Microbial Cell Factories, 2005; 4: 31-31 (más artículos en esta revista)

Papel de los medios de cultivo en el desarrollo de levaduras en gran escala para uso industrial

BioMed Central
Bärbel Hahn-Hägerdal (barbel.hahn-hagerdal @ tmb.lth.se) [1], Kaisa Karhumaa (kaisa.karhumaa @ tmb.lth.se) [1], Christer U Larsson (christer.larsson @ tmb.lth. Se) [1], Marie Gorwa-Grauslund (Marie-Francoise.Gorwa @ tmb.lth.se) [1], Johann Görgens (jgorgens@sun.ac.za) [2], H Willem van Zyl (WHVZ sol @ . Ac.za) [3]
[1] Applied Microbiology, LTH / Lund University, PO Box 124, SE-221 00 Lund, Suecia
[2] Departamento de Ingeniería de Procesos, Universidad de Stellenbosch, Private Bag X1, Stellenbosch 7602, South Africa
[3] Departamento de Microbiología, Universidad de Stellenbosch, Private Bag X1, Stellenbosch

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Resumen

La composición de los medios de cultivo de la cepa en relación con el desarrollo industrial de solicitud es revisada. Producción de proteínas heterólogas y pentosa utilización de Saccharomyces cerevisiae se utilizan para ilustrar la influencia de los medios de composición en las diferentes etapas de la construcción y la cepa cepa desarrollo. Los efectos del complejo, que se define y se comparan los medios de comunicación industriales. Auxotrophic cepa cepas y la estabilidad de la información. Medios para la producción de proteínas heterólogas y la mayor parte de la bio-se resumen a la producción de productos básicos.

Introducción

La composición del medio utilizado para el cultivo de los microorganismos se refleja directamente en su fenotipo fisiológico fermentación y su rendimiento, que a su vez afecta a los resultados de los análisis y la cepa cepa desempeño en aplicaciones industriales. Por esta razón, el éxito en el desarrollo de cepas para la producción industrial a gran escala de proteínas heterólogas [1, 2] y de bajo valor combustibles, materiales y productos químicos [3, 4] merece la composición de los medios de cultivos en diversas etapas de desarrollo, que se cepa Reconsiderarse.

La introducción de nuevas cepas recombinantes en medios de cultivo industrial puede revelar que la cepa no se ha diseñado para este entorno. Por ejemplo, se descubrió que una cepa de la bacteria del ácido láctico Streptococcus thermophilus exopolysaccharide de ingeniería para aumentar la producción - un rasgo muy deseable en la producción de yogur - no expresan el fenotipo en la leche sin la adición de una fuente extra de nitrógeno [5]. Del mismo modo, una cepa modificada genéticamente de la levadura Saccharomyces cerevisiae, que se ha comunicado como la solución definitiva de la fermentación de xilosa lignocellulose derivados [6, 7], se encontró a exigir extracto de levadura, el azúcar adicional hexosa y la oxigenación de manera eficiente a fermentar la xilosa Fracción gastado en licor sulfito [8]. Además, la producción de proteínas heterólogas en levaduras está fuertemente influenciada por la composición de nitrógeno de la producción a medio [9, 10]. Así, el final ambiente industrial debe considerarse en todo proceso de desarrollo de la cepa de evitar expectativas infundadas y - lo más importante - para evitar costosas inversiones en instalaciones de producción prematuro.

Un medio de cultivo está diseñada para reflejar la composición elemental y la biosíntesis de la capacidad de un determinado celular microbiana (ver por ejemplo [11]]. Si bien la composición elemental de las células microbianas es relativamente similar, la biosíntesis de la capacidad varía ampliamente. La levadura S. Cerevisiae y de la bacteria Escherichia coli tienen una amplia capacidad de biosíntesis y crecer en los medios de comunicación definen minerales [12]. En cambio, la capacidad de biosíntesis de muchas bacterias ácido-lácticas es limitado y que requieren ricos o ampliamente complementado medio eficaz para el crecimiento [13]. Además, las restricciones económicas que la producción a gran escala de productos de bajo costo depende de baratas fuentes de carbono y nitrógeno, tales como melazas de la industria azucarera, maíz empinados licor de la industria del almidón, pasó sulfito licor de la industria de los productos forestales y el queso Suero de la industria lechera [14, 15]. Además de proporcionar carbono, el nitrógeno, vitaminas y oligoelementos necesarios para el crecimiento celular y la producción de metabolitos, por ejemplo, los medios de comunicación industriales también pueden contener sustancias que inhiben el crecimiento y la producción de metabolitos.

