Journal of Inflammation (London, England), 2005; 2: 16-16 (más artículos en esta revista)

Caracterización de los receptores Toll-like en la primaria de las células epiteliales del pulmón: fuerte impacto de la TLR3 ligando poli (I: C) sobre la regulación de los receptores Toll-like, adaptador de las proteínas y la respuesta inflamatoria

BioMed Central
Mirko Ritter (mirko.ritter @ bc.boehringer-ingelheim.com) [1], Detlev Mennerich (detlev.mennerich @ bc.boehringer-ingelheim.com) [1], Andreas Weith (andreas.weith @ bc.boehringer-ingelheim . Com) [1], Peter Seither (peter.seither @ bc.boehringer-ingelheim.com) [1]
[1] Departamento de Investigación pulmonar, Boehringer-Ingelheim Pharma GmbH & Co KG, Birkendorfer Stra β e, 88937 Biberach ad Riss, Alemania

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Resumen
Antecedentes

Exacerbaciones bacterianas y virales juegan un papel crucial en una variedad de enfermedades pulmonares incluyendo asma o EPOC. Desde el epitelio pulmonar es una fuente importante de diversos mediadores inflamatorios que afectan la respuesta inmune, que analiza la reacción inflamatoria de las células epiteliales del pulmón primario a diferentes moléculas microbianas que son reconocidos por los receptores Toll-like (TLR).

Métodos

Los efectos de TLR ligandos en primaria las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas se analizaron en detalle con respecto a las citocinas, quimiocinas y metaloproteinasas de matriz secreción. Además, la regulación de la expresión de TLRs y su adaptador de proteínas en las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas se investigó.

Resultados

Nuestros datos demuestran que la poli (I: C), un análogo sintético de dsRNA viral, mediada la proinflamatorias efectos más fuertes entre los ligandos probado, que incluye un aumento de la secreción de IL-6, IL-8, TNF-α, GM-CSF, GRO - Α, TARC, MCP-1, MIP-3 α, RANTES, IFN-β, IP-10 y ITAC, así como un aumento de la liberación de MMP-1, MMP-8, MMP-9, MMP-10 y MMP-13 . Por otra parte, nuestros datos muestran que la poli (I: C), así como de tipo-1 y tipo-2 citoquinas tienen un pronunciado efecto en la expresión de TLRs y moléculas que participan en la señalización TLR en las pequeñas células epiteliales de la vía aérea. Poly (I: C) inducida por una elevada expresión de TLR1, TLR2 y TLR3 y el aumento de la expresión de genes de la general y TLR adaptador MyD88 IRAK-2. Al mismo tiempo, poli (I: C) disminuyó la expresión de TLR5, TLR6 y TOLLIP.

Conclusión

Poly (I: C), un análogo de dsRNA viral y un ligando TLR3, desencadena una fuerte respuesta inflamatoria en las vías aéreas pequeñas células epiteliales que puede contribuir a las exacerbaciones viral de las enfermedades pulmonares como el asma o la EPOC. La pronunciada efectos de la poli (I: C) en la expresión de los receptores Toll-like y las moléculas que participan en la señalización TLR se supone que influyen en la respuesta inmune del epitelio pulmonar a infecciones bacterianas y virales. Asimismo, la regulación de la expresión de TLR tipo-1 y tipo-2 citoquinas es importante considerar el impacto de los exógenos y endógenos TLR ligandos en Th1 o Th2 impulsada inflamaciones pulmonares como la EPOC o asma, respectivamente.

Antecedentes

Además de su función de barrera, el epitelio de la vía aérea juega un papel importante para la respuesta inmune en el pulmón [1]. Así, el epitelio pulmonar es una fuente importante de citocinas, quimiocinas y otros mediadores inflamatorios que afectan a la capacidad de adaptación y respuesta inmune innata y, por lo tanto, modular enfermedades inflamatorias como la EPOC o asma [2]. El inmune innato funciones de la epitelio pulmonar son fundamentales para la defensa local de acogida que brindan protección de las vías aéreas y el parénquima pulmonar de la colonización de microorganismos y las infecciones. Además de la inducción aguda o crónica de la inflamación pulmonar, el aumento de la carga bacteriana y viral de las infecciones de pulmón dar lugar a graves enfermedades como las exacerbaciones de la EPOC [3, 4] o asma [5], muy probablemente debido a un sesgo liberación de los mediadores de la inflamación.

La familia de los receptores Toll-like (TLR) desempeña un papel fundamental en el reconocimiento de patógenos y de la inducción y la regulación de la innata y la respuesta inmune adaptativa. Las células epiteliales de la vía aérea expresar TLRs y TLRs en la activación de las células epiteliales se ha demostrado que induce la producción de varias citocinas, quimiocinas y péptidos antimicrobianos [6 - 8]. La importancia de TLRs para la acogida de defensa en el pulmón se ha demostrado por el aumento de la susceptibilidad de ratones knockout TLR hacia las infecciones virales o bacterianas. Por ejemplo, los ratones con deficiencia de TLR2 han demostrado ser altamente susceptibles a la infección por Staphylococcus aureus, Streptococcus Borrelia burgdorferi y neumonía [9, 10]. Además de su papel destacado en la acogida y la respuesta de inmunidad innata, TLRs desempeñar un papel importante para la adaptación del sistema inmunológico y la regulación de un equilibrio Th1/Th2 [11]. Esto se cree que tienen un fuerte impacto de la enfermedad alérgica Th2 sesgado como el asma. Considerando que el agonista específico TLR1/TLR2 Pam 3 CSK 4 y altos niveles de la TLR4 ligando E. Coli LPS tener efectos beneficiosos en los modelos animales de asma, muy probablemente debido a la re-equilibrio del patrón de citoquinas y la inducción de una respuesta Th1 [12 - 14], dosis bajas de LPS y el TLR2 ligando peptidoglycan sesgo de la respuesta inmune hacia un fenotipo Th2 Y conducir a la agravación de asma experimental [12, 15]. En Th1 asociados EPOC como enfermedad inflamatoria, la activación de los TLRs ya sea por ligandos endógenos o exógenos es probable que produzca la enfermedad en exacerbaciones sesgados debido a la respuesta proinflamatoria.

