Journal of Negative Results in Biomedicine, 2005; 4: 8-8 (más artículos en esta revista)

Sobre la participación de la apoptosis genéticos relacionados con los genes en la enfermedad de Crohn, según lo revela una amplia asociación pantalla utilizando 245 marcadores: no hay pruebas para los nuevos factores predisponentes

BioMed Central
Sonja EN Wagenleiter (sunnie1@gmx.de) [1], Peter Jagiello (pjag@gmx.de) [2], Denis A Akkad (amer.akkad @ rub.de) [1], Larissa Arning (larissa.arning @ Rub.de) [1], Thomas Griga (thomas.griga @ kk-dortmund.de) [3], Wolfram Klein (wolfram.klein @ rub.de) [1], Jörg T Epplen (joerg.t.epplen @ Rub.de) [1]
[1] Departamento de Genética Humana, de la Universidad de Ruhr, Bochum, Alemania
[2] Instituto de Biología Clínica Molecular de la Universidad de Schleswig-Holstein, Kiel, Alemania
[3] Departamento de Gastroenterología, Hospital Universitario de Bergmannsheil, Bochum, Alemania

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Resumen

La enfermedad de Crohn (CD) se presenta como una barrera de las enfermedades inflamatorias con características destructivas en los procesos de la pared intestinal. Aunque el pathomechanisms de CD todavía no se entiende exactamente, hay pruebas de que, además de por ejemplo. La colonización bacteriana, la predisposición genética contribuye al desarrollo de la CD. Con el fin de la búsqueda de factores genéticos predisponentes nos analizado 245 marcadores de microsatélites en una población basada en la vinculación estudio de la cartografía. Estos loci microsatélites cubrir los genes codifican proteínas de las que participan en la regulación de la apoptosis y (innata) inmune procesos. Respectivos loci contribuir a la activación / represión de la apoptosis, están implicados en la transducción de señales y de los reguladores del ciclo celular o que pertenecen a la superfamilia del factor de necrosis tumoral, caspasa genes relacionados con la familia o el BCL2. Además, varias citocinas y quimiocinas como se incluyeron. El enfoque se basa en tres pasos: el análisis de AND mancomunados de los pacientes y controles, la comprobación de marcadores de microsatélites significativamente diferentes de las muestras de ADN de genotipos individuales y, por último, la nueva investigación adicional de los respectivos genes en la región cubierta por los asociados de microsatélites mediante el análisis de un solo nucleótido Polimorfismos (SNP). El uso de este proceso por etapas no hemos podido demostrar evidencia de la predisposición genética de los elegidos y de la apoptosis de los genes relacionados con la inmunidad con respecto a la susceptibilidad para CD.

Introducción

Enfermedad de Crohn (EC) es un trastorno inflamatorio crónico caracterizado por procesos destructivos de la pared intestinal. Las interacciones entre factores genéticos y ambientales potencialmente llevar a un desequilibrio entre la flora bacteriana luminal, y el innato, así como el sistema inmunológico adaptativo [1, 2]. Epidemiológica y genoma amplia estudios han conducir a la identificación de factores genéticos participación en la creación de CD [1, 3, 4]. A pesar de las conclusiones fundamentales, a saber, la variación en el CARD15 receptor y su asociación con CD, la causal que regula los casos exagerada respuesta de la mucosa se mantuvo esquivo. La propuesta de pathomechanisms de CD son múltiples. El dysregulated respuesta del sistema inmune innato se supone que presente un paso fundamental en la patogénesis de la CD [5]. Este hecho ha sido confirmado por varios genéticamente CD asociaciones de los genes, como CD14, TLR4 y, en algunos casos, la interacción de sus variaciones con CARD15 [6, 7]. En cuanto a la polarización T helper (Th) respuesta, el sistema inmune adaptativo aparece afectada en el CD de [8 - 10]. Por otra parte, varios estudios implicados un papel de la muerte celular programada en CD [11 - 15]. Apoptosis media 'auto-tolerancia ", la eliminación de autoreactive inmune compartimentos. Además, el fondo controla la terminación de una respuesta inmune fisiológica se debe al proceso de muerte celular programada. En la mucosa células T CD muestran una menor susceptibilidad a la apoptosis [16]. En este contexto, la proteína TNF α ejerce múltiples efectos fisiológicos, y los anti-TNF α estrategias terapéuticas (por ej. Infliximab) son eficaces para (mantener) la remisión de CD [17]. En varios estudios se ha puesto de manifiesto que el tratamiento de los pacientes con CD infliximab conduce a una activación de las células T lo que les hace susceptibles a la apoptosis [18, 19]. Curiosamente, el efecto de este tratamiento no puede ser debido a la neutralización de TNF α soluble (y su unión a la TNFRs), sino que más bien puede ser causado por su afinidad a la membrana de TNF-α supuestamente obligado cambio de la relación de anti-apoptóticos y pro - Mediadores para la inducción de la apoptosis [18, 20]. Aunque los mecanismos de la función causal de respuestas de las células T en CD, no se habían determinado en detalle, existe una evidencia clínica que sugiere un papel para incontrolada de linfocitos T activados en el proceso patogénico de CD [21 - 24]. Sin embargo, es incierto, ya sea una base genética para una disminución de la activación y la apoptosis de los linfocitos T en pacientes CD existen, y si el aumento de anti-apoptóticos marcadores, que se encuentra en las células T de estos pacientes se debe a la inflamación de la mucosa, en segundo lugar [18] .