El presente artículo analiza la influencia de la composición de los medios de cultivo en el desarrollo de nuevas cepas de la producción industrial con la opinión de que es necesario tener en cuenta las condiciones de cultivo de la final en todas las etapas de desarrollo de la cepa. Principalmente dos tipos de cepas recombinantes de S. Cerevisiae se utilizan como ejemplos: las cepas que producen proteínas heterólogas y las cepas con una mayor gama de sustrato para incluir azúcares pentosa. La experiencia de otros organismos se incluye como complemento de la discusión. Por último, la ingeniería genética industrial enfoques para superar las limitaciones de los medios de comunicación también son un ejemplo.

Ingeniería metabólica, evolutiva y la biología de sistemas de ingeniería en el desarrollo cepa

Tradicionalmente, la producción de nuevas cepas han sido desarrollados por mutagénesis [16], [17] de cría, y el recientemente reactivado concepto evolutivo de la ingeniería (Figura 1; [18 - 20]]. Cepas con rasgos nuevos son ahora también desarrollado por las tecnologías de las ciencias de la vida, incluidos los genéticos, metabólicos y de ingeniería (Figura 2; [21 - 23]]. En los últimos años estos conceptos de ingeniería que se han ampliado en el contexto de la biología de sistemas para incluir también información del sistema de ciencia y tecnología [24 - 26]. En ingeniería metabólica, las células son analizadas iterativamente, diseñado y sintetizado (Figura 2] a través de herramientas moleculares como la tecnología de ADN recombinante y la información genómica, [27, 28]. Evolutiva de ingeniería (Figura 1] se basa en los protocolos de selección cuidadosamente diseñados, es decir, medios de comunicación y las condiciones de cultivo [18 - 20] para el desarrollo de cepas con características interesantes industrialmente. Ingeniería metabólica y evolutivo tecnologías también pueden ser combinados para generar rasgos nuevos [29 - 33]. La multitud de datos generados en el análisis del genoma, transcriptome, proteoma y metabolome [25] exige el uso de la información del sistema de ciencia y tecnología para traducir estos datos en el diseño de estrategias de las próximas rondas de ingeniería metabólica y evolutivo [24]. Varios estudios han señalado que las condiciones de cultivo y la composición de los medios de comunicación utilizados para el análisis de las nuevas cepas de ingeniería influyen fuertemente los datos generados [34 - 39]. Dado que estos datos constituyen la base para el diseño de la estrategia para las siguientes rondas de cepa de desarrollo, es evidente que la elección de los medios de cultivos es una parte integrante y fundamental de la cepa desarrollo.

Medios de comunicación y la estabilidad de la cepa

Considerando que la cepa de desarrollo por técnicas de recombinación se realiza en el laboratorio de cepas genéticamente definidas albergar los marcadores adecuados para la selección de las células transformadas en química definida medios de cultivos, la producción industrial típico de la cepa es genéticamente definido y adaptado a realizar en bastante pobre, tóxicos, viscoso, y de los nutrientes De los medios de comunicación limitada. Una vez que se desea rasgos nuevos se han creado en el laboratorio de cepas recombinantes, la novela cepas son o bien transferidos directamente a la producción industrial o el medio ambiente - como ocurre con mucha más frecuencia - una posible cepa de la producción tiene que someterse a una nueva ronda de procedimientos de ingeniería metabólica. En ambos casos, el medio en que la novela se desarrollan las vías difiere sustancialmente de la media en la que la producción final cepa que se espera llevar a cabo.