En el actual estudio, encaminadas a obtener una mejor comprensión del papel de TLRs en células epiteliales de las vías respiratorias y las consecuencias de las enfermedades pulmonares inflamatorias. Por lo tanto, realizamos un análisis detallado de la secreción de citoquinas y quimioquinas primaria por pequeñas células epiteliales de la vía aérea (SAEC) inducida por la activación de TLR con diferentes ligandos. Se analizaron también las metaloproteinasas de matriz (MMP) estimuló la liberación de la SAEC. Además, la regulación de la expresión de TLRs y su adaptador de proteínas en las células epiteliales de la vía aérea principal (SAEC) estimulada con TLR ligandos o citocinas Th1 y Th2 se investigó. Hemos podido demostrar que entre los diferentes ligandos TLR evaluados poli (I: C), un análogo de dsRNA viral y un ligando para TLR3, es el más potente proinflamatorias estímulo para las células epiteliales del pulmón en relación con la secreción de citocinas, quimiocinas y MMPs. Poly (I: C) produjo un incremento en la expresión de su receptor y ha pronunciado TLR3 efectos en la expresión de TLRs y otras proteínas implicadas en la señalización TLR en el SAEC. Además, nos demuestran que la expresión de TLRs y su señalización en proteínas SAEC está muy regulado por tipo-1 y tipo-2 citoquinas. Estos hallazgos se cree que tienen un efecto importante sobre el impacto de las infecciones bacterianas y virales en el tipo-1 o tipo-2 sesgada inflamaciones pulmonares como la EPOC o asma, respectivamente. En resumen, nuestros resultados proporcionan una idea más en el papel de TLRs en la respuesta inmune del epitelio pulmonar a infecciones bacterianas y virales, y su contribución a virus y bacterias inducidas por exacerbaciones de enfermedades pulmonares.

Métodos
Anticuerpos

Anticuerpos policlonales a TRIF y TIRAP y mAb a TOLLIP se obtuvieron de Alexis (Lausen, Suiza). Anticuerpos policlonales a IRAK-2 y la IRAK-3 fueron adquiridos de Chemicon (Temecula, CA). Anticuerpos policlonales a IRAK-1 y se IRAK-4 de Active Motif (Rixensart, Bélgica) o Upstate (Waltham, MA), respectivamente. El policlonal anti-MyD88 de anticuerpos se obtuvo de Santa Cruz-Biotecnología (Santa Cruz, CA). La lucha contra la TLR1 (GD2.F4) mAb, anti-TLR2 mAb (TL2.3), la lucha contra la TLR3 mAb (TLR3.7) que se utiliza para inmunofluorescencia se adquirió de Alexis. La lucha contra el TLR5 mAb y anti-TLR6 mAb (86B1153) se obtuvieron a partir de Imgenex (San Diego, CA) y Kamiya (Seattle, WA), respectivamente. La neutralización de cabra policlonal anti-IFN-β de anticuerpos fue de R & D Systems (Wiesbaden, Alemania).

Cell Cultura

Primaria SAEC (humano normal las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas), así como todos los medios de comunicación y el crecimiento basal suplementos se obtuvieron de Clonetics (San Diego, CA). Las células fueron cultivadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante en platos de plástico o frascos (BD Bioscience, en Heidelberg, Alemania). El paso número se mantuvo a menos de cuatro pasajes de las poblaciones originales. SAEC células se han mantenido en las vías respiratorias pequeñas de células epiteliales basales medio (SAGM) complementado con 52 μ g / ml de extracto de pituitaria bovina, 0,5 ng / ml EGF humano recombinante, 0,5 μ g / ml de hidrocortisona, 0,5 μ g / ml de epinefrina, 10 μ g / ml, transferrina, 5 μ g / ml de insulina, 0,1 ng / ml, ácido retinoico (RA), 6,5 ng / ml triyodotironina, 50 μ g / ml de gentamicina y anfotericina B-(GA-1000) y 50 μ g / ml de ácidos grasos libres de la albúmina sérica bovina (BSA ). 24 h antes de la estimulación de las células de mediano fue sustituido por medio base sólo complementado con GA-1000, la AR y la BSA. SAECs de tres donantes se utilizaron para el estudio.

Estimulación de la vía aérea pequeña células epiteliales (SAEC)

Todas las citocinas se obtuvieron a partir de la I + D de Sistemas (Wiesbaden, Alemania). Las siguientes concentraciones de citoquinas fueron utilizados para la estimulación de SAECs: 50 ng / ml de TNF-α, 10 ng / ml IL-1 β, 10 ng / ml de IL-4, 20 ng / ml de IL-13 o 20 ng / ml IFN-γ .

Evaluar los efectos de la activación de TLR, SAEC fueron estimulados con 5 μ g / ml E. Coli 0111: B4 LPS (ultrapura), 10 μ g / ml S. Peptidoglycan aureus (PGN), 10 μ g / ml S. Cerevisiae zymosan, 200 ng / ml MALP-2 (la activación de los macrófagos lipopeptide-2), 200 ng / ml Pam 3 CSK 4 (palmitoiltransferasa-3-cisteína-serina-lisina-4) (todos obtenidos de Invivogen, (San Diego, CA ), 10 μ g / ml de poli (I: C) (SIGMA, Munich, Alemania) o 20 ng / ml S. muenchen flagellin (Calbiochem, Darmstadt, Alemania).

24 h antes de la estimulación de las células, el medio fue reemplazado por medio base sólo complementado con GA-1000, el ácido retinoico y la BSA. Posteriormente, las células fueron incubadas durante 6 h ó 24 h con el indicado en los estímulos SAGM basal suplementado con GA-1000, el ácido retinoico y la BSA.

Por el bloqueo de los experimentos, las células fueron pre-incubadas con un bloqueo funcional de lucha contra el TLR3 mAb (clon TLR3.7, 20 μ g / ml) [16], una cabra anti-IFN-β anticuerpos (1 - 5 μ g / ml), un Control de isotipo IgG 1 (20 μ g / ml) o una cabra IgG (1 - 5 μ g / ml) durante 1 h, y posteriormente estimulado con 5 μ g / ml de poli (I: C) durante 6 h. IP-10 y la secreción de IFN-β se mide a través de una IP-10 o IFN-β ELISA (R & D Systems), respectivamente.

