Journal of Negative Results in Biomedicine, 2005; 4: 9-9 (más artículos en esta revista)

Beta-defensin genómica número de copias no es un modificador locus para la fibrosis quística

BioMed Central
Edward J Hollox (ed.hollox @ nottingham.ac.uk) [1], Jane Davies (jane.davies @ ic.ac.uk) [2], Uta Griesenbach (uta.griesenbach @ ic.ac.uk) [2 ], Juliana Burgess (juliana.burgess @ ic.ac.uk) [4], Eric WFW Alton (eric.alton @ ic.ac.uk) [2], John AL Armour (john.armour @ nottingham.ac.uk ) [1]
[1] Instituto de Genética de la Universidad de Nottingham, Nottingham, UK
[2] Departamento de Terapia Genética de la Facultad de Medicina de la National Heart and Lung Institute, Imperial College, Londres, Reino Unido
[3] Pediátrico de Enfermedades Respiratorias, Royal Brompton Hospital, Londres, Reino Unido
[4] Adultos Fibrosis Quística, Royal Brompton Hospital, Londres, Reino Unido

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Resumen

Humanos beta-defensin 2 (DEFB4, también conocido como DEFB2 o hBD-2) es una sal sensible a los antimicrobianos proteína que se expresa en el epitelio pulmonar. Trabajos anteriores ha demostrado que es codificada en un grupo de beta-defensin genes en 8p23.1, que en número de copias varía entre 2 y 12 en diferentes individuos. Se determinó el número de copias de este locus en 355 pacientes con fibrosis quística (FQ), y la prueba de correlación entre la beta-defensin grupo genómico número de copias y la enfermedad pulmonar asociada con FQ. No se encontró relación.

Antecedentes

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética autosómica recesiva en epitelios (en la línea de herencia mendeliana Man (MIM) 219700, http://www.ncbi.nlm.nih.gov], con infección pulmonar crónica son la principal causa de morbilidad y Mortalidad. Ha aa frecuencia portadora de alrededor de 1 en 25 en el Reino Unido, y la enfermedad se debe a mutaciones en la fibrosis quística gen regulador de la conductancia transmembrana (CFTR) gen, que codifica una membrana de cloruro de canal (OMIM 602421). Hay un amplio espectro de diferentes mutaciones sabe que causan la FQ, pero la más común es la mutación Δ F508, que existe en la población europea como un alelo polimórfico con una frecuencia de entre 2 y 3%.

El curso de la infección pulmonar puede variar mucho entre los pacientes con la misma mutación CFTR, y pese al amplio espectro de mutaciones causantes de las enfermedades, sólo unas pocas se correlaciona con la gravedad de la enfermedad pulmonar. La búsqueda de loci genéticos modificación de la enfermedad pulmonar en los pacientes con FQ ha producido varios candidatos, con el gen de lectina vinculante manosa (MBL), siendo los más notables. MBL es una parte del sistema inmune innato, y la baja en el suero MBL ha sido asociada con las infecciones en adultos y niños [1, 2]. Varios estudios han informado de los vínculos con la gravedad de enfermedad pulmonar de la FQ, a pesar de la conclusión sobre el impacto de la deficiencia de heterocigotos estado difieren entre estos [3 - 5].

Al igual que MBL, beta-defensinas son una parte importante de la inmunidad innata. El péptido beta-defensin humanos 2 (codificada por el gen DEFB4, también conocido como DEFB2 o hBD-2) se ha identificado como una sal-sensible agente antibacteriano expresó las vías respiratorias en los pulmones [6]. En vista de la colonización bacteriana crónica de los pulmones, este es un candidato potencial para un locus modificadores de la FQ. Es posible que la variación en los niveles DEFB4 podría causar cambios en la eficacia antibacteriana de las vías respiratorias superficie de líquidos. El deterioro de la función pulmonar durante la progresión clínica de la FQ DEFB4 se correlaciona con los niveles de expresión, lo que sugiere una vez más que DEFB4 tiene un importante papel en las vías respiratorias antibacterial líquido de superficie [7]. Además, hasta DEFB4 expresión es regulada por Pseudomonas aeruginosa mucoide, y tiene muy eficaz actividad bactericida en contra de ella [8, 9], pero otro importante patógeno en los pulmones con FQ, Burkholderia cepacia, no está muerto por superficie de la vía aérea fluido expresando DEFB4 [10] .