La estabilidad genética de las cepas es un requisito absoluto para la utilización en los procesos industriales. Debido a la naturaleza de adaptación de los microorganismos, la atención debe también estar encaminada a la estabilidad de los rasgos nuevos en cualquier recombinante o cepas mutantes. En la industria, los ricos o indefinido se utilizan con frecuencia los medios de comunicación, que puede resultar en la pérdida inesperada de plásmidos e incluso modificaciones cromosómicas. Prolongado de cultivo, por ejemplo, en la fermentación continua de cambios, aumenta la probabilidad de inestabilidad genética perjudicial. Incluso en medio de minerales, la pérdida de los plásmidos con auxotrophic marcador ha reportado en continuo prolongado culturas [40]. Esto fue provocado por aminoácidos liberados de las células de morir, y probablemente también por cromosómicas espontáneas inserción de los marcadores de genes [40].

En S. Cerevisiae, tanto episomal plasmids (YEp; [41]] y de integración plásmidos (YIp; [42]] se utilizan como vectores de expresión de proteínas heterólogas de expresión y de ingeniería metabólica. La ventaja de YIp vectores, a pesar de su bajo número de copias, es su sólida estabilidad genética incluso en medio unselective debido a la integración del vector en el genoma de la levadura [43 - 51]. El beneficio de utilizar YEp plásmidos es el elevado número de copias de genes de hasta 70 copias por célula [52] resulta en altos niveles de expresión de la proteína deseada, a pesar de su alta inestabilidad segregational a menudo resulta en la pérdida del plásmido especialmente en medio rico [53, 54 ]. Sin embargo, la estabilidad de tipo de YEp vectores se puede mejorar autoselection sistemas, como el sistema de fur1 ura3 [55], donde la supresión de FUR1 junto con el uso de un plásmido conteniendo el marcador URA3 resultados estables en el plásmido de expresión, incluso en continua Cultura [56]. Sin autoselection tales sistemas es necesario utilizar un medio selectivo para superar la inestabilidad de YEp plásmidos, que pueden suponer una limitación para el uso industrial de tales cepas en especial con productos de bajo costo.

Rich complejo de los medios de comunicación frente a los medios de comunicación definen

En general, los microorganismos crecen más vigorosamente en los medios de comunicación ricos en minerales que los medios de comunicación, porque los medios de comunicación ricos biosintéticas contienen los precursores que se puede canalizar directamente en las vías de anabólicos, la reducción de la necesidad de producir biosíntesis de los precursores y de ahorro de energía metabólica. Esto tiene un efecto significativo sobre el crecimiento y características de la producción.

Por ejemplo, un triple aumento en los niveles de producción de lacasa heteróloga por recombinante Yarrowia lipolytica se informó de, al cambiar de base de levadura de nitrógeno (YNB) a mediano complejo [10]. Cuando autoselective cepas de S. Cerevisiae expresando xilanasa heteróloga o α-L-arabinofuranosidase genes fueron cultivadas en medio YPD complejo, 24 veces más altos que xilanasa y hasta 70 veces más altos que los niveles de α-L-arabinofuranosidase se produjeron [57, 58]. Del mismo modo, los niveles de producción de la potente inhibidor específico de la trombina, hirudina, por recombinante S. Cerevisiae es la mejora de 20 veces en el complejo medio [59], lo que demuestra el impacto sustancial en la composición media de la producción de proteínas heterólogas.

Aoki et al. [60] elegantemente demostrado un solo paso de purificación de cisteína proteinasa recombinante (NsCys) de Pichia pastoris por el cambio de composición durante el cultivo mediano. El recombinante p. Pastoris se cultivan en glicerol complejo medio para generar biomasa en un corto período de tiempo. Las células fueron cosechadas y resuspendido en medio mínimo para la inducción de la producción NsCys. El mínimo medio facilitado la secreción de la proteína y la posterior purificación.

Cepas de E. Coli con niveles alterados de piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa muestran una reducción del flujo de piruvato en la fermentación nativas cultivadas en las vías cuando se define a medio [61]. Además, el flujo de carbono en los esqueletos 2-cetoglutarato brazo de la vía del ácido tricarboxylic biosíntesis y se limitó, lo que redujo drásticamente los rendimientos de crecimiento en comparación con el medio definido complejo medio. Las observaciones demostraron que las limitaciones inherentes en el metabolismo de la ingeniería cepas se pueden enmascarar por la presencia de nutrientes en el complejo y medianas a menudo no son observados sin cultivo en medio definido.

