiinflamatorias IL-10 se observó. Al mismo tiempo, numerosos macrófagos comenzado a reunir en la epineurium de ambas cepas proximal y distal. En el día 7 el número de macrófagos disminuyó en el perineuro y aumentado notablemente en la endoneurium de ambas cepas. En este momento el punto marcado expresión de TNF-α y IFN-γ mRNA se observó en la endo-y epi-/perineurium proximal del muñón. A los 14 días un notable aumento de la expresión de la IL-1 β puede ser observado en el muñón epi-/perineurium proximal y distal en el muñón endoneurium. En ese momento muchos macrófagos punto se observaron en la seccionaron longitudinalmente epineurium proximal de la zona 2, así como en la sección de diapositivas desde el muñón distal. Al día 35 de TNF-α, β IL-1 e IL-10 mRNA parecía abundantemente en el proximal epi-/perineurium junto con los macrófagos.

Conclusión

Los estudios actuales demuestran que, incluso durante denervación crónica existe un patrón cíclico de expresión de la citocinas. Contrariamente a los resultados anteriores de los nervios reinnervating las citocinas muestran el incremento en la expresión de hasta 35 días. El alto las expresiones del pro-inflamatorias y anti-citoquinas inflamatorias en la zona proximal epi-/perineurial al día 35 pueda participar en la formación de la fibrosis irreversible debido a la lesión del nervio y, por tanto, puede tener importancia para la formación de neuroma traumático.

Antecedentes

Durante Wallerian degeneración, macrófagos entrar en el sistema nervioso periférico [1 - 3] cuando permeabilidad de la BNB se incrementa. El aumento de la permeabilidad de BNB conduce al aumento de la infiltración de macrófagos en la endoneurium [4, 5]. Lesión de células de Schwann activado y macrófagos residentes, probablemente, en parte, son responsables de la contratación de los macrófagos hematógena secretando MCP-1 [6] y las citoquinas proinflamatorias IL-1, IL-6, IL-12, y especialmente TNF-α, En la fase temprana de la reacción inflamatoria [7 - 13]. La principal población de macrófagos en el nervio periférico es derivado de la sangre después de la lesión. Estos se reúnen en la endoneurium para iniciar la fagocitosis de los axones y mielina cepas [14, 15]. Macrófagos y células de Schwann mediar y promover la inflamación después de la lesión, por la producción de citoquinas pro-inflamatorias, pero tienen también efectos positivos sobre factores neurotróficos, que puede inducir la brotación axonal [16]. Macrófagos, así como células de Schwann expresar también anti-inflamatorios como las citocinas IL-10 y TGF-β1, para inhibir la inflamación [17 - 21]. La función de TGF-β1 durante la lesión del nervio parece ser controvertida. Aumenta la regeneración neuronal [19, 22], pero disminuye la producción de NGF [23 - 25] y mata células de Schwann junto con TNF-α [26].

En el presente estudio permanente daño a los nervios fue inducida por la sutura proximal y distal extremos de la transected nervio ciático, a fin de crear un modelo de denervación crónica. Desde cantidades relativamente pequeñas de mRNAs de citoquinas están presentes en el nervio tocones en tiempo real de reacción en cadena de polimerasa se utilizó para facilitar la detección de las citocinas. Además, las diferencias morfológicas se han seguido para investigar posibles correlaciones con citocinas producidas.

Materiales y métodos
Animales de experimentación

Adultos jóvenes de sexo masculino ratas Sprague-Dawley (n = 70) han sido utilizados en el presente estudio. Los animales se mantuvieron en la Universidad de Turku Animal Centro. (12-h circadiana de ritmo, T = 21 ± 1 ° C, humedad de 50 ± 5%)

Diaria normal de atención se proporcionó a la nutrición (Chow Lactamin R36, Södertälje, Suecia) y agua ad libitum. El presente estudio fue aprobado por el Comité Ético de Experimentación Animal (permiso no. 1080/01).