ARN preparación

ARN extracción de las células se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La pureza y la integridad del ARN extraído se evaluó en el 2100 Agilent bioanalyzer con el RNA 6000 Nano LabChip equipo de reactivos (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Real-time RT-PCR cuantitativa

Primers y sondas TaqMan para humanos TLR1 - TLR5 y TRAM (cuadro 1] fueron diseñados utilizando la PrimerExpress Software 2.0 (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Las sondas utilizadas para la detección en tiempo real PCR fueron etiquetados con 6-carboxyfluorescein (FAM) en su 5'-terminal y se apagará con 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) en su 3'-terminal. Primers y sondas TaqMan humana β-actina, TLR6 - TLR10, IRAK-1, IRAK-2, IRAK-3, IRAK-4, TRIF, TIRAP, TOLLIP, I-TAC, IP-10 y MyD88 se obtuvieron de Applied Biosystems (Ensayo-On-Demand). GAPDH mRNA niveles se midieron utilizando una etiqueta JOE humanos GAPDH TaqMan PDAR endógeno de control reactivo kit (Applied Biosystems).

TaqMan ensayos de PCR se realizaron en un ABI Prism 9600 Sequence sistema de detección (Applied Biosystems), como un paso RT-PCR utilizando el EZ-RT-PCR Reactivo Kit (Applied Biosystems) y 40 ng de ARN. Final Mn 2 + concentraciones fueron optimizados para cada ensayo y varió entre 2,5 y 4 mM mM. Los ensayos se realizaron en 384-óptico de las placas y así correr en copias o triplica. Para cuantificar los resultados obtenidos por PCR en tiempo real, se utilizó una curva de calibración. Diluciones seriadas humanos de pulmón o bazo ARN se utilizan como normas y se ejecuta en paralelo a las muestras. El Detector de Secuencia Software SDS 2.0 (Applied Biosystems) se utilizó para el análisis de datos. Los resultados se normalizaron a los controles endógenos (GAPDH o β-actina).

Inmunofluorescencia

La inmunocitoquímica para TLRs se realizó en las vías respiratorias humanas primarias pequeñas células epiteliales cultiva en el colágeno-I revestidos cámara de diapositivas (BD Bioscience) en SAGM totalmente completada. 24 h antes de la estimulación de las células de mediano fue sustituido por medio base sólo complementado con GA-1000, el ácido retinoico y la BSA. Posteriormente, las células fueron estimuladas por 24 h con el indicado compuestos. Para la tinción de las células fueron fijadas y permeabilized por incubación con BD Cytofix / Cytoperm solución (BD Bioscience). La lucha contra la TLR1 (GD2.F4) mAb, anti-TLR2 mAb (TL2.3), la lucha contra la TLR3 mAb (TLR3.7) y anti TLR5 (19D759.2) mAbs se usa a una concentración de 2 - 5 μ g / Ml. Diluciones y lavado de anticuerpos se realizó en BD Perm / Lavar solución (BD Bioscience). Para descartar la tinción no específica, el correspondiente isotipo control negativo se utilizó en lugar de anticuerpos específicos de la TLR. La unión de los anticuerpos primario se detectó mediante un Alexa488 etiqueta de anticuerpos anti-ratón (Molecular Probes, Eugene, OR). Los núcleos se tiñeron con yoduro de propidio.

Medición de citoquinas, quimioquinas y de la secreción de MMP

Analizar la secreción de citocinas y quimiocinas por SAEC, las células fueron estimuladas por 24 h con diferentes ligandos para TLRs como se ha descrito anteriormente. Cell sobrenadantes fueron aprobados por centrifugación, complementado con una combinación de inhibidores de la proteasa (Complete ™, Roche) y almacenados a -80 ° C. Citocinas y quimiocinas se detectaron utilizando una variedad de citoquinas (RayBio ® Humanos de citocinas Antibody Array III, RayBiotech, Norcross, GA) como consecuencia de las instrucciones del fabricante. Una lista completa de citoquinas anticuerpos presentes en la gama está disponible bajo http://www.raybiotech.com/map/human_III_map.pdf.

Para la cuantificación de las quimiocinas, MMPs múltiplex ensayos se realizaron en los duplicados utilizando tres diferentes diluciones de los sobrenadantes de células. Los ensayos se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante (SearchLight Array ™, la muestra Testing Service, Pierce, Woburn, MA).

Western Blot

Western Blot se realizó de acuerdo a procedimientos estándar. En resumen, las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en virtud de la reducción de las condiciones y borró de las membranas PVDF. Membranas fueron bloqueadas en PBS / 5% de la leche powder/0.1% de Tween-20. Primaria y secundaria de anticuerpos se diluyeron en PBS / 5% de la leche powder/0.1% de Tween-20. Unión de los anticuerpos se detectó utilizando una etiqueta HRP y secundaria de anticuerpos ® SuperSignal West Pico quimioluminiscencia sustrato (Pierce).

Resultados
TLR desencadenó la secreción de citocinas y quimiocinas por SAEC

Desde el epitelio pulmonar es una fuente importante de la secreción de citoquinas y quimioquinas en diversas viral y bacteriana pulmonar, infecciones [1, 17], que analiza los tipos de citocinas y quimiocinas son liberados de las vías respiratorias pequeñas células epiteliales (SAEC), en respuesta a la activación por TLR diferentes ligandos.

El uso de un tiempo real de RT-PCR enfoque podríamos demostrar que constitutivamente humana SAEC expresar ARNm de TLRs 1-6, en tanto que expresión de TLRs 7-10 no se detectó (datos no presentados). Por lo tanto, SAECs fueron estimulados durante 24 h con diferentes ligandos de TLR1/TLR2 o TLR2/TLR6 heterodimers (PGN, zymosan, Pam 3 CSK 4, MALP-2), TLR3 (poli (I: C)), TLR4 (E. coli LPS) o TLR5 (flagellin). Después de la estimulación, los niveles de citoquinas y quimioquinas en el cultivo de células sobrenadantes se analizaron utilizando una variedad de citoquinas (Fig. 1] y los sistemas múltiplex de ELISA (Figura 2A].

Como se muestra en la Fig. 1, la estimulación de la SAEC con TLR3 ligando poli (I: C) resultó en la respuesta inflamatoria más pronunciada en relación con la secreción de citocinas y quimiocinas que incluye un aumento de la liberación de IL-6, IL-8, TNF-α , GM-CSF, MCP-1, RANTES, TARC y GRO-α. En contraste con poli (I: C), ligandos para TLR2 (MALP-2, PGN, zymosan) o TLR5 (flagellin) inducida por sólo un aumento de la secreción de IL-8 en comparación con el control sin tratar las células. En todos los experimentos SAEC no mostraron respuesta a la estimulación con LPS en relación con la secreción de citocinas o quimiocinas (datos no presentados).