Para ilustrar la influencia de los medios de comunicación sobre la composición cepa rendimiento, en comparación al crecimiento de la levadura de panadero y dos cepas recombinantes: un laboratorio cepa de S. Cerevisiae, TMB3001 [62] y de una cepa de S. industrial Cerevisiae, TMB3400 [29]. Ambas cepas recombinantes se han diseñado para la utilización de xilosa con la introducción de la XYL1 [63] y XYL2 [64] genes que codifican xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, respectivamente, a partir de la levadura Pichia stipitis. Además, el gen endógeno XKS1 [65] codificación xylulokinase ha sido sobreexpresa.

Se evaluó la influencia de los cuatro medios de comunicación de uso común en el crecimiento y formación de producto y el oxígeno aeróbico bajo condiciones limitadas: extracto de levadura-peptona (YP [66, 67]], un mineral definido medio (DM; [68]); levadura base de nitrógeno ( YNB; [12]], y sintéticas completa (SC) equivalente a complementarse a medio YNB [12] (Tabla 1]. YP indefinido es un rico complejo integrado por medio de extracto de levadura (YE) y peptona. YE es preparado por autolisis de las células de levadura en su conjunto alrededor de 50 ° C [66, 69 - 71] y de peptona es un ácido o de hidrolizado enzimático de una proteína rica por subproducto de la industria de los piensos y los alimentos [67]. YP contiene todos los componentes necesarios para la propagación de células de levadura, incluida la biosíntesis de bloques de construcción, y es de uso frecuente en las etapas iniciales de la fermentación cuando un gran inóculo es obligatorio. YNB es un medio químicamente definido que puede ser complementada para satisfacer las necesidades de auxotrophic mutantes de levadura utilizadas en la ingeniería metabólica, entonces denominado SC medio. DM mediano contiene casi todos los componentes del medio YNB (Tabla 1], sin embargo, algunos de los componentes están presentes en los más altos e incluso un orden de magnitud mayor que la concentración en medio YNB. El DM medio y variantes de éstos se utilizan normalmente para obtener datos cuantitativos fisiológicas para las cepas de levadura. Se ha diseñado para garantizar que las concentraciones de vitaminas y oligoelementos no ejercen el crecimiento de limitación [68]. Cloruro de sodio, riboflavina y ácido fólico no se encuentra es necesario para el crecimiento de S. Cerevisiae, mientras que el cobalto aparentemente apoya el crecimiento (Tabla 1]. EDTA parece ser necesario para disolver altas concentraciones de elementos traza.

YP apoya el crecimiento comercial de una cepa de levadura de panadero, incluso en ausencia de fuente de carbono adicional (Figura 3]. La máxima tasa de crecimiento específico en estas condiciones fue de 0,29 h -1 con un final de 3-4 OD 620 después de las 24 horas. Con algo más de 20 g / l de glucosa en un 620 OD, de 22 se llegó a un máximo de la tasa de crecimiento específico de 0,45 h -1. Azúcares presentes en YE pueden explicar este fenómeno. Levadura de almacenamiento de hidratos de carbono se acumula como trehalosa y glucógeno, la cantidad de la que depende en gran medida de las condiciones de cultivo [72]. Durante la preparación de estos compuestos son YE total o parcialmente hidrolizado en monómero glucosa. YE también contiene lactato, que puede servir como fuente de carbono en el cultivo de levaduras [9]. Lactato es una consecuencia de la no estéril en el cultivo de las condiciones del panadero y levadura de cerveza de producción [73]. Además de estos auxiliares, fuentes de carbono, YE contiene también una serie de otros compuestos, que influyen fuertemente en el rendimiento de fermentación [9].