Tres beta-defensinas se expresan en niveles significativos en epitelios de las vías respiratorias: humanos beta-defensin 1 (DEFB1), que se expresa en el pulmón [11], la beta-defensin 3 (DEFB103, también conocido como DEFB3 o hBD-3), que es Expresada en la tráquea [12], y DEFB4, expresó también en el pulmón [6]. Los tres genes son parte de un grupo de beta-defensin en locus cromosómico 8p23.1 [13]. Este conjunto de defensinas beta, con la excepción de DEFB1, ha demostrado ser en una unidad de repetición de al menos 260 kb, que varía en número de copias en diferentes personas. Los individuos pueden tener entre 2 y 12 copias, con la mayoría de las personas que tengan 3, 4 o 5 ejemplares, y el número de copias se correlaciona con el nivel basal de expresión no DEFB4 en lymphoblastoid líneas celulares [14]. Se han realizado varios estudios en todo el genoma confirmar este número de copias variación [15 - 17], y poner de relieve que este tipo de gran escala genómica como un polimorfismo subestimados fuente de variación fenotípica. De hecho, hay pruebas de que la variable de gen CCL3L1 número de copias se asocia con la susceptibilidad a la infección por el VIH [18].

La hipótesis que hemos querido poner a prueba en este estudio fue que el número de copias de esta variación beta-defensin grupo (y, por implicación, DEFB4) está asociado con la enfermedad pulmonar en pacientes con FQ.

Resultados

La detección de beta-defensin grupo ejemplar número 355 de los pacientes con FQ, de los cuales 343 tenían datos clínicos completos. 159 pacientes fueron Δ F508 CFTR homocigosis, 141 fueron Δ F508 CFTR heterocigotos y 43 no habían Δ F508 mutaciones en ambos cromosomas. La edad media fue de 29,1 ± 8,9 años y 57% eran hombres. La figura 1 muestra la distribución de la beta-defensin número de copia fenotipos en la cohorte completa de pacientes con FQ. No hubo diferencias en el número de copias fenotipo distribución entre este colectivo y una muestra aleatoria de 167 individuos normales Reino Unido (EJHollox y JALArmour datos no publicados).

Cada análisis se realizó con toda la cohorte, y con el Δ F508 CFTR sólo homocigotos. No se encontraron correlaciones significativas entre los beta-defensin número de copias y cada parámetro medido clínica respiratoria (media actual y FEV 1, la media y la actual FVC). Los pacientes fueron arbitrariamente divididos en dos grupos sobre la base de número de copias: un grupo de pacientes con 3 y menos ejemplares de la β-defensin región (n = 77), y otro grupo con los pacientes que tienen 4 copias y más (n = 266 ). Las diferencias en la función pulmonar y marcadores inflamatorios estado se sometieron a pruebas de dos colas de Mann-Whitney U-pruebas, las diferencias en el estado de infección se sometieron a pruebas de χ 2 pruebas. Con este tamaño de la muestra, una diferencia de 9% en el FEV 1 mediana entre los dos grupos podría ser detectada con un 80% de potencia. No se observaron diferencias significativas entre los dos grupos se observaron.

También decidió determinar la efectividad de la dosis de microsatélites en el fortalecimiento de ratios, o posiblemente actúa como un sustituto de, MAPH la hora de determinar el número de copias. Se analizaron un subconjunto de las muestras con el número de copias de tres o cuatro por determinar el genotipo de un microsatélite en el intrón de DEFB4. La distribución alélica se muestra en la Figura 2. De las 114 muestras analizadas, 81 dieron resultados informativo, de los cuales 71 (88%) está de acuerdo con la determinación por MAPH. Las muestras que difieren típicamente redondeados MAPH dio resultados entre los dos valores (rango 3,42-3,54 o 4,5-4,54), y puede ser debido o bien a tasa de error o, tal vez más probable dado el pequeño intervalos de confianza de cada MAPH resultado (ver Métodos) Y su fiabilidad para otros loci [19 - 23], número de copia auténtica heterogeneidad entre las sondas a través de la repetición. Deberíamos ser capaces de distinguir entre una verdadera heterogeneidad y número de copia MAPH tasa de error mediante el análisis de la estimación de número de copias determinado por el DEFB4 sola sonda, que es de 735 pb el microsatélite en el intrón de DEFB4, y deberá informar sobre la misma, como el número de copias Microsatélite. El análisis de este número de copias estimación para los 10 discrepante resultados muestra que está de acuerdo con la estimación de microsatélites para 5 muestras. Por lo tanto, la tasa de error para distinguir 3 de 4 copias por MAPH es 5 / 81 = 6%. El resultado sugiere además que el número de copias DEFB4 heterogeneidad de la sonda (sonda F) tiene una frecuencia de alrededor del 6%. Además, el número de copias de la heterogeneidad MAPH H sonda se ha encontrado en varios bien caracterizado individual AND (EJHollox, JALArmour y JCKBarber, datos no publicados).