A la pantalla un nuevo panel de quimiocinas múltiplex se realizaron pruebas ELISA (Figura 2A]. Estos resultados apoya nuestros resultados iniciales de que la activación de TLR3 por poli (I: C) da lugar a una fuerte respuesta proinflamatoria que se caracteriza por un aumento de la secreción de MIP-3 α, β MIP-3 y GRO-α y por una fuerte inducción de la IFN-inducible quimiocinas IP-10 (CXCL10) y CIAT (CXCL11) (Figura 2A]. De conformidad con la inducción de IFN-inducible quimiocinas, hemos detectado una elevada secreción de IFN-β después de las 6 h de poli (I: C) estímulo (Fig. 2C]. El fuerte inducción de la PI-10 secreción puede ser inhibida por un bloqueo funcional de los anticuerpos anti-TLR3 que demuestra la participación de las células de la superficie del TLR3 expresado en la respuesta del SAEC de poli (I: C) (Figura 2B]. Asimismo, el aumento de IP-10 y I-TAC expresión en poli (I: C) estimuló las células se inhibió por un neutralizante anti-IFN-β anticuerpo que indica un IFN-β mecanismo dependiente de la PI-10 y I-TAC por inducción Poli (I: C) (Fig. 2D].

En comparación con poli (I: C), la estimulación de la SAEC con el TLR5 ligando flagellin dado lugar a una menos pronunciada de la secreción de IFN-inducible de quimioquinas IP-10, pero inducida por la secreción de niveles similares de MIP3 α, β y MIP3 GRO-α ( Fig. 2A]. MALP-2, un ligando específico para TLR2/TLR6 heterodimers, el aumento de la secreción de la PI-10, MIP-3 α y GRO-α. El TLR2 ligando zymosan inducido una elevada secreción de GRO-α (Figura 2A]. Otros ligandos TLR2 Pam incluidos 3 CSK 4 y PGN no tiene impacto significativo en la secreción de las analizadas quimiocinas (datos no presentados). Una vez más SAEC no mostraron respuesta a la estimulación con LPS TLR4 ligando (datos no presentados).

TLR desencadenó la secreción de metaloproteinasas de la matriz por SAEC

Como el incremento de los niveles de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) se encuentran en los tejidos crónicamente inflamados en enfermedades como la EPOC y se cree que contribuyen a la fisiopatología de las enfermedades, analizamos la secreción de MMPs SAEC y por el efecto de la activación de TLR en este proceso. SAECs fueron estimulados durante 24 h con diferentes ligandos para TLRs y MMP concentraciones en el cultivo de células sobrenadantes se analizaron mediante un multiplex ELISA (Fig. 3].

Estos resultados ponen de manifiesto que el TLR3 ligando poli (I: C) produjo un significativo aumento de la secreción de tipo I collagenases-MMP-1, MMP-8, MMP-13, así como una mayor liberación de la colagenasa tipo IV-MMP-9 ( Gelatinasa B) y la stromelysin MMP-10. Inhibidores de la secreción de MMP TIMP-1 y TIMP-2 no era elevada. TLR5 activación por flagellin aumentado ligeramente la liberación MMP-1, MMP-9, MMP-10 y, indujo una fuerte elevación de la secreción de MMP-13 por SAEC. La activación de TLR2 ligandos SAECs con sólo tienen un menor efecto sobre la secreción de MMP o TIMP. El TLR2 ligando zymosan inducido a la liberación de MMP-1 y el TIMP inhibidor de MMP-2. MALP-2, un ligando para TLR2/TLR6 heterodimers, el aumento de la secreción de MMP-13, mientras que el ligando específico TLR1/TLR2 Pam 3 CSK 4 y el TLR4 ligando LPS no tuvieron efectos significativos sobre la secreción de las MMPs analizados o TIMPs ( Datos no presentados). Estos datos demuestran que entre la prueba TLR ligandos, poli (I: C) inducida por la mayor secreción de MMP activadas por las células epiteliales del pulmón. Esto está de acuerdo con la gran aumento de la secreción de citoquinas y quimioquinas inducidas por poli (I: C) y se hace hincapié en el fuerte impacto de la proinflamatorias TLR3 ligando poli (I: C) para SAEC.

Reglamento de TLR expresión en SAEC por diferentes ligandos para TLRs

Para analizar si la activación de TLR tiene un efecto en la expresión de TLRs en SAECs, las células fueron estimulados durante 6 h ó 24 h con ligandos de TLR2 (PGN, zymosan, Pam 3 CSK 4, MALP-2), TLR3 (poli (I: C)), TLR4 (E. coli LPS) o TLR5 (flagellin) y TLR ARNm y la expresión de la proteína se mide por cuantitativos tiempo real RT-PCR e inmunofluorescencia. Como se muestra en la Fig. 4, el TLR3 ligando poli (I: C) tenían las más potentes efectos en la expresión de mRNA TLRs en SAEC. Hemos detectado un aumento de la expresión de mRNA TLR3 después de poli (I: C) la estimulación que fue acompañado con un aumento del TLR3 la expresión de la proteína (Fig. 5].

TLR1 expresión mRNA se redujo regulado después de las 6 h de poli (I: C), seguida de un estímulo sobre regulación después de 24 h de poli (I: C) estímulo (Fig. 4] que se asoció con un elevado TLR1 la expresión de la proteína ( Fig. 5]. También se observó un muy fuerte sobre regulación de TLR2 ARNm y la expresión de la proteína en poli (I: C) estimulado SAECs (Fig. 4 y 5]. En contraste, la expresión de la proteína y el ARNm de TLR6 está fuertemente disminuido por poli (I: C) (Fig. 4]. Asimismo, se observó una fuerte baja regulación de TLR5 mRNA (Fig. 4] y proteína (Fig. 5] expresión de poli (I: C). En contraste con poli (I: C), otros ligandos TLR sólo había menores efectos en la regulación de la expresión de TLR en SAECs. No se detectaron inducción de la TLR7 - TLR10 la expresión de los genes por la estimulación de SAECs con poli (I: C) o de otros ligandos de TLR (datos no presentados).