La máxima tasa de crecimiento específico de TMB3001 y TMB3400 en los cuatro medios diferentes (Tabla 2] en el marco limitado de oxígeno aeróbico y condiciones varían considerablemente. Tasas de crecimiento más altas se obtuvieron en medio aeróbico YP y significativamente más bajos índices de crecimiento se observó en los tres medios se define tanto por la glucosa y la xilosa como fuente de carbono (Tabla 2]. Los resultados apoyan observaciones anteriores complejo que los componentes de los medios puede ocultar limitaciones intrínsecas en el metabolismo de las cepas recombinantes como se ha demostrado para E. [61] coli y S. Cerevisiae [8].

En todos los medios de comunicación TMB3400 muestran significativamente mayor tasa de crecimiento específico sobre xilosa que TMB3001 confirmando resultados anteriores [29, 32]. La reducción del suministro de oxígeno hizo hincapié en esta diferencia. Ambas cepas muestran significativamente menor tasa de crecimiento específico sobre xilosa que en la glucosa (Tabla 2] que confirma observaciones anteriores [29]. También en esta comparación, la limitación de oxígeno aumentado la diferencia. DM y medio YNB casi idéntico resultado en tasas de crecimiento específicas que indiquen que el nivel de oligoelementos y vitaminas en YNB no limitar el crecimiento en virtud de las condiciones de cultivo elegido actualmente. En la administración de suplementos de aminoácidos YNB aumentado ligeramente las tasas de crecimiento durante la utilización xilosa, pero no en virtud de la utilización de glucosa (Tabla 2].

La captación volumétrica xilosa refleja la tasa de crecimiento en los cuatro medios de comunicación con ambas cepas y en virtud de los dos niveles de oxigenación (Tabla 2]. La figura 4 muestra el curso temporal de xilosa y de los productos de consumo para la formación de TMB3400 bajo condiciones limitadas de oxígeno utilizando YP YNB y medio. Los resultados de sólo uno de los minerales desde los medios de comunicación se muestran el crecimiento y la formación de producto es idéntico en los tres medios de comunicación de minerales. Considerando que los resultados hacen hincapié en la promoción de un crecimiento fuerte influencia de la YP medio también muestran que la composición de los medios de comunicación no influyen en la distribución de los productos en virtud de los elegidos condiciones (Figura 4].

Buffers

Cuele el desarrollo pueden requerir un gran número de cepas para ser evaluados por su desempeño en la simple detección de cambios [74, 75], donde ni la disponibilidad de oxígeno ni el pH es controlado. Cuando los microorganismos crecen en medio mineral definido con amonio como única fuente de nitrógeno, acidifica el medio rápidamente debido a la excreción de protones durante la actividad de transporte de nutrientes a la célula [76]. La acidificación rápidamente inhibe el crecimiento celular y el metabolismo [77]. Por lo tanto, los medios de comunicación debe ser en todo el buffer de pH óptimo para el microorganismo que se han de investigar. Por ejemplo, en fermentaciones industriales de levadura, es importante mantener el pH alrededor de 5,5. Se comparó la influencia de los 50 mM buffering sales en el crecimiento de TMB3001 YP en la MS y en los medios de comunicación (Figura 5]. La idoneidad de citrato, citrato / fosfato, fosfato y ftalato de amortiguación para el medio de cultivo a pH 5,5 se compararon.

YP tenido la inherente capacidad amortiguadora, mientras que el pH no de búfer en MS disminuyó a 2,5 cuando el máximo se alcanzó OD 620. La presencia de citrato y citrato / fosfato severamente inhibido el crecimiento de YP, mientras que la inhibición es un poco menos grave en DM. Con tres grupos carboxilo, citrato es un quelante compuestos y complejos con elementos traza en YP. En DM, que la concentración de elementos traza se ha mejorado (Cuadro 1], la inhibición de citrato fue menos grave. Ftalato mostró la mejor capacidad buffer, sin embargo, el precio de esta memoria intermedia compuesto puede limitar su uso en grandes cantidades. Con buffer fosfato, pH medio de la MS se redujo a alrededor de 3 en la fase estacionaria tardía, pero no se observó inhibición del crecimiento. Así, dependiendo de la escala de tensión, ya sea de selección o ftalato de buffer fosfato se debe utilizar para el desarrollo de levaduras trabajo.