En esa compleja situación hemos utilizado extendido asociación de cribado (EAS) con marcadores que representan a 245-y la apoptosis (innata) genes relacionados con la inmunidad. La mayoría de los marcadores han sido investigados utilizado con éxito en los respectivos estudios antes de [25, 26]. Nuestra vinculación cartografía de base poblacional con un 3-etapa de análisis de ADN agrupados en la fase inicial y, posteriormente, cada genotipo. Con el fin de confirmar estos resultados, varios SNPs etiquetado de los genes adyacentes representado por el marcador se analizaron. En este caso, se determinó la función biológica de los distintos trayectos por la susceptibilidad de CD.

Materiales y métodos
Los pacientes

Ciento cincuenta y ocho bien caracterizado pacientes con una clínica, diagnóstico endoscópico e histológico de CD fueron incluidos. Esta cohorte de pacientes se ha informado antes de [27, 28]. Todos los pacientes eran de origen alemán y el diagnóstico de la CD se ajustará de acuerdo con los criterios diagnósticos de la Comunidad Europea Taller sobre Enfermedades Inflamatoria Intestinal (EII). Como un grupo de controles sanos norte alemán (NoG) y el oeste de Alemania (WeG) se analizaron origen. En el paso inicial de un grupo de ~ 100 NoG personas. Con el fin de excluir a la población la estratificación, la genotipificación de SNP elegido se realizó en 180-460 NoG y WeG personas.

Puesta en común de ADN

La concentración de ADN de cada individuo de la paciente y el control de las cohortes se cuantificó por espectrofotometría, llevado a cabo cuatro veces, y luego diluido en consecuencia a 100 ng / μ l. En un segundo paso, el ADN se diluyó a una concentración de 65 ng / μ l, y una vez más medidos por espectrofotometría. Por último, el ADN diluido a 50 ng / μ l se ajustó a un importe final de 1000 ng de cada individuo en un grupo de 50 personas. En la etapa inicial, se realizaron análisis de marcador con dos pacientes y dos de control subpools, respectivamente.

Cola primer PCR

Cola primer PCR se realizó según lo descrito antes [25]: Un 18 bp-cola se añadió a cada oligonucleótido sentido. PCR incluyó tres oligonulceotides, dos de las cuales fueron blanco específico. El tercero consiste en el mismo orden que los citados cola que fue, además, llevan la etiqueta de fluorescencia.