Regulación de la expresión de moléculas de señalización TLR por diferentes ligandos para TLRs

Señalización por TLRs es iniciada por la contratación de un conjunto específico de proteínas adaptador [18]. Dado que el uso de diferentes proteínas adaptador proporciona un mecanismo para modular y especificar la respuesta de cada uno de los TLRs, analizamos la regulación de la expresión de las proteínas conocidas adaptador TLR en las pequeñas células epiteliales de la vía aérea. Para examinar los efectos de diferentes ligandos TLR en la expresión de los adaptadores de las proteínas, las células son estimuladas por las 6 horas o 24 horas con diferentes ligandos para TLR2 (PGN, zymosan, Pam 3 CSK 4, MALP-2), TLR3 (poli (I : C)), TLR4 (E. coli LPS) o TLR5 (flagellin) y TLR adaptador expresión cuantitativa se mide por tiempo real RT-PCR (Fig. 6] y Western Blot (Fig. 7]. Como se muestra en la Fig. 6, el TLR3 ligando poli (I: C) tenían las más potentes efectos en la expresión de mRNA TLR adaptador proteínas. Poly (I: C) indujo un aumento de la expresión de mRNA de la proteína MyD88 común adaptador y el TLR3 y TLR4 adaptador de proteínas específicas TRIF después de 24 h de poli (I: C) la estimulación. En contraste, la expresión de genes de TOLLIP, un regulador negativo de la señalización TLR, se redujo en poli (I: C) (Fig. 6]. De conformidad con la reducción de la expresión mRNA, TOLLIP niveles de la proteína se observó que disminuyó un poli (I: C) estímulo (Fig. 7A]. Sorprendentemente, Western blot demostró que, a pesar de la elevada TRIF expresión mRNA, TRIF los niveles de proteína están fuertemente disminuido después de 3 h, 6 h y 24 h de poli (I: C), que indican que la estimulación TRIF es cleaved o degradados siguientes TLR3 señalización (Fig 7A Y 7B].

Receptor de la interleukina-1-cinasas asociadas (IRAKs) son parte de la cascada de señalización TLR y están involucrados en la activación de NF κ B, y el MAP quinasa vía de activación de TLR siguiente [19]. Debido a su mayoría de la fase inicial de ubicación en la cascada de señalización TLR, que tenía por objeto analizar la regulación de estas proteínas de señalización clave en SAECs por TLR ligandos. IRAK expresión cuantitativa se mide por tiempo real RT-PCR y Western Blot. Como se muestra en la Fig. 6 y Fig. 7A, el TLR3 ligando poli (I: C) tenía un pronunciado efecto en el ARNm y la expresión de la proteína de IRAKs. Hemos encontrado un fuerte aumento de mRNA (Fig. 6] y proteína (Fig. 7A] expresión IRAK-2 después de 24 h de poli (I: C) la estimulación, mientras que la expresión de la proteína IRAK-1 estaba fuertemente disminuyó en 24 h de poli (I: C), muy probablemente debido a un aumento de IRAK-1 después de una mayor degradación de señalización TLR (Fig. 7A], ya que no se encontraron pruebas de una regulación transcripcional de IRAK-1 por poli (I: C) (datos no presentados). IRAK-1 fue la degradación detectable después de 24 h de poli (I: C) y la estimulación logrado TRIF división o la degradación (Fig. 7B]. Esto está de acuerdo con la conclusión de que la IRAK-1 es la activación de los más altos de TRIF en TLR3 la vía de señalización. Poly (I: C) y otros ligandos TLR no tuvo ningún efecto sobre el ARNm o de la expresión de la proteína IRAK-3 o IRAK-4 (datos no presentados).

Reglamento de TLR expresión en SAEC de citocinas Th1 y Th2

Desde TLR ligandos se cree que induce un marcado tipo-1 respuesta inmune, y desde el entorno de citoquinas podría afectar a la expresión de TLR en SAEC, se determinó la regulación de la expresión de TLR diferente tipo-1 o tipo-2 citoquinas. Por lo tanto, SAEC fueron estimulados durante 6 h ó 24 h con citoquinas o combinaciones de citoquinas que están asociadas con un tipo-1 o tipo-2 respuesta inflamatoria y la expresión de TLRs fue analizada en tiempo real por RT-PCR (Fig. 8] Y de inmunofluorescencia (Fig. 5]. Tipo-1 citoquinas incluyendo IL-1 β, TNF-α y IFN-γ inducida por una fuerte sobre regulación de TLR2 mRNA (Fig. 8] y la expresión de la proteína que fue más pronunciada por la co-estimulación con TNF-α y IFN-γ (Fig. 5]. Asimismo, el TNF-α, en combinación con el IFN-γ inducida por un elevado mRNA (Fig. 8A] y la expresión de la proteína de TLR1 (Fig. 5] y una disminución de la expresión de TLR6 que indica que esta combinación de citoquinas favorece una señalización a través de TLR1/TLR2 heterodimers .

Sorprendentemente, en contraste con la muy fuerte inducción de ARNm de TLR2 por IFN-γ, tanto TLR1 y TLR6, que se sabe que forma funcional heterodimers con TLR2, se encontraron abajo-que se rige por el IFN-γ estimulación en ausencia de TNF - Α (Fig. 8A]. Asimismo, se observó una fuerte baja regulación de TLR5 mRNA (Fig. 8A] y la expresión de la proteína (Fig. 5] después de 24 h de TNF-α y IFN-γ estimulación. En contraste con la poli (I: C) mediada sobre regulación de TLR3 ARNm y la expresión de la proteína, que hemos detectado ningún efecto de tipo-1 citocinas en la expresión nivel de TLR3 (Fig. 5 y 8A].

Tipo-2 citoquinas como la IL-4 y IL-13 en combinación con TNF-α inducida de forma sinérgica una sólida sobre regulación de la expresión mRNA TLR2 (Fig. 8B]. Similar, hay un aumento en la expresión mRNA TLR1 después de la estimulación con IL-4 y IL-13 en combinación con TNF-α, mientras que no hay ningún efecto sobre el nivel TLR6 ARNm (datos no presentados) que indica que estas condiciones favorecen un señalización a través de TLR1/TLR2 heterodimers. No se encontraron efectos en el tipo de citoquinas-2 en la expresión de mRNA TLR3 o TLR5 (datos no presentados).

Además de las citoquinas medio, cinética parece jugar un papel importante en la regulación de la expresión mRNA TLR4. Considerando que el tipo de citoquinas-1 induce una rápida sobre regulación de los niveles de mRNA TLR4 después de las 6 h de estimulación que volver a un nivel basal después de 24 h de estimulación (Fig. 8A], el tipo-2 citoquinas inducir un lento aumento de los niveles de mRNA que TLR4 Es detectable después de 24 h de estimulación (Fig. 8B].