Auxotrophic marcadores: pros y contras

La construcción de cepas recombinantes requiere seleccionar los genes marcadores eficaces para la detección y selección de las células transformadas. Por S. Cereviciae, la supresión cepas mutantes y que presenten una o varias auxotrophic requisitos son la mayoría de las herramientas más utilizadas en el desarrollo de cepas recombinantes [78]. El uso de mutantes auxotrophic basa en el supuesto de que complementar auxotrophy por plásmido de expresión hace que la cepa equivalente a su homólogo prototrophic. Sin embargo, este no es siempre el caso, como se ha demostrado por cepas portadoras del gen LEU2 en un plásmido multicopy [34].

Además de los marcadores utilizados para auxotrophic plásmido retención, uncomplemented auxotrophic mutaciones suelen quedar en el presente transformado levaduras, que requieren la adición de la necesaria amino ácidos nucleicos o al medio de cultivo. El uso de tales cepas auxotrophic recientemente se ha revisado críticamente [36]. Sobre la base de las complicaciones que se plantean en la traducción de los datos experimentales obtenidos con cepas auxotrophic en datos cuantitativos fisiológicas, el autor llegó a la conclusión de que las cepas auxotrophic debe evitarse a menos que auxotrophy sí estaba bajo investigación. Una solución a este problema es genético complementación de los restantes auxotrophic marcadores, que es bastante simple (véase por ejemplo [32, 37]] y recupera la prototrophic genotipo.

Uncomplemented auxotrophic mutaciones también puede afectar los niveles de producción de proteínas recombinantes [36]. Esto se confirmó recientemente cuando el crecimiento y la producción de proteínas extracelulares se compararon por un auxotrophic y un prototrophic S. Cerevisiae cepa de Trichoderma reesei expresando la β-1, 4-xilanasa XYN2 de genes [37]. Sólo excesivo de suplementos de aminoácidos auxotrophic permitido a la cepa para producir las proteínas heterólogas en niveles comparables a la cepa prototrophic. Otros estudios han confirmado que el exceso de auxotrophic marcadores transformado en S. Cerevisiae cepas resultado a menudo en el exceso de la necesaria disminución de metabolitos y el crecimiento, la producción de proteínas y de la estabilidad genética [9, 34, 45, 79 - 84]. Estos estudios demuestran claramente que los datos fisiológicos obtenidos con auxotrophic cepas tienen que ser evaluadas con mucha cautela y no debe constituir la base para el futuro diseño de las estrategias de tensión.

Medios de necesidades / suplementos para la producción de proteínas heterólogas

Expresión de proteínas es una estrategia inherente de la ingeniería metabólica, si se lleva a cabo para la producción de la proteína en sí o para redireccionar una vía metabólica. Se observó que a principios de alto nivel de la expresión de la proteína influido tanto de la fisiología celular procariótico y microorganismos eucarióticos (lit. revisado en [37, 38, 85]]. El efecto más destacado se redujo el crecimiento de las células. El fenómeno fue llamado "metabolismo" [53, 86] y, posteriormente, "proteínas" [40, 87], ya que la carga se discrimina de la influencia de la actividad catalítica de la proteína [87]. La magnitud y la causa de la carga de proteínas se calcula mediante la comparación de las cepas de S. recombinante Cerevisiae expresando T. Reesei β-1, 4-xilanasa XYN2 codificadas por los genes [85]. Tanto la introducción de la glicolítica promotor sin el gen estructural, y además de los genes en sí, ejercido una carga metabólica en el anfitrión. La reducción de la máxima tasa de crecimiento específico, la biomasa y los rendimientos de las tasas de consumo de glucosa fueron mucho mayores de lo esperado de la cantidad de proteína producida heteróloga [85]. Cuando el medio de cultivo se complementó con una mezcla equilibrada de aminoácidos preferido (Ala, Arg, Asn, Glu, Glu y Gly) o succinate, los efectos perjudiciales metabólicos podría ser relevado parcialmente [38]. Aminoácidos mayor crecimiento de las células y la producción de proteínas heterólogas, que apoya la observación de que la levadura recombinantes que expresan proteínas heterólogas agotamiento de la experiencia y la biosíntesis de aminoácidos precursores [88].

