Plant Methods, 2005; 1: 12-12 (más artículos en esta revista)

Acelerado de las aplicaciones: El potencial para la entrega directa de las proteínas y los ácidos nucleicos de las células vegetales para el descubrimiento de la función de genes

BioMed Central
Michael Roberts R (mrroberts@lancaster.ac.uk) [1]
[1] Departamento de Ciencias Biológicas, el Centro de Medio Ambiente de Lancaster, Lancaster University, Bailrigg, Lancaster, LA1 4YQ, UK

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Resumen

En los sistemas de los animales, existen varios métodos para la entrega directa de los ácidos nucleicos y las proteínas en las células para el análisis funcional. Hasta hace poco, estos métodos no han sido aplicados a los sistemas de la planta. Ahora, sin embargo, varios informes preliminares sugieren que tanto los ácidos nucleicos y proteínas también pueden ser entregados en las células vegetales por muy simple, la aplicación directa. Esto promete abrir el camino para el cribado de alto rendimiento para la función de genes en una amplia gama de especies de plantas.

Introducción

El desarrollo de los ensayos que permitan el cribado de alto rendimiento para la función biológica es un objetivo esencial si hemos de explotar al máximo la información de secuencia del genoma de plantas. Estas determinaciones podrían incluir la sobre expresión o silenciamiento de genes, o la determinación de la localización celular y subcelular de mRNAs y proteínas. La mayoría de las técnicas que existen actualmente para la realización de tales ensayos se basan en la producción de plantas transgénicas, o de vectores basados en ensayos de transformación transitoria. Tales métodos son necesariamente intensivo de mano de obra y tiempo, limitar la capacidad de la mayoría de los investigadores para llevar a cabo una auténtica "genómica funcional de los proyectos. Sin embargo, publicaciones recientes describen varios sistemas que permiten la entrega directa de los ácidos nucleicos y las proteínas en las células vegetales en un estado funcional, que proporciona el potencial para una rápida ensayos funcionales.

Discusión
Entrega de macromoléculas en las células animales

Durante muchos años, los investigadores utilizando células animales han utilizado los sistemas de síntesis de ácidos nucleicos para manipular la expresión de genes. Por ejemplo, el uso de oligodesoxinucleótidos antisentido para reprimir la expresión de genes se registró por primera vez más de un cuarto de siglo atrás [1]. Uno o dos varados moléculas de ADN y ARN puede ser introducido en células de mamíferos por simple aplicación directa a la cultura de los medios de comunicación, o la ayuda de diversos reactivos de transfección, lo que resulta en antisentido o ARNsi mediada por la supresión de la expresión génica. Una gama de diferentes ácidos nucleicos modificados que aportan diferentes características en términos de la estabilidad y la unión a secuencias objetivo ahora se utilizan, como morpholinos, bloqueado ácidos nucleicos, péptidos ácidos nucleicos, etc. [2]. En muchos casos, estas están siendo desarrollados como posibles agentes terapéuticos [2].

Más recientemente, las proteínas y otras macromoléculas se han entregado en las células, vinculándolos a los llamados dominios de la proteína de transducción (PTDs). Estos son secuencias de péptido corto que cuando se añade a la N-terminal de una proteína recombinante, o conjugado con otras moléculas, puede transportar directamente esas moléculas en células (revisado en [3]]. Las más conocidas se encuentran en el VIH-1 activador transcripcional Tat, y el factor de transcripción Drosophila, Antennapedia [3]. PTDs son generalmente breves, polybasic péptido secuencias, y artificiales polycationic péptidos, como polyarginine son también eficaces. Es importante destacar que la captación de moléculas etiquetados con estos péptidos no requiere receptores específicos, endocitosis o transporte activo. La capacidad de llevar a PTDs moléculas a través de membranas que se cree que es el resultado de las características físicas de sus interacciones con los lípidos bilayers, lo que sugiere que debería funcionar en cualquier sistema.