Procedimientos operativos

El nervio ciático izquierdo y transected fueron expuestos en el nivel de articulación coxofemoral bajo pentobarbital (Mebunat ®) anestesia. La regeneración en el nervio ciático izquierdo fue impedida con la sutura proximal y distal de los tocones junto al punto de transection [27]. El derecho nervio ciático se dejó intacta. Además, el control de los nervios normales, se recogieron muestras de lo normal, unoperated ratas de la misma edad. Se recogieron muestras de 1 día, 3 días, 5 días, 7 días, y 2, 3, 4 y 5 semanas después de la primera operación. Para los posteriores estudios bioquímicos seis ratas se sacrificaron en cada punto del tiempo, y dos en cada momento el punto de los estudios de inmunohistoquímica. El nervio ciático de tres ratas normales fueron estudiados como controles negativos. Las ratas fueron intracardially perfundidos con solución salina estéril al 0,9% o 4% con fosfato de búfer formalina. Los nervios se cortaron en secciones de 4 mm en condiciones de congelación (en una cápsula de Petri cubierto lleno de hielo).

PCR en tiempo real y las muestras histológicas

Las muestras fueron tomadas tanto proximal y distal desde el punto de transection. Para evitar daños locales y / o suturas junto al punto de transection, la inicial de 1 mm de sección junto a la cuestión de transection fue descartado. Por PCR en tiempo real y el análisis inmunohistoquímico dos secciones de 4 mm (P1, P2) se redujeron a partir de 1 mm proximalmente desde el punto de transection. Asimismo, distalmente se cortaron dos secciones, una (D1) a partir de 1 mm de inmediato desde el punto de transection y el otro (D2) a partir de 5 mm distal desde el punto de transection (Fig. 1]. Además, para la PCR en tiempo real estudios, la endoneurium fue separado de su entorno periurbano y epineurium (Fig. 2] [28]. Todos PCR en tiempo real las muestras fueron inmediatamente inmersos en una solución de GITS, congelados a -196 ° C con nitrógeno líquido y se almacena a -70 ° C. Las muestras se agruparon de seis ratas por cada vez más crítico para la obtención de material homogéneo para el estudio de PCR.

Inmunohistoquímica

Los animales de la perfusión morfológicos muestras fueron fijadas con 4% de fosfato de formalina tamponada y todo el nervio periférico muestras fueron expuestas a la noche a la mañana y fija en el 4% de fosfato de búfer formalina. Las muestras fueron incluidas en parafina y 4 - μ m se cortaron secciones de análisis inmunohistoquímico. Las secciones de parafina fueron tratados con xileno y la disminución de las soluciones para eliminar el alcohol de parafina y, a continuación, hidratado y digeridos con pepsina 0,4% en HCl 0,01 M durante 60 min. Endógena actividad peroxidasa fue bloqueado mediante el 0,3% de H 2 O 2 en metanol, después de que las secciones se incubaron durante 60 min con suero de caballo para prevenir la tinción no específica. Las secciones fueron tratados con el anticuerpo monoclonal ED-1 (Serotec 0591) de los monocitos / macrófagos o S-100 (Dakopatts) de células de Schwann la noche a 4 ° C. Encuadernación anticuerpos se demostró utilizando un método avidina-biotina con un Vectastain ABC kit de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Además, el suero de ratas normales se utilizó con el segundo anticuerpo para disminuir la tinción no específica.

La contratación de los macrófagos se evaluó microscópicamente. Semi-cuantificación de los cambios que se realizó en nuestros estudios anteriores [1, 29]. En el endoneurium la evaluación visual de los macrófagos se hizo con una escala de cuatro: 0 = sólo ocasionalmente macrófagos similar a la observada en el control de los nervios; + = algunos macrófagos, no focales acumulación de los macrófagos; + + = macrófagos con varios centros de acumulación , Phagocytotic actividad actual; + + + = numerosos macrófagos con phagocytotic actividad. Los mismos principios se utilizan en la epineurium. Sin embargo, esta evaluación se realizó con una escala de tres: 0 = sólo ocasionalmente macrófagos similar a la observada en el control de los nervios; + = unos por los macrófagos en la sección transversal epineurium; + + = más de 10 por macrófagos sección transversal en la Epineurium.

Células de Schwann se evaluaron utilizando técnicas similares. Sin embargo, la proliferación de las células de Schwann patrón fue similar a la encontrada en estudios anteriores [29]. Por lo tanto, los datos de las células Schwann es que no se muestran.