Esta última observación es la base de todo el genoma de la transcripción análisis de dos cepas isogénicas de S. Cerevisiae albergar multicopy ya sea un plásmido con la T. Reesei XYN2 gen bajo el control de la S. Cerevisiae PGK1 promotor [58] o con el plásmido ni el gen estructural ni el promotor. Transcripción de datos (disponible en [89, 90]] se resumen en la Tabla 3. Transcripcional durante los perfiles de expresión de la xilanasa heteróloga firmemente asemejaba grave limitación resultante de aminoácidos en la regulación del transporte de aminoácidos y la síntesis, complementado por la inducción de la respuesta de estrés general y de la respiración, y la represión de la ribosomal glicolítica y la expresión de los genes. La respuesta transcripcional de expresión heteróloga xilanasa asemeja por lo tanto, la estricta respuesta de estrés, al parecer debido a la limitación de aminoácidos [38, 91, 92]. Similar estrictas estrés respuesta ha sido reportado en cepas de la bacteria E. Coli overproducing proteínas heterólogas. La E. Coli estrictas estrés implica normalmente la respuesta a la represión de la síntesis de ribosomas y la desrepresión de la respiración, la absorción de aminoácidos y biosíntesis de aminoácidos debido a la limitación de nutrientes [93]. La respuesta de estrés estrictas en S. Cerevisiae ha sido previamente asociado con la limitación de nitrógeno y de nutrición downshift [94 - 97]. El hecho de que la administración de suplementos de aminoácidos del medio de cultivo también mejoró la producción de proteínas heterólogas bajo el control de un promotor de oxígeno regulado en la levadura Pichia stipitis [39] parece más apoyo que la inducción de una respuesta de nitrógeno inanición debido a la expresión de la proteína heteróloga es general.

La elección de la fuente de nitrógeno en medios de cultivos para la producción de proteínas heterólogas es crucial, ya ha quedado ampliamente ilustrado con diversas observaciones por fuentes de nitrógeno para el complejo industrial de la producción de proteínas. La incoherencia en el complejo de componentes, tales como extracto de levadura puede limitar la posibilidad de reproducción de rendimiento industrial de fermentación, resultando en 2-3 veces las diferencias en los niveles de producción de proteínas heterólogas [9]. Para la producción industrial, el complejo de proteínas de suero de queso puede ser hidrolizada por las proteasas para permitir la utilización de microorganismos [98], que ha demostrado mejorar la producción de proteínas heterólogas en comparación con minerales de mediano [99, 100]. Sin embargo, otros informes indican un crecimiento más lento y menor producción de proteínas heterólogas en el queso de suero de leche en comparación a los minerales que contienen lactosa medio [101].

La presencia de componentes del nitrógeno en el cultivo de los medios de comunicación también pueden ser importantes para proteger a las proteínas heterólogas en el medio extracelular de proteólisis. Proteólisis extracelular de proteínas heterólogas se ve afectada por las condiciones de nutrición, y puede aumentar debido a la glucosa agotamiento o el hambre de carbono [45, 102, 103]. La adición de complejas fuentes de nitrógeno, como casamino ácidos, péptidos, aminoácidos, leche descremada o albúmina sérica bovina ha demostrado que disminuye la degradación de las proteínas heterólogas por S. Cerevisiae y P. Pastoris, probablemente mediante el suministro de grandes cantidades de proteínas sustrato o la reducción de la producción de proteasas extracelulares [81, 104 - 110]. Además de los aminoácidos lisina y arginina a las culturas de S. Cerevisiae en medio definido ha disminuido proteólisis extracelular de proteínas recombinantes, muy probablemente debido a la inhibición de enzimas proteolíticas específicas para el péptido bonos incluidos aminoácidos básicos [111, 112]. Búfer el medio de cultivo a un pH donde se minimiza la degradación de la proteína también puede reducir el desglose de las proteínas heterólogas [104, 107, 113 - 116].