Marcadores de microsatélites

Intragenic microsatélites o marcadores situados en la vecindad inmediata (<50 kb) de los genes específicos fueron incluidos. Información sobre las secuencias de oligonucleótidos y la ubicación de los marcadores se dan en el sitio web (1 archivo adicional, véase también Tab. 1]. Como se informó antes, sólo con marcadores iguales "subgrupo dentro de la" alelo distribuciones con ≥ 2 alelos fueron consideradas en los análisis posteriores [25]. Asoció significativamente los marcadores fueron genotipo individual con el fin de excluir los resultados falsos positivos debido a la posible puesta en común artefactos. En total, 245 marcadores de microsatélites en representación de distintos genes que se analizaron en una losa ABI377-gel sistema (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania).

Estadísticas para el alelo inicial comparaciones de las frecuencias

Raw ABI377 datos de los perfiles fueron analizados por el software Genotyper (ABI) la elaboración de un marcador específico alelo perfil de imagen (AIP), que incluye a diferentes alturas de los picos que refleja el alelo frecuencias. Con el fin de poner a prueba las diferencias entre la AIP CD pacientes y los controles, todas las alturas pico se resumen para cada piscina y fija en 100%. El total alelo contar para cada alelo Se preveía entonces. Acto seguido, el caso de la AIP y de control de las piscinas fueron comparados estadísticamente por medio de tablas de contingencia. Por lo tanto, P valores son nominales y aproximados, ya que estima más que observó fueron utilizados para frecuencias de los alelos. El nivel de significación se fijó en p = 0,05. Con el fin de centrar las estadísticas sobre los principales alelos, todos menores de alelos con una frecuencia de menos de 0,05 se resume a un alelo virtual. Posteriormente, un segundo análisis estadístico por medio de tablas de contingencia se llevó a cabo. Un tercer paso para la prueba de cada alelo estadística fue realizada a título individual (y la suma de todos los demás marcador alelos), según el cual el valor del respectivo grupo de pacientes fue comparado con los de los controles y los análisis posteriores χ 2. A pesar de que la corrección de las pruebas de comparaciones múltiples podría eliminar 'real positivo "los resultados [26], Q valor de corrección se realizó con un corte del 5% para el procedimiento de selección inicial [29].

Sin embargo, para la selección de marcadores para futuras investigaciones, sin corregir los valores de P fueron simplemente ordenadas de acuerdo con sus pruebas de asociación incluidos todos los procedimientos estadísticos realizados.

Genotipo del individuo

Marcadores con alelo significativamente diferentes distribuciones entre los pacientes y controles fueron controlados por genotipo individual muestras de ADN de los pacientes y controles con el fin de excluir los resultados falsos positivos debido a la puesta en común de artesanías. Genotipo del individuo se realizó por electroforesis en gel capilar, utilizando la BeckmanCoulter CEQ8000 sistema de análisis genético (Beckman Coulter, Alemania). Los resultados se analizaron mediante la comparación de cada microsatélite alelo frecuencia desde el CD con la correspondiente cohorte alelo frecuencia en el grupo control de la prueba χ 2 y corregidos por el número de marcadores específicos de alelos según Bonferroni (véase Tab. 2 y URL: http:// Www.ruhr-uni-bochum.de/mhg/marker_information_SENW.pdf]. Equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) se puso a prueba utilizando el programa Genepop http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop.

Genotipificación de SNP

SNPs en los genes, representada por asoció significativamente después de los marcadores individuales de genotipos fueron investigados por el análisis de polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP; ver Tab. 3]. Como el marcador en representación de la TNFRSF17 gen se encuentra en ~ 1 MBp distancia a la CMH clase II transactivator (MHC2TA) de genes, una variación funcional (rs3087456, [30]], de MHC2TA se genotipo por RFLP análisis en el CD de 147 pacientes y 463 controles sanos De los citados control de las poblaciones (véase Tab. 3]. Los resultados se evaluaron por medio de la χ 2-y HWE pruebas. Enlace en desequilibrio (LD) entre el marcador y el polimorfismo de los alelos fue calculado por el programa Genepop.