Immunofluorochemisty

Por immunofluorochemical estudios venas de los animales se tiñeron con Dextran-FITC (Sigma, FD2000S) de la inyección iv. El importe de FITC-Dextran fue titulada a 100 mg / kg para mostrar las venas del nervio ciático en su conjunto a montar experimento. Treinta minutos después de la inyección, los animales fueron perfundidos con solución salina y el 4% de fosfato de búfer formalina. Se tomaron muestras proximal y distal desde el punto de transection. El nervio tocones de la noche a la mañana se habían fijado en el 4% de fosfato de búfer formalina y luego fue trasladado a un 70% EtOH. El nervio cepas fueron cortadas en cuatro secciones longitudinales antes de lavar con TTBS y Triton-X permeabilización. BSA (1%) se utiliza para prevenir la tinción no específica. Las secciones fueron tratados con el anticuerpo monoclonal ED-1 (1:200; Serotec 0591) 2 h a 37 ° C. Bound se demostró utilizando anticuerpos de cabra anti-ratón-Alexa 555 anticuerpo (1:200; Molecular Probes). El número de ED-1 células fueron positivos en comparación con la observada en el control de los nervios unoperated ratas, usando muestras de sección transversal de la misma zona. Las muestras fueron estudiadas por microscopio confocal (LSM 510, Zeiss Axiovert 200).

Determinación de ARNm de citoquinas y de endo-epi / perineuro

Combinados y congelados nervio tocones fueron homogeneizadas con Ultra-Turrax. El ARN se modificó preparación de Chomczynski y Sacchi [30]. ARN fue extraído utilizando Trizol (Gibco BRL 15596-018), según el ácido fenol-cloroformo-quanidium tiocianato método de extracción. MRNA fue purificado de RNA total, y luego transcritas para invertir-cDNA. La transcripción reversa se realizó con 10 μ g de mRNA, y Superíndice la transcriptasa inversa (200 U; Tecnologías de la Vida). Las muestras se midieron con PCR en tiempo real.

CDNA de amplificación se realizó con el ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems) con un plan en dos etapas protocolo de PCR (preincubación 10 min a 95 ° C seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos y a 60 ° C durante 1 min) . Todos los primers y sondas de citoquinas fueron diseñados utilizando software Primer Express (Applied Biosystems) evitar la contaminación de ADN genómico de amplificación mediante la colocación de una de las cartillas o una sonda durante el exón / intrón frontera. Las sondas fueron marcadas con FAM a los 5 'finales como reportero TAMRA tinte y en el extremo 3' como quencher tinte. El gen GAPDH se utilizó como control estable endógeno.

Absoluta cuantificación se realizó con un método estándar de la curva. Se construyeron las curvas de calibración utilizando tres 100 veces diluciones estándar de la muestra (por IL-1 β se plásmidos las normas que contiene el gen correspondiente de citoquinas; para GAPDH, TNF-α y la IL-10 son las normas de cDNA concanavalin-A de rata estimulado los ganglios linfáticos Células) y los correspondientes ciclos de umbral (Ct) valor. Las muestras se ejecute por triplicado para la meta de citoquinas endógenas y GAPDH controles. Después de la computación las cantidades relativas de la meta de citoquinas endógenas y de control para una muestra, el importe final de la muestra de citoquinas en que se presentó como la relación entre el y la cantidad de citoquinas endógenas y la suma de control, GAPDH. Por PCR en tiempo real, los resultados cuantitativos están disponibles directamente después de la PCR sin adicionales de depuración o análisis de las medidas. Los niveles de proteína de citocinas no se estudiaron.

Los resultados fueron importados en Microsoft Excel y leyendas se hicieron con GraphPad Prism. SEM se calculó con un solo sentido ANOVA y t-test, que se hicieron con Microcal Origen. La fuente SEM no refleja la diferenciación entre los animales, pero la precisión metodológica.