Reglamento de las proteínas de señalización TLR en SAEC de citocinas Th1 y Th2

Analizar la regulación de las moléculas de señalización TLR por tipo-1 o tipo-2 citoquinas, SAEC fueron estimulados durante 6 h ó 24 h con citoquinas o combinaciones de citoquinas que están asociadas con un tipo-1 o tipo-2 respuesta inflamatoria y la expresión De las moléculas de señalización TLR fue analizada en tiempo real por RT-PCR (Fig. 9] y Western Blot (Fig. 10]. La expresión de mRNA MyD88 resultó ser reglamentado rápidamente hasta después de las 6 h de estimulación con IFN-γ sola o en combinación con IL-1 β o TNF-α. Del mismo modo, la expresión de mRNA TRIF fue inducida por el tipo-1 citocinas IFN-γ sola o en combinación con IL-1 β o TNF-α (Fig. 9]. En contraste con el tipo-1 citoquinas, la estimulación de las células con citocinas Th2 asociadas no tuvo ningún efecto sobre MyD88 o TRIF niveles de mRNA (datos no presentados). La expresión mRNA de datos de MyD88 y TRIF correlacionaron muy bien con la proteína MyD88 y TRIF niveles determinados por Western Blot (Fig. 10]. No se encontraron efectos de las citoquinas Th1 o Th2 en el nivel de la expresión de proteínas adaptador TRAM, TIRAP y TOLLIP en SAEC.

Asimismo, la regulación de IRAKs por TLR ligandos por tipo-1 o tipo-2 citoquinas fue analizada en tiempo real por RT-PCR y Western Blot. Como se muestra en la Fig. 9, hay una fuerte regulación de la IRAK-2 y la IRAK-3 en el nivel de expresión de mRNA. IRAK-2 mRNA expresión está muy aumentado tras la estimulación con SAEC de tipo-1 citocinas como la IL-1 β, TNF-α o IFN-γ. Además, existe un efecto aditivo sobre regulación de IRAK-2 expresión inducida por la estimulación con IFN-γ, junto con la IL-1 β o TNF-α. En contraste con las citoquinas Th1, el tipo-2 citoquinas como la IL-4 o IL-13 no tuvo ningún efecto sobre la IRAK-2 no mostró expresión y de la sinergia con el TNF-α con respecto a la sobre regulación de mRNA IRAK-2 (datos no presentados) . Los datos de expresión de mRNA IRAK-2 estrechamente correlacionada con la IRAK-2 niveles de proteína determinada por Western Blot (Fig. 10].

Teniendo en cuenta la regulación de la IRAK-3 en SAECs, encontramos un ligero aumento del ARNm de expresión después de la estimulación de las células durante 6 h con la IL-1 β o TNF-α, que aumentó aún más por el mismo tiempo de estimulación con IFN-γ. Después de 24 h de estimulación con IFN-γ, en presencia de IL-1 β o TNF-α, IRAK-3 mRNA expresión disminuido a su nivel basal. En cambio, la estimulación de las células β con IL1 o TNF-α por sí solo dio lugar a un sostenido aumento de IRAK3 mRNA expresión que también fue detectable después de 24 h de estimulación. Tipo-2 citoquinas como la IL-4 o IL-13 sólo aumentó ligeramente IRAK-3 niveles de mRNA y no tiene grandes repercusiones para el TNF-α inducida sobre regulación de mRNA IRAK-3 (datos no presentados). Los datos de expresión de mRNA IRAK-3 correlacionado con la IRAK-3 niveles de proteína determinada por Western Blot (Fig. 10]. No se encontraron pruebas de Reglamento de IRAK-1 y la IRAK-4 por tipo-1 o tipo-2 citocinas en SAEC (datos no presentados).

Discusión

Exacerbaciones bacterianas y virales juegan un papel crucial en una variedad de enfermedades pulmonares incluyendo asma o EPOC, muy probablemente debido a un sesgo en favor de la liberación de mediadores de la inflamación. Desde el epitelio pulmonar es una fuente importante de moléculas inflamatorias [1, 2, 17], que tuvo como objetivo analizar las citocinas y quimiocinas que se liberan desde el epitelio pulmonar en respuesta a la activación de diferentes moléculas microbianas que son reconocidos por los receptores Toll-like. Para caracterizar los efectos de TLR ligandos bien controlados bajo condiciones in vitro, hemos elegido primaria de las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas (SAEC) como un modelo para estudiar la respuesta inflamatoria del epitelio pulmonar.

Entre los ligandos TLR evaluados en este estudio, poli (I: C), un análogo sintético de dsRNA viral y un ligando así caracterizado por TLR3 [20], el más potente mediada proinflamatorias efectos en el SAEC. Citocinas y quimiocinas inducidas por poli (I: C) incluyen la IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-α, MIP-3 α, GRO-α, IFN-β e IFN-inducible genes como IP-10, ITAC Y RANTES, que es de conformidad con la activación de la FIC-3 siguientes TLR3 estimulación [21]. Asimismo, Guillot et al. Informó de una elevada secreción de IL-6, IL-8 IFN-β y RANTES en poli (I: C) estimulado BEAS-2B células (células del epitelio bronquial humano línea) [8]. De conformidad con una elevada secreción de IFN-β detectable después de las 6 h de poli (I: C) estímulo, la expresión de la IFN-inducible IP ITAC-10 y podría ser bloqueado por una significativa IFN-β anticuerpos neutralizantes que demuestra la inducción de un IFN-en respuesta SAEC por poli (I: C).

La tinción de inmunofluorescencia permeabilized y no permeabilized SAEC mostró una baja de la superficie de células de expresión y TLR3 reveló que la mayoría de TLR3 proteína se encuentra en un compartimiento intracelular (datos no presentados). No obstante, la fuerte inducción de la PI-10 por la secreción de poli (I: C) podría ser marcadamente inhibida por un bloqueo funcional de los anticuerpos anti-TLR3 demostrando un papel clave de la célula de la superficie expresada TLR3 para la respuesta del SAEC de poli (I: C ).