Particular fuentes de carbono también puede ser necesaria para apoyar la producción de proteínas heterólogas durante las fases de crecimiento específicas. La producción de antígenos recombinantes en la gluconeogénesis en S. Cerevisiae requiere componentes adicionales como medio de lactato y trehalosa suficiente para asegurar la disponibilidad de energía metabólica [9]. Además, demasiado altas concentraciones de sales pueden reducir la producción de proteínas heterólogas [117].

Para la producción industrial de alto valor de proteínas heterólogas como la bio-farmacéuticos, el aumento de los costos asociados con el uso de un determinado medio de minerales puede justificarse sobre la base de una mayor reproducibilidad, la productividad, y los requisitos para la aprobación reglamentaria [45]. Para ambos complejos definidos y los medios de comunicación, el efecto negativo de nutrientes limitaciones pueden reducirse al mínimo mediante la optimización de las concentraciones de los componentes del medio. Esto debería hacerse preferiblemente por la metodología de superficie de respuesta (ver por ejemplo [118, 119]]. Este procedimiento empírico se requiere por separado para cada una de proteínas heterólogas, para cada una de las cuales el medio óptimo composiciones pueden diferir sustancialmente.

Industrial medios de comunicación masiva para la producción de bio-productos

Los componentes de los medios tienen un muy fuerte impacto en la economía industrial de los procesos de fermentación y puede representar hasta el 30% del total de los costes de producción [120, 121]. La producción a gran escala de productos básicos baratos, tales como combustibles, productos químicos y materiales requiere muy barata la materia prima [14, 15]. Tales procesos de utilización de los subproductos de la agricultura, la silvicultura y la industria química como fuentes de carbono y nitrógeno. Fuentes de carbono son el azúcar de remolacha y de caña de azúcar de melaza, residuos de la producción de azúcar, licor gastado sulfito (SSL) de la industria de pulpa de papel, suero de leche y queso de la industria lechera. Gastados biomasa de levadura pueden ser procesadas para obtener valiosa mediano suplementos (ver por ejemplo [120, 121]] y puede servir como sustituto de los más caros extracto de levadura. Una fuente de nitrógeno a menudo utilizados en procesos industriales de fermentación es de maíz empinados licor formado durante la producción de almidón de maíz [14, 15].

Limitaciones económicas en gran escala de procesos industriales limitar rigurosamente la utilización de los aditivos y pretreatments antes de cultivo. Para la producción de etanol y masa celular usando SSL y melaza, sales de amoníaco son a menudo el único aditivo proporcionar el pH deseado, una fuente de nitrógeno y posiblemente de fosfato. Producción de células de la masa y etanol son generalmente realizadas en el marco de no estéril [73] en un pH bajo, que permite a la levadura a crecer, mientras que el crecimiento de los microorganismos contaminantes se inhibe. Es evidente que la producción de cepas de trabajo de manera eficiente en los medios de comunicación son muy diferentes de las cepas de laboratorio inicialmente utilizado para desarrollar nuevos rasgos metabólicos. Las limitaciones medioambientales de la fermentación industrial de los medios de comunicación se resumen bajo los epígrafes siguientes: (i) el azúcar múltiples substratos que se convierten en el producto final, (ii) de la formación de producto, (iii) la limitación de nutrientes, y (iv) los inhibidores.

Observaciones finales

La literatura actual sobre los medios de composición en las diferentes etapas de desarrollo de la cepa de levadura industrial a gran escala se ha resumido la fermentación con el fin de que los medios de comunicación composición es una parte integral del desarrollo de la cepa. En particular el último entorno industrial debe considerarse cuidadosamente en todo el proceso de desarrollo de la cepa con el fin de asegurar el éxito de la introducción de nuevas cepas de ingeniería en gran escala de procesos industriales.

Agradecimientos

La fundación sueca de Cooperación Internacional en Investigación y Educación Superior (STINT), la Agencia Sueca de Energía (STEM), el Instituto Sueco (SI), la Fundación Internacional para la Ciencia (IFS) y la Fundación Nacional de Investigación (NRF; Sudáfrica) son Agradece por el apoyo financiero.