Discusión

Este es el primer estudio para poner a prueba la hipótesis, planteada en un trabajo previo [14], esa variable β-defensin genómica número de copia afecta a la función del sistema inmunológico, en este caso la infección pulmonar en una cohorte de pacientes susceptibles CF. A partir de los datos que hemos presentado, es evidente que, o bien β-defensin genómica número de copias no tiene efecto sobre la función pulmonar en los pacientes con FQ, o que cualquier efecto es demasiado pequeño para que pueda ser detectado utilizando este tamaño de la cohorte. No podemos descartar oficialmente un efecto de los polimorfismos de nucleótido único (SNP) dentro o en torno a la DEFB4 gen, dada la aparente falta de asociación entre el número de copias y los alelos de microsatélites alelos, y por inferencia polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Todo un estudio más a fondo sobre estos SNPs tendrá que considerar cuidadosamente el número de copias variación en este lugar, dado que una de nucleótido único cambio podría no sólo ser alélica entre paralogues pero difieren en el mismo cromosoma [16].

Podría haber dos razones por las β-defensin genómica número de copias no tiene efecto sobre la función pulmonar en pacientes con FQ. En primer lugar, a diferencia de los linfocitos cultivados en [14], es posible que no DEFB4 correlación entre el número de copias y la expresión de genes en el epitelio pulmonar. Lo ideal sería que una correlación positiva entre el número de copias y DEFB4 expresión DEFB4 niveles de inflamación en los pulmones no debe establecerse, pero realista, esos estudios son difíciles de realizar para los dos razones técnicas y éticas. Incluso si tal vínculo directo se demostró, el de pulmón en pacientes con fibrosis quística se caracteriza por una fuerte respuesta inflamatoria, y, dado el espectacular aumento de los niveles de péptido DEFB4 en tejidos inflamados [24], esto podría ocultar las diferencias en los niveles basales de expresión debido a la Variación genómica número de copias. En segundo lugar, las diferencias en la expresión DEFB4 están enmascarados por otros factores en el pulmón con FQ: por ejemplo, que elastolytic cathepsins desglose DEFB4 y DEFB103 están presentes en la fibrosis quística pulmonar, pero no en el pulmón sano [25]. Un informe reciente estudio de nucleótido único DEFB1 variación en el gen y la función pulmonar en los pacientes con FQ ha encontrado ningún vínculo, dar más pruebas en contra de beta-defensinas modificación de la función pulmonar en pacientes con fibrosis quística [26].

La clave para seguir avanzando es entender papel de los péptidos antimicrobianos en el pulmón inflamado, y exactamente de la forma en que contribuyen a la superficie de la vía aérea de defensa. Un reciente documento de DEFB4 demuestra que es más que un péptido antimicrobiano, y atrae a los neutrófilos a los sitios de la inflamación y la infección [27], por lo que es posible que su chemoattractant papel es tan importante en el pulmón como su papel de los antimicrobianos. DEFB4 ¿Cómo interactúa con otros componentes de la respuesta inflamatoria, y la innata y la respuesta inmune adaptativa, solo está empezando a ser entendida, y es evidente que todavía queda mucho por hacer antes de que entender estos procesos de la enfermedad pulmonar.

Métodos
Las muestras de paciente

Se extrajo el ADN de sangre periférica de pacientes con fibrosis quística utilizando el QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante como parte de un mayor estudio de genes modificadores. Las muestras fueron codificados y anónimos. Todos los participantes dieron su consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el Royal Brompton Hospital Harefield NHS Trust y el Comité de Ética.