Resultados
Resultados de la PCR en tiempo real los estudios
Los resultados de los estudios morfológicos
Discusión

Para lograr un modelo de lesión del nervio crónica, y en un intento de provocar marcados y duraderos cambios inmunológicos, transected nervio ciático se suturadas y ligated para prevenir reinervación. Con el fin de entender mejor la dinámica de lo posible en diferentes compartimentos en el nervio periférico, la endoneurium fue separado de su entorno epi / perineuro (Fig. 2] [28] y estos compartimentos se analizaron por separado. Anteriormente hemos demostrado que después de nervio periférico transection un notable número de macrófagos aparecen en primer lugar en la epineurium, después de lo cual entrar en el endoneurium [1]. Por lo tanto, la expresión de citocinas pueden diferir en estos compartimentos nervio periférico debido a la expresión de citocinas como la IL-1 β y TNF-α, que afectan a la permeabilidad vascular [31] y conducir a un aumento de la infiltración de macrófagos en el espacio endoneurial durante Wallerian degeneración. Nuestros estudios previos sobre la degeneración de los nervios periféricos y la regeneración [29, 32, 33] indican que cuando los nervios están suturadas tocones para evitar la regeneración, la fuente más importante para endoneurial después de la fase de expresión de citoquinas podría ser células de Schwann y posiblemente fibroblastos. Estos tipos de células son significativamente durante el presente más adelante, cuando los puntos monocitos / macrófagos ya están casi ausentes en la endoneurium. La principal fuente para el marcado de citoquinas pro-inflamatorias en la expresión epi-/perineurium sería macrófagos. Sin embargo, las células también pueden presentar una potente fuente de citocinas en el sistema nervioso periférico [34].

Las principales fuentes de IL-1 β después de la lesión del nervio periférico son los macrófagos y células de Schwann [35, 36]. En el presente estudio los macrófagos fueron numerosos en la muestra simultánea proximal perineuro alta expresión de la IL-1 β mRNA en el epi-/perineurium en día 1-5. La expresión de la IL-1 β aumentó a un máximo en 14 y 35 días después de la lesión en la epi-/perineurium. A los 14 días en la sección transversal epineurial muestras macrófagos fueron casi ausente. Sin embargo, en las muestras estudiadas por longitudinal microscopio confocal, centros de acumulación de los macrófagos se observó en esta zona en particular. El muñón distal mostraron un marcado expresión de la IL-1 β en la endoneurium a los 14 días y en este momento el punto numerosos macrófagos, así como células de Schwann presentes en el distal endoneurium.

Hemos observado anteriormente que, tras clásica Wallerian degeneración y regeneración, TNF-α mRNA es upregulated distal en la zonas de las 14 horas para el día 5 y el día 14. En las zonas proximales de TNF-α se expresa de 14 horas para el día 1 y de nuevo el día 5 [32]. Los resultados actuales con los nervios suturadas presentan un patrón similar de expresión. TNF-α mRNA expresión aumentó rápidamente a las 24 horas tanto en la endo-y epi / perineuro de las zonas proximal y distal. TNF-α tiene varias capacidades de mediación de la inflamación durante la lesión del nervio periférico [37 - 40]. Así, marcado rápido de activación que se necesita para estimular reacciones inflamatorias de los macrófagos [41, 42]. Esto incluye la infiltración de macrófagos en el BNB endoneurium cuando se desglosa [43] al comienzo de la degeneración Wallerian [44] donde el TNF-α muestra patógenos acciones [8]. Se encontró un leve aumento de TNF-α mRNA expresión a los 14 días en la zona distal. Este aumento de expresión podría estar relacionada con el aumento de la permeabilidad vascular a las dos semanas [5, 31]. Además, el número de las células de Schwann comienza a disminuir en este momento el punto [29] y, por tanto, una explicación de este distal TNF-α mRNA expresión a los 14 días podría ser la capacidad del TNF-α para inducir la apoptosis de las células Schwann [45]. En el presente estudio, sin embargo, la expresión de TNF-α en el muñón distal es relativamente mucho menor a los 14 días en comparación con nuestros estudios anteriores sobre los nervios libremente regenerativa. Esto indica que la llegada de los axones al muñón distal sería también un posible iniciador de la apoptosis de las células de Schwann y, por lo tanto, un inductor de la expresión de TNF-α en la zona distal. El más notable de TNF-α mRNA expresiones se señaló el día 35 en la epi-/perineurium proximal de la zona 2. Este pico de expresión no se ha observado en modelos libremente regenerativa nervio [32, 46]. La razón de esto no se conoce.