Resultados
Paso inicial

Microsatélites en representación de 245 genes implicados en la apoptosis reglamento (véase Tab. 1] se investigaron mediante el uso de EAS. Ninguno de los marcadores presentado con importantes diferencias subgrupo dentro de la confirmación de la homogeneidad de las piscinas. La evaluación estadística de las frecuencias de microsatélites en el CD paciente y el control de las cohortes reveló 9 alelo significativamente diferentes distribuciones de los intercambios intracomunitarios o juxtagenic marcadores de FLIP, BCL2A1, BAG1, BPI, erbB3, TP73, TLR9, TNFRSF17 y CARD15 (que se resumen en Tab. 2].

Genotipo del individuo

Genotipo del individuo confirmó significativos valores de p sólo para los 3 marcadores FLIP (p = 0,0044, p c> 0,05, en HWE), TNFRSF17 (p = 0,0012, c p <0,01, en HWE), y el control positivo CARD15 (p = 0,0050, c p <0,04, en HWE). Las asociaciones adicionales para los otros marcadores fueron rechazadas (véase Tab. 2 y archivo adicional 1]. No hubo diferencias y analizar CARD15 + CARD15 - pacientes.

Genotipificación de SNP

SNP marcadores (Tab. 3] se encuentra en el genotipo respectivos genes en la vecindad de la representación de los microsatélites TNFRSF17 y FLIP. Así, se analizaron SNPs propagación a través de la representación de los haplotipos de los genes como por la predisposición de los LD Seleccione 'método informó de antes [31]. RFLP análisis no reveló ninguna asociación de los SNPs seleccionado, ni por la comparación de la CARD15 + ni el CARD15 - pacientes con el grupo de control.

Comparación de los alelos de microsatélites TNFRSF17

Los genotipos de la TNFRSF17 alelos de microsatélites se compararon entre el paciente y el control de las cohortes. Los análisis revelaron pruebas, ya sea para un predisponentes (alelo 3) y un alelo de protección (2) o vinculación entre estos alelos y el marcador alelos, respectivamente.

Genotipos incluidos alelo 2 están excesivamente representados en el grupo control, mientras que aquellos con el alelo 3 de predisposición al parecer son más frecuentes en la Conferencia de Desarme de cohorte, lo que confirma los resultados de cada genotipo (ver Fig. 1].

MHC2TA análisis

El análisis del polimorfismo rs3087456 funcionalmente importantes reveló una asociación marginal en nuestro CD de los pacientes cuando alelo o genotipo frecuencias se compararon entre los combinados de control (WeG y NoG no difieren en frecuencias de los alelos), y el paciente cohortes (véase Tab. 4]. Los análisis de LD entre TNFRSF17 y MHC2TA alelos, sin embargo, no reveló ninguna diferencia importante de equilibrio.

Discusión

El pathomechanisms de CD todavía no se entiende exactamente, aunque aparecen ciertas variaciones CARD15 especialmente frecuentes en los pacientes de CD por lo que se demuestra la participación genéticos. Estos factores de predisposición genética, sin embargo, no son ni suficientes ni explicar que la patogénesis de CD en todos los pacientes. En este estudio presentamos una asociación pantalla principalmente para la apoptosis y los genes relacionados con la inmunidad por marcadores de microsatélites como investigados en un 3 etapas.

Nuestro análisis inicial reveló 9 alelo significativamente diferentes distribuciones de los intercambios intracomunitarios o juxtagenic marcadores de FLIP, BCL2A1, BAG1, BPI, erbB3, TP73, TLR9, TNFRSF17 y CARD15 (véase Tab. 2]. Sin embargo, después de la corrección por Q-valor, ninguno de los marcadores se mantuvo significativa. Por otro lado, un estudio reciente ha planteado la cuestión, si la corrección para comparaciones múltiples se deben aplicar en todos los EAS en [26]. Por ejemplo, en estos análisis previamente asoció significativamente microsatélite (en representación del gen TNF α), que ha sido utilizado como control positivo, como CARD15, habría sido rechazada por el procedimiento de corrección. Por lo tanto, se mantiene la posibilidad de que los citados marcadores representan más bien sugerencias para nuevos factores predisponentes / loci con bajo tamaño del efecto.