Parámetros clínicos

Los datos clínicos se obtuvieron de las bases de datos clínicos, los pacientes del hospital toma nota de los informes de microbiología e informatizada. Volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV 1) y la capacidad vital forzada (FVC) se obtuvieron a partir de la función pulmonar anual de los registros de laboratorio, ha sido corregido en el sexo, la edad y la talla y se expresaron como porcentaje de predecir los valores normales. Valores anuales en el caso de ser disponible a partir de 1990-2002 y la tasa anual de disminución se ha calculado para todos los sujetos con valores de 2 o más después de la regresión lineal de todos los datos disponibles. Transcutánea saturación de oxígeno con el paciente para respirar aire ambiental se obtuvo en la visita anual, y un registro de la necesidad de oxígeno suplementario se hizo. Datos adicionales incluyen la presencia de la infección con P. Aeruginosa o B. Cepacia y más reciente total de leucocitos, proteína C reactiva y de las pruebas de función hepática.

Multiplex amplifiable sonda de hibridación (MAPH)

MAPH se llevó a cabo fundamentalmente a lo descrito previamente [28, 29], con la detección fluorescente de los productos de amplificación por un Applied Biosystems 3100 Genetic Analyzer. Una sonda de establecer entre ellos seis sondas de la cartografía a la beta-defensin se construyó el grupo (Tabla 1]. Los valores de estos seis sondas se normalizó el primero para carril intensidad contra subtelomeric sondas de control de la misma sonda de conjunto que no muestran variación copia número [20]. Estos ratios fueron calibrados con una media ponderada de control de los genomas de dos muestras en el mismo experimento, por lo general N8 (3 ejemplares) y N25 (7 copias) para obtener un valor para el número de ejemplares de cada una sonda por la célula diploide [14]. En dos casos, otros dos conocidos controles se utilizaron en duplicados de las muestras (European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) muestras BO0183 3 copias - AF0105 4 copias). De las 355 muestras analizadas, 205 fueron puestos a prueba por duplicado. Copiar número se calculó un promedio de los valores de cada sonda de la cartografía a esta región y presentar los datos como un valor medio de + / - 95% de intervalo de confianza (IC), y como un número entero redondeado, en representación de los más probable es que el número de copias. Inicialmente los seis sondas han sido utilizados en el cálculo, pero se constató que DEFB104 sonda fue inusualmente sensible a la cantidad de ADN y la eliminación de los valores de la sonda que, en muchos casos, la mejora de los intervalos de confianza. Todos los datos de este documento son sólo de cinco sondas. El IC del 95% para cada número de copia lectura en la cohorte completa varió de 0,05 a 1,2 con un valor medio de 0,24.

Análisis de microsatélites

Un microsatélite (EPEV-2) en el intrón de DEFB4, fue amplificado utilizando los siguientes primers (EPEV-2F 5'-GCACCAGAGACCTCATGTTTTC-3 'y EPEV-2R 5'-GTAACTTACAGTTGAAAACCAC-3'), con EPEV-2F 5 'fluorescently Que llevan la etiqueta con 6-FAM. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 0,2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1 mM MgCl 2, 75 mM Tris-HCl (pH 8,8 a 25 ° C), 20 mM (NH 4) 2 SO 4, el 0,01% (V / v) de Tween 20 en un volumen final de 10 μ l, con 5 pmol de cada primer, 10 ng de DNA genómico, 0,5 unidades de Taq ADN polimerasa (ABgene), seguido de la bicicleta durante 25 ciclos a 95 ° C 1 minuto, 60 ° C 1 minuto 72 ° C 1 minuto, y una última prórroga de incubación de 72 ° C, 20 minutos. 1,5 μ l del producto de PCR se mezcla con 10 μ l Hi-Di formamida y correr en una ABI 3100 utilizando condiciones estándar, con G500 ROX marcador. Alélica tamaños iban desde 240 pb a 272 pb, y las muestras se omitieron en el análisis de si tartamudean picos hecho de la interpretación de los picos de los alelo alelo longitudes o ambigua.

Contribuciones de los autores

EJH llevó a cabo el trabajo de laboratorio molecular, y participó en el diseño del estudio. JD y EJH llevado a cabo el análisis estadístico, y JD junto con JB participó en la recopilación de datos clínicos y método de diseño. UG, EA, y JALA participado en el diseño del estudio. Todos los autores ayudó a redactar el manuscrito, y se han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias Terence Baja para extracción de ADN, Shen Ning para ayudar en la recopilación de datos clínicos, y Jess Tyson para consejos útiles y comentarios. EJH con el apoyo de un Wellcome Trust Bioarqueología beca posdoctoral (concesión no. 071024).