En el presente estudio la expresión de la IL-10 mRNA aumentado rápidamente en las secciones proximal y distal a las 24 horas después de la lesión, tanto en la endo-y epi / perineuro, muy probablemente como respuesta a un inhibidor de que la reacción inflamatoria TNF-α e IL-1 β Habían provocado [17, 47, 48]. La fuente de expresión de IL-10 en el primer momento después de una lesión no puede infiltrarse en los macrófagos [49] debido a que estas células no se observan por lo general antes del día 3 en el endoneurium. La fuente más probable en este momento sería células de Schwann [20]. Sin embargo, el residente de macrófagos activados que se presentan por lo general en el endoneurium también son activados durante la inflamación [7, 9] y pueden ser responsables de la expresión observada. La infiltración de macrófagos hematógena son probablemente las responsables de la alta expresión de IL-10 señaló el día 21 en el epi-/perineurium distal, y en el endoneurium esta expresión se aumentaría con células de Schwann [20, 36]. Una observación interesante es que desde el día 1 a partir de la expresión de mRNA de IL-10 se encuentra principalmente en los dos distal y proximal epi / perineuro. A los 28 días de la expresión de IL-10 fue mínimo en el distal epi-/perineurium. Sin embargo, a pesar de la baja expresión de TNF-α, β IL-1 e IL-10 en este momento, el muñón distal presenta varias características morfológicas [27, 50]. Endoneurial fibroblastos, que son marcadamente presente en este ámbito, la forma minifascicle estructuras de tipo, que posiblemente apoyo tubos de lámina basal de la quiebra [27]. Es interesante la expresión de mRNA de IL-10 fue marcadamente mayor en el día 35 en distal y proximal epi / perineuro. Estos cambios podrían estar relacionados con la alta expresiones señaló simultánea de las dos citoquinas pro-inflamatorias (IL-1 β y TNF-α). IL-10 es conocida para inhibir la producción de estas citocinas relacionadas con la inflamación [17, 49, 51]. IL-10 disminuye la apoptosis provocada por TNF-α [45] y abajo-regula la expresión de MHC clase II en macrófagos / monocitos [49]. Los productores de IL-10 durante esta fase tardía son, al menos parcialmente, los macrófagos [20, 49], que se presente simultáneamente con la IL-10 en la expresión epineurium en el presente estudio. Sin embargo, las células [52] también son capaces de producir IL-10. ¿Por qué esta expresión de las citocinas en el epi / perineuro tiene lugar en día 35 se desconoce. En el presente diseño experimental, con la prevención de la reinervación axonal, pueden provocar estos cambios. Por lo tanto no se puede excluir la posibilidad de que el concepto de que se observa día 35 pueden estar relacionados con la reorganización estructural de los compartimentos de nervio periférico.

En el presente estudio IFN-γ mRNA se presente tras día 5. Esta observación puede ser temporal vinculada a los macrófagos, que se introducen en el endoneurium [1, 32]. En neuroinflammatory procesos de IFN-γ, que es liberado principalmente por linfocitos T, se ha observado que tienen un papel importante como upregulator de MHC clase II de expresión [53]. IFN-γ aumenta la afluencia de macrófagos y células T en el sistema nervioso periférico [54], y el aumento de TNF-α y de la producción de IL-1 en los macrófagos [55] y [56] fibroblastos. Mediante esta acción se IFN-γ inducen una masiva infiltración de macrófagos en endoneurium de 3 a 5 días después de la lesión. La marcada expresión de IFN-γ mRNA a los 14 días en el proximal endoneurium es también el punto en el tiempo que una notable invasión de endoneurial-macrófagos derivados de la sangre se produce en el muñón proximal (Figura 4B].