La poli (I: C) inducida por la secreción de esta serie de citocinas y quimiocinas es parte de una respuesta Th1 pronunciado condujo a la contratación y activación de los neutrófilos, macrófagos y las células Th1. Por lo tanto, esta fuerte proinflamatorias tipo-1 respuesta inmune mediada por poli (I: C) es muy probable que contribuya a encontrar en las exacerbaciones viral tipo-1 enfermedades pulmonares como la EPOC. Sorprendentemente, poli (I: C) también indujo la secreción de TARC, que es un bien conocido chemoattractant de células Th2 [22]. Además, la IL-8, RANTES y GM-CSF se han mostrado de participar en el reclutamiento y la supervivencia de los eosinófilos [23] y contribuir a una respuesta inmune Th2. Estos resultados implican un papel para TLR3 estimulación no sólo de Th1 a Th2, sino también la respuesta inmune mediada pulmonares como el asma alérgica.

Flagellin, un ligando para TLR5, es un compuesto bacteriano de flagellae y ha demostrado ser fuerte mediador para inflamaciones pulmonares [24]. Sin embargo, flagellin de estimulación inducida SAEC sólo un subconjunto de citocinas o quimiocinas que se encuentran elevados por poli (I: C), incluyendo la estimulación de IL-6, IL-8, MIP-3 α y GRO-α. Curiosamente, también flagellin inducida IP-10 en la secreción de SAEC apuntando a la inducción de IFN-dependiente de la activación de genes siguientes TLR5. En contraste con poli (I: C) y flagellin, ligandos para TLR2 eran menos eficientes en estimular la liberación de citoquinas o quimioquinas por SAEC. Entre los ligandos TLR2 probado, MALP-2, un ligando específico para TLR2/TLR6 heterodimers era el más fuerte estímulo inflamatorio. La precisión molecular razones de la baja respuesta de la SAEC a TLR2 activación y las diferencias observadas entre las diversas TLR2 ligandos necesitan más experimentos, pero podrían ser en parte debido a la observada bajo nivel de expresión de TLR2 no SAEC.

A pesar de que detectó un bajo TLR4 expresión mRNA en SAEC, se observó que no existen respuesta inflamatoria de las células a la estimulación LPS. Esto está de acuerdo con los últimos resultados publicados por Monick et al. [25] que muestran que las células epiteliales de la vía aérea principal no responden a la exposición de endotoxina en condiciones normales. Dado que el epitelio de la vía aérea - como el epitelio intestinal - está en contacto permanente con múltiples patógenos relacionados con antígenos como LPS, la hyporesponsiveness de estas células epiteliales a la estimulación LPS [25, 26] se supone que proporcionan un mecanismo para amortiguar la respuesta inflamatoria a la LPS y la exposición constante a prevenir la inflamación crónica de los tejidos.

Además de una elevación de la secreción de citocinas y quimiocinas, poli (I: C) también provocó un significativo aumento de la secreción de metaloproteinasas de matriz (MMP) por SAECs. El aumento de los niveles de MMPs se encuentran en los tejidos inflamados crónicamente en enfermedades como la EPOC y se cree que contribuyen a la fisiopatología de la enfermedad por la degradación de la matriz en la remodelación tisular y enfisema [27]. Nuestros resultados demuestran que la activación de TLR3 por poli (I: C) provocado un notable aumento de la secreción de tipo I collagenases MMP-1, MMP-8, MMP-13, así como la liberación de la colagenasa tipo IV-MMP-9 Stromelysin y la MMP-10. Asimismo, el aumento de la liberación flagellin MMP-1, MMP-9, MMP-10 y MMP-13. Elevación de los niveles de proteína de MMP-1, MMP-8 y MMP-9 se encontraron en BALF o del parénquima pulmonar de pacientes con enfisema [28, 29]. Aunque los neutrófilos y macrófagos alveolares son consideradas como la principal fuente de MMPs en el tracto respiratorio, nuestros datos demuestran que SAEC secretan una variedad de MMPs en TLR en respuesta a la estimulación y, por lo tanto, son una fuente adicional para el aumento de la actividad proteolítica en las vías respiratorias infectadas que puedan Contribuir a enfisema pulmonar.

Los resultados discutidos anteriormente hincapié en el fuerte de las propiedades inflamatorias TLR3 ligando poli (I: C) en relación con la activación de las células epiteliales del pulmón que pueden contribuir a la inducida por el virus de las exacerbaciones de las enfermedades pulmonares como la EPOC, el asma o la fibrosis pulmonar. Para analizar el mecanismo molecular que se encarga de los fuertes efectos inflamatorios de poli (I: C), que evaluó el patrón de expresión de TLRs y proteínas implicadas en la señalización TLR siguientes poli (I: C) la estimulación. Estos datos demuestran que la poli (I: C) inducida por una elevada expresión de ARNm y proteínas TLR3 expresión. Además, el poli (I: C) hasta la estimulación regulada la expresión mRNA de la proteína TLR3 adaptador TRIF [30, 31], mientras que la expresión de TOLLIP, un regulador negativo de la señalización TLR [32], se encontró que se establecen - Reguladas por poli (I: C). Este mecanismo de regulación transcripcional se supone TLR3 señalización de promover y contribuir a la fuerte inflamación efectos inducidos por poli (I: C). Una característica interesante de TLR3 señalización en SAEC es la disminución de los niveles de proteína TRIF siguientes poli (I: C) la estimulación. El mecanismo exacto que es responsable de la disminución de la expresión de la proteína TRIF no se conoce, pero podría estar relacionado con la degradación de las proteínas o división. TLR degradación de la proteína de señalización de las proteínas se ha demostrado de IRAK-1 [33], IRAK-4 [34] y MyD88 [35]. Curiosamente, la división de TRIF por la proteasa viral NS3/4A fue descrito recientemente por Li et al [36]. Un mecanismo similar podría ser proteolíticas que participan en la regulación de los niveles de TRIF poli (I: C) estimulado SAEC y podría proporcionar un mecanismo para regular negativamente la respuesta celular a poli (I: C). Sin embargo, actualmente, no podemos descartar que un poli (I: C) inducida por la modificación de TRIF podría impedir la detección de anticuerpos modificados TRIF de Western blot en nuestros experimentos. Se encontró que el TRIF degradación o modificación fue detectable después de 3 h de poli (I: C) la estimulación de SAEC y procedió a la degradación de IRAK-1, que está de acuerdo en que IRAK-1 es la activación de los más altos de TRIF en TLR3 señalización.