En el pasado, ha sido, en general, supone que la ejecución de tales sistemas no trabajan en células vegetales, debido a la presencia de la pared celular y la dificultad de la entrega a multicelulares, tejidos diferenciados. Sin embargo, el trabajo en varios laboratorios se ha demostrado recientemente que, de hecho, tanto las proteínas y los ácidos nucleicos pueden ser entregados de manera eficiente en células vegetales en una forma funcional.

Entrega de macromoléculas en células vegetales

Unnamalai et al. [4], creado doble varados RNA (dsRNA) in vitro, que se permitió entonces a los complejos con un 12mer polyarginine DPT a través de la interacción electrostática simple. Fluorescente etiquetado mostró absorción de los complejos de suspensión en células cultivadas de tabaco, que se caracteriza por la acumulación inicial en el núcleo y su posterior redistribución en todo el citoplasma dentro de las 24 h. DsRNAs dirigidas contra el GUS y NPTII genes marcadores y específicamente reducido sustancialmente a través de la expresión génica mediada por ARNsi post-transcripcional silenciamiento génico por lo menos 3 semanas después de 1 h de tratamiento de las células con dsRNA: DPT complejos. Una aún más simple, pero igualmente eficaz método de silenciamiento génico se demostró por Sun et al. [5]. Single-stranded oligonucleótidos de ADN fueron tomadas por las células de las hojas de cebada intacta cuando alimenta a través del pecíolo (Figura 1]. Fluorescente etiquetado de nuevo mostró acumulación primero en el núcleo, y luego en toda la celda. Un oligonucleótido antisentido, pero no un complemento de oligo sentido, la expresión de los genes silenciados a través de la degradación de ARNm [5]. El mecanismo involucrado parece ser la hibridación de la oligo antisentido para el ARNm para formar una ARN-ADN dúplex. ARN-ADN dúplex actuar como objetivos para ribonucleasas H (RNasa H), actividad que es transportada por todo el dúplex ARN.

Péptido de transducción de dominios también se han utilizado para entregar las proteínas en las células vegetales. Una vez más, la técnica empleada es extraordinariamente simple y eficaz. Chang et al., [6], las buenas prácticas agrarias proteínas recombinantes producidos en E. Coli, ya sea solo o etiquetados con la DPT Tat 9mer polyarginine o un péptido (R9). Cuando estas proteínas purificadas se aplicaron a las raíces de plantas de tomate o cebolla, rápidamente se convirtió en fluorescencia visible dentro de los núcleos y el citoplasma de las células tratadas con Tat-GFP y R9-GFP, pero no etiquetados-GFP. La adopción de las buenas prácticas agrarias DPT-etiquetados fue detectable en el plazo de 1 min de aplicación, y fue máximo en 5 min. Sorprendentemente, las células en toda la raíz mostraron fluorescencia - no sólo los que están en contacto con la solución de proteína. Al igual que en los sistemas de los animales, la absorción no se vio afectada por la baja temperatura o inhibidores de la endocitosis. GFP fluorescencia se mantuvo durante al menos 2 días después de una solicitud de 5 minutos, lo que sugiere que PTDs son capaces de entregar las proteínas funcionales que pueden permanecer durante un período considerable de tiempo.

Conclusión

La entrega directa de oligonucleótidos y de las proteínas de los tejidos de las plantas tiene una gama de excitantes aplicaciones para el descubrimiento de la función de genes (Cuadro 1]. Hasta el momento, las publicaciones examinadas anteriormente han incluido sólo limitados ejemplos de estas técnicas en la ejecución de los tejidos de las plantas. Una importante cuestión que hay que abordar en el futuro es si esas moléculas se pueden aplicar a las plantas de manera que permite la generación de información útil en una variedad de sistemas biológicos. Es obvio que la utilización de la suspensión cultivos celulares es limitado, y aunque a través de la aplicación cortar pecíolos pueden ser adecuadas para el corto plazo, bioquímica y molecular de la investigación, no permitiría a largo plazo, los estudios de desarrollo. Sin embargo, el poder de estos instrumentos presenta una oportunidad emocionante para un mayor desarrollo. Ellos tienen el potencial de permitir sistemática, de alto rendimiento estudios de la función de genes en una amplia gama de especies de plantas.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.