A día 35 varias citocinas expresiones mostró aumentada en la zona proximal 2 en el presente estudio. Cuando se impide la regeneración axonal de la sutura del nervio periférico, un neuroma traumático comienza de forma. Un componente de este neuroma es epineurial fibrosis, que es por el aumento de TGF-β1 [57]. La expresión de TGF-β1, aumenta de manera espectacular en la zona proximal 2 en epineurium neuroma día 35 durante la formación [58]. En el presente estudio, un aumento similar en la expresión de las citocinas IL-1 β, IL-10 y TNF-α se observó. Este hallazgo no se ha informado previamente.

Cuando axonal brotes comienzan a crecer en el muñón proximal, algunos de ellos podrían comenzar a crecer accidentalmente atrás en la epineurium. Sin embargo, estos no se extienden axones este crecimiento muy lejos, y la brotación es rápidamente discapacitados. Los discapacitados crecimiento de los axones en el epineurium no se ha aclarado pero TGF-β1, es de especial interés en este caso. Tiene una función como células de Schwann para mitogen [59], pero también es capaz de matar por la activación de c-Jun [60]. La activación de c-Jun da lugar también a un aumento de la expresión de TNF-α, que es también capaz de inducir la apoptosis de las células Schwann [26], así como la muerte neuronal [45, 61].

Curiosamente, no lesionado contralateral nervio ciático muestra marcadas endoneurial expresión de las citocinas IL-1 β, IL-10 y TNF-α mRNAs en el día 35 después de la lesión [62]. Sin embargo, en este mismo tiempo marcó las expresiones de esas citocinas en el lugar de la lesión se observa ahora sólo en el epi-/perineurium. ¿Cuál es el mecanismo que hay detrás de estos hallazgos paradójico? Esta observación podría indicar que los cambios observados en la expresión de citocinas en el lugar de la lesión se pueden propagar a través de estímulos a través de la circulación humoral. Macrófagos activados, se han observado también en el endoneurium del lado contralateral después de la lesión [9]. ¿Podría la endoneurial observado cambios en el nervio contralateral ser una consecuencia de la estimulación de los macrófagos ganglios, cerebro, médula o hipotálamo? Después de la lesión crónica constricción, el bloqueo de los receptores NMDA se encontró para eliminar la expresión mRNA de citoquinas en el nervio ciático contralateral [63]. La importancia biológica de este hallazgo es desconocida.

Conclusión

Nuestros resultados muestran que la prolongación de mediador inflamatorio se producen en el nervio periférico en un modelo de lesión crónica denervación. La expresión es cíclica y se correlaciona en parte con las señaladas en el contralateral no lesionado nervio ciático. Este estudio también apoya las sugerencias anteriores células de Schwann que puede tener un papel central en la expresión de citocinas en el nervio [36], que podría ser en parte responsable de la conducta del dolor, así como para apoyar el crecimiento de los nervios durante la formación de neuroma. Denervación Este modelo ofrece nuevas e interesantes maneras de estudio de la patogénesis de neuroma traumático y neuroinflammatory cambios, algunos de los cuales pueden estar relacionados con el dolor.

Lista de abreviaturas

IL Interleucina

IFN-γ interferón-γ

BNB sangre-nervio-barrera

BSA albúmina sérica bovina

GAPDH Glyseraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa

GITS tiocianato de guanidina 6-9277 Sigma, lauroylsarcosine N-L-5125 Sigma, tri-Na-citrato dihidrato 1,12005 Merck, 0,7% h-mercaptoetanol

MHC complejo principal de histocompatibilidad

NGF factor de crecimiento del nervio

TGF-β1 Transformación de factor de crecimiento-β1

NMDA N-metil-D-aspartato

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

AR llevó a cabo la PCR en tiempo real los estudios, los estudios histológicos, las estadísticas, las operaciones realizadas al animal junto con la RM y el HST, y preparó el manuscrito. MK, y MJ A realizó la PCR en tiempo real de análisis, así como la preparación de muestras de mRNA. HST participado en el diseño y la coordinación del estudio. MR diseñó el estudio, a cargo de la responsabilidad por el protocolo de estudio y la ayuda en la preparación del manuscrito.

Agradecimientos

Agradecemos a Pirkko Huuskonen, MA para el examen de la lengua. El apoyo financiero fue proporcionado por el Hospital Universitario de Turku (EVO a la concesión).