Además del incremento en la expresión de TLR3, poli (I: C) tiene también un fuerte impacto en la expresión de otros TLRs en SAEC. Hemos podido demostrar que la poli (I: C) aumentó la expresión de TLR2, mientras que la expresión de TLR5 y TLR6 se redujo regulado por poli (I: C) la estimulación. TLR1 expresión resultó ser fuertemente regulado después de las 6 h de poli (I: C) la estimulación seguida de un elevado ARNm y la expresión de la proteína de TLR1 después de 24 h de estimulación. El incremento en la expresión de TLR1 y TLR2 y la simultánea baja regulación de TLR6, indica que la activación TLR3 favorece una señalización a través de TLR1/TLR2 heterodimers más que TLR2/TLR6 dímeros. Además, hemos podido demostrar que la poli (I: C) la estimulación se traduce en un incremento en la expresión de IRAK-2. IRAK-2 se ha demostrado que la interacción con TIRAP [37], que está involucrada en TLR2 y TLR4 señalización [38, 39]. Aunque IRAK-2 no posee actividad kinasa, la sobreexpresión de IRAK-2 se ha demostrado que la promoción de NF-κ B activación [40]. Por lo tanto, estos poli (I: C) efectos inducidos puedan afectar a TLR2 y de la respuesta inmune mediada por TLR4 en las vías respiratorias infectadas que tienen que ser analizados con más cuidado. Asimismo, la baja regulación de TLR5 por poli (I: C) y la consecuencia de las infecciones pulmonares con flagelado bacterias necesidades nuevas investigaciones.

Nuestros datos demuestran una marcada regulación de la expresión de TLR TLRs y proteínas de señalización en SAEC por tipo-1 y tipo-2 citocinas, lo que es importante considerar el impacto de los exógenos (patógenos asociados) o TLR ligandos endógenos en Th1 o Th2 impulsada inflamaciones pulmonares Como la EPOC o asma, respectivamente. Nuestros datos demuestran que el IFN-γ estimulación de la SAEC resultados en la inducción de una carga elevada de IRAK-2, MyD88 y TRIF ARNm y la expresión de la proteína y conduce a la baja regulación de TLR1, TLR5 y TLR6 expresión. Existe una fuerte sinergia de IFN-γ y TNF-α que se traduce en una muy elevada expresión de TLR2 y un incremento en la expresión de TLR4. Asimismo, el TNF-α solo o en combinación con el IFN-γ-hasta regula TLR1 expresión en SAEC. Estos datos indican que un tipo de citoquinas-1 ambiente (es decir, TNF-α, junto con el IFN-γ) promueve TLR2 y TLR4 de señalización debido a una regulación de la expresión TLR1/TLR2 y TLR4, así como debido a una mayor expresión de MyD88 , Y TRIF IRAK-2. Por otro lado, el tipo de citoquinas-1 es probable que inhiben TLR5 y TLR2/TLR6 de señalización debido a la fuerte baja regulación de TLR5 y TLR6 expresión en el SAEC. La observó sobre regulación de IRAK-3, un regulador negativo de la señalización TLR [41], por el tipo de citoquinas-1 podría representar un mecanismo de auto-limitación de ayudar a controlar la respuesta inflamatoria del SAEC.

También se analizó la influencia de un entorno de citoquinas Th2 en la expresión de mRNA TLR y su señalización o de las proteínas. Estos datos demuestran que el tipo-2 citoquinas como la IL-4 e IL-13 inducen una elevación de la expresión de genes de TLR4 en SAEC y, junto con el TNF-α, hasta de regular la expresión de genes de TLR1 y TLR2 en forma sinérgica. Por lo tanto, este medio de citoquinas es probable que a través de promover la señalización TLR1/TLR2 heterodimers. La elevada expresión de TLR4 y TLR1/TLR2 inducida por citoquinas tipo-2 se supone que modulan el impacto de las infecciones bacterianas en Th2 asociadas enfermedades pulmonares como el asma. En este sentido, es interesante observar que TLR2 bacteriana y TLR4 ligandos como lipopeptides o LPS han demostrado modular la respuesta inmune en modelos animales de asma alérgica. Considerando que el ligando específico TLR1/TLR2 Pam 3 CSK 4 y altas concentraciones de los TLR4 ligando E. Coli LPS tener efectos beneficiosos en los modelos animales de asma [12 - 14], dosis bajas de LPS y el TLR2 ligando peptidoglycan sesgo de la respuesta inmune hacia un fenotipo Th2 y conducir a la agravación de asma alérgica experimental [12, 15].

Conclusión

En resumen, nuestros datos demuestran que, entre las evaluadas TLR ligandos, poli (I: C), un análogo sintético de la doble-stranded RNA viral media la más fuerte proinflamatorias efectos en la enseñanza primaria las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas (SAEC) con respecto a la secreción de citoquinas y quimioquinas MMP y liberación de las células. Estas características inflamatorias de poli (I: C) se cree que contribuyen a viral exacerbaciones de la EPOC incluyendo inflamaciones pulmonares y asma. Además, el poli (I: C) modula la expresión de genes de otras TLRs en SAEC, lo que es probable que tengan una gran influencia en la respuesta del epitelio pulmonar a estimulación adicional con TLR ligandos durante las infecciones bacterianas y virales. Además, nuestros datos demuestran una marcada regulación de la expresión de TLR TLRs y señalización por proteínas de un tipo-1 o tipo-2 de citoquinas entorno. La regulación de la expresión de TLR en las pequeñas células epiteliales de las vías respiratorias de tipo-1 y tipo-2 citoquinas es importante considerar el impacto de los exógenos (patógenos asociados) o TLR ligandos endógenos en Th1 o Th2 impulsada inflamaciones pulmonares como la EPOC o asma, respectivamente.

Lista de abreviaturas

EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica; dsRNA: double-stranded RNA; IRAK: interleucina-1 receptor quinasa asociada; MALP-2: la activación de los macrófagos lipopeptide-2, MMP: metaloproteinasas de matriz; Pam 3 CSK 4: sintética tripalmitoylated lipopeptide Pam 3 CysSer ( Lys) 4; PGN: peptidoglycan; poli (I: C): polyinosine-polycytidylic ácido; SAEC: la vía aérea pequeña de células epiteliales.

Conflicto de intereses

La labor fue apoyada por Boehringer-Ingelheim Pharma GmbH & Co KG, Alemania.

Contribuciones de los autores

MR concebida de los experimentos, llevados a cabo el trabajo experimental del estudio y redactó el manuscrito. PS concebida de los experimentos, participó en el diseño y la dirección del estudio y revisó el manuscrito. AW y DM hecho importante contribución a la interpretación de datos y ayudado a revisar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.