Los marcadores más prometedores (que se refleja por un valor de p) se incluyeron en los análisis más independientemente del procedimiento de corrección. Genotipo del individuo rechaza la mayoría de los marcadores que se encontraron diferencias significativas en el primer paso de nuestro enfoque y se mantuvo sólo tres marcadores significativos en representación de la TNFRSF17, FLIP, CARD15 genes (Tab. 2]. Obviamente, agrupados e individuales de rendimiento de genotipos algo resultados contradictorios. Ocho microsatélites reveló diferencias significativas entre el paciente y el control de las cohortes después de la puesta en común procedimiento, mientras que los resultados de genotipos en la confirmación de 'solo' 2 marcadores. Estos debido a las grandes diferencias podrían deberse a varios causados por artefactos combinados con análisis de ADN. Por ejemplo, un típico artefacto es la duración que dependen de la amplificación de alelos corto o nula la presencia de los alelos. Además, la coherencia de los análisis de un sistema de losa-gel podría reflejar un nuevo obstáculo en el presente procedimiento sutil. Sin embargo, cada genotipo elimina falsos resultados positivos debido a la puesta en común y artefactos, en caso de resultados significativos, permite que el análisis minucioso de los alelos marcador en detalle (ver Fig. 1]. Con el fin de confirmar los resultados positivos mencionados más marcadores (SNPs, Tab. 3] se encuentra en el genotipo respectivos genes en la vecindad de la representación de los microsatélites TNFRSF17 y FLIP. Sin embargo, RFLP análisis no reveló ninguna asociación de los SNPs seleccionado y, por lo tanto, los datos de microsatélites no se confirmaron. Por otra parte, estos SNP podrían no representar adecuadamente las regiones que abarcan elementos reguladores.

En algunos casos, la LD de distintos alelos de microsatélites largo cubre distancias genéticas, con lo que han variaciones de genes podría estar en relación con estos alelos. Desde que se asoció significativamente 'TNFRSF17 "marcador está situado en la región IBD8 con 1MBp distancia a la clase principal de histocompatibilidad (MHC) II transactivator (MHCIITA), informó anteriormente funcional de la variación genética MHC2TA se analizó (ver Tab. 4; [30 ]). MHC2TA regula la expresión del antígeno de leucocitos humanos (HLA) de genes que regulan el sistema inmunológico adaptativo mediante la presentación de los antígenos a los linfocitos T CD4 +, con lo que volver a la activación de estas células. La región HLA se ha implicado en la EII [32]. Además de la localización de MHC2TA en IBD8 y el correspondiente marcador en la región adyacente, el putativo de la relevancia biológica funcional polimorfismo rs3087456 para CD genotipo nos motivo a esta variación. Los análisis no revelan una asociación marginal en nuestro CD de los pacientes cuando alelo o genotipo frecuencias se compararon entre los combinados de control y cohortes de pacientes (ver Tab. 4]. Sin embargo, no había pruebas de LD entre TNFRSF17 y MHC2TA alelos. Con el fin de validar estos datos más cohortes de pacientes que comprende más personas debe ser objeto de estudio. Además, otros genes que podrían estar vinculados con el 'TNFRSF17' marcador debe ser analizada (por lo menos 15 RefSeq genes de la región están comprendidos en el marcador microsatélite y MHC2TA).

En conclusión, este estudio no reveló pruebas de la abierta predisposición CD factores en apoptosis (e inmune) itinerarios. Ciertamente, nuestro enfoque depende de la LD entre el investigado y los microsatélites putativo alelos predisponentes o de protección, en función de la pertinencia funcional de la enfermedad. Así, en algunos casos microsatélites podrían no ser totalmente representativa de los genes adyacentes. Además, los genes investigados cubren únicamente una parte de los factores que coordinar la muerte celular programada. Sin embargo, el futuro información sobre los bloques de haplotipos pueden facilitar más rebuscadas interpretaciones de nuestros análisis.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Este archivo proporciona información detallada sobre la secuencia de oligonucleótidos utilizados, representada gen, gen marcador a distancia y el tipo de repetición de nucleótidos (di, tri, etc.) Además, el archivo incluye información gráfica sobre el genotipo individual microsatélites marcadores con diferencias significativas en la distribución